PROGRAMA: Ciências Farmacêuticas



PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA

AUTOR DO TRABALHO: ANA EMÍLIA BRUMATTI GALIARDI

TÍTULO DO TRABALHO: ESTUDO DO POTENCIAL TERAPÊUTICO DA MAITENINA EM CÉLULAS DE CÂNCER DE COLO UTERINO

CURSO: Mestrado

DATA DA DEFESA: 23/10/2015

ORIENTADOR: CHRISTIANE PIENNA SOARES

ÁREA DE CONHECIMENTO: Citologia e Biologia Celular

RESUMO: O câncer de colo de útero é um problema de saúde pública mundial, especialmente nos países em desenvolvimento, configurando a quarta neoplasia feminina mais comum no mundo. A infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) é o principal fator de risco para o desenvolvimento do referido câncer, estando presente em 90% dos casos de câncer de colo uterino na população mundial. Frente a busca por novos agentes quimioterapêuticos, os produtos naturais tem contríbuido intensamente para a identificação dessas substâncias e o desenvolvimento da terapêutica moderna. Maitenina, é um triterpeno quinonametídeo extraído das raízes da plana Maytenus ilicifolia, que possui algumas atividades biológicas já relatadas, como antifúngica, antiprotozoária e principalmente ação antitumoral. No momento não existem relatos na literatura relacionando a atividade da maitenina em células infectadas por HPV-16. O objetivo do presente estudo foi avaliar a citotoxicidade da maitenina em linhagem de carcinoma cervical infectada por HPV-16 (SiHa), não-infectada pelo vírus (C-33 A) e queratinócitos humanos imortalizados (HaCaT), bem como verificar a indução de apoptose e/ou necrose pelo ensaio de Hoechst e Iodeto de Propídeo e indução de apoptose pela atividade de caspase-3 nas três linhagens celulares, além de verificar alterações no ciclo celular das células tratadas com maitenina e o potencial de genotoxicidade e mutagenicidade, além de avaliar a proliferação das três linhagens. O ensaio de citotoxicidade foi realizado pelo método da sulforodamina B, e as três linhagens celulares foram tratadas durante 6, 12 ou 24 horas. Foi possível observar um efeito concentração e tempo resposta nas três linhagens analisadas. O CI50 foi de 3,26, 8,49 e 3,09 µM para as linhagens SiHa, C-33 A e HaCaT respectivamente, no tempo de tratamento de 24 horas. Com o intuito de avaliar o potencial efeito indutor de apoptose foi realizado o ensaio citomorfológico de marcação com Hoechst e Iodeto de Propídeo nos tempos de tratamento de 6 e 12 horas, e para as três linhagens celulares foi possível observar um efeito tempo-dependente. Além disso, foi observado para as três linhagem, um perfil de morte mista, ou seja, a morte celular ocorre por apoptose e necrose, com predominância de apoptose para as linhagens SiHa e C-33 A e os mesmos níveis de apoptose e necrose para a linhagem HaCaT. Ainda, a linhagem SiHa se mostrou mais sensível que as linhagens C-33 A e HaCaT no tempo de tratamento de 12 horas, demonstrando uma possível seletividade da maitenina. Para complementar este ensaio, foi realizado o ensaio de atividade de caspase-3, no entanto não houve indução da enzima caspase-3 para as linhagens SiHa e C-33 A em nenhum dos tempos testados sugerindo que a morte celular possa ocorrer independente de caspases, enquanto para a linhagem HaCaT foi detectada atividade de caspase-3 no tempo de tratamento de 6 horas. O ensaio de ciclo celular foi realizado nas três linhagens celulares tratadas por 12 horas, seguido de pós-tratamento de 24, 48 e 72 horas, e foi possível notar alterações no ciclo celular para as três linhagens com diminuição na população G1 e aumento das fases S e G2, ocorrendo parada de ciclo celular na fase G2/M para a linhagem SiHa, S e G2/M para linhagem C-33 A e S para a linhagem HaCaT. Através do ensaio de genotoxicidade, onde as linhagens SiHa, C-33 A e HaCaT foram tratadas durante 6 horas, foi possível observar que a maitenina causa danos à dupla fita de DNA para as três linhagens, o que provavelmente ocasionou a parada de ciclo celular. A linhagem C-33 A é a que apresentou maior taxa proliferativa, seguida pelas linhagens SiHa e HaCaT que proliferaram de maneira semelhante. Apesar do potencial genotóxico apresentado pela maitenina, ela não demonstrou mutagenicidade, sendo portanto, considerada segura para uso terapêutico. O dano a dupla fita de DNA, seguido de parada de ciclo celular e morte celular por apoptose e necrose parece explicar a redução da viabilidade celular causada pela maitenina nas três linhagens.

ABSTRACT: Cervical cancer is a worldwide public health problem, especially in developing countries, setting the fourth most common female cancer in the world. The infection by human papillomavirus (HPV) is the main risk factor for the development of this cancer, being present in 90% of cases of cervical cancer in the world population. Forward the search for new chemotherapeutic agents, natural products have strongly contributed to the identification of these substances and the development of modern therapeutics. Maytenin is a quinonemethide triterpene extracted from the roots of Maytenus ilicifolia plant, which has some biological activities previously reported as an antifungal, antiprotozoal and especially antitumor action. At the moment there are no reports in the literature relating the activity of maytenin in infected cells by HPV-16. The aim of this study was to evaluate the cytotoxicity of maytenin in cervical carcinoma line infected by HPV-16 (SiHa), non-infected by the virus (C-33 A) and by immortalized human keratinocytes (HaCaT), as well as verifying the induction of apoptosis and / or necrosis by Hoechst test and propidium iodide and the induction of apoptosis by caspase-3 activity in all three cell lines, in addition to check for changes in the cell cycle of treated cells with maytenin and the potential of genotoxicity and mutagenicity, and to evaluate the proliferation of the three cell lines. The cytotoxicity assay was performed by sulforhodamine B method and the three cell lines were treated during 6, 12 or 24 hours. It was possible to observe a concentration effect and response time in three lines analyzed. The IC50 was 3,26, 8,49 and 3,09 µM for SiHa, C-33 A and HaCaT lines respectively, in 24 hours treatment time. In order to evaluate the potential inductive effect of apoptosis it was performed a marking cytomorphological test with Hoechst and propidium iodide in 6 and 12 hours treatment times, and for the three cell lines it was possible to observe a time-dependent effect. Furthermore, it was observed for the three lines, a mixed death profile, that is, the cell death occurs by apoptosis and necrosis, especially by apoptosis for SiHa and C-33 A lines and the same levels of apoptosis and necrosis for HaCaT line. Still, SiHa line was revealed more sensitive than C-33 A and HaCaT lines in 12 hours treatment time, demonstrating a possible selectivity of maytenin. To complement this test it was performed the caspase-3 activity test, however there was no induction of caspase-3 enzyme for SiHa and C-33 A lines in any tested times suggesting that the cell death can occur independent of caspases, while for HaCaT line it was detected caspase-3 activity in 6 hours treatment time. The cell cycle test was performed in the three cell lines treated by 12 hours, followed by post-treatment of 24, 48 and 72 hours, and it was possible to observe changes in the cell cycle for the three lines with a decrease in G1 population and an increase in S and G2 phases, occurring a cell cycle arrest in the G2 / M phase for SiHa line, S and G2 / M phases for C-33 A line and S phase for HaCaT line. Through the genotoxicity test, where the SiHa, C-33 A and HaCaT lines were treated for 6 hours, it was observed that the maytenin causes damages to double-stranded DNA for the three lines, which probably caused the cell cycle arrest. The C-33 A line is the one that presented the highest proliferative rate, followed by SiHa and HaCaT lines that proliferated similarly. Despite the genotoxic potential presented by maytenin, it didn’t show mutagenicity, therefore it was considered safe for therapeutic use. The damage to double-stranded DNA, followed by cell cycle arrest and cell death by apoptosis and necrosis appears to explain the reduction of cell viability caused by maytenin in the three lines.

BANCA EXAMINADORA:

Membros Titulares:

CHRISTIANE PIENNA SOARES

RAQUEL ALVES DOS SANTOS

CLEVERTON ROBERTO DE ANDRADE

Membros Suplentes:

CARMEN LÚCIA BASSI

ANA MARISA FUSCO ALMEIDA

BIBLIOTECA DEPOSITÁRIA:

Biblioteca da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara-UNESP - Rodovia Araraquara-Jaú, km 1 – Araraquara-SP

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