1 - Theses
UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI
Lékařská fakulta
ÚSTAV PATOLOGICKÉ FYZIOLOGIE
[pic]
Funkce a poruchy proteinkináz v signalizačních kaskádách hormonů regulujících energetickou homeostázu buněk.
Mgr. Hana Poczatková
Školitel: RNDr. M. Rypka, CSc.
OLOMOUC 2009
Prohlašuji, že disertační práci jsem vypracovala samostatně pod odborným vedením svého školitele a vedoucího Ústavu patologické fyziologie Prof. MUDr. Jaroslava Veselého CSc. Všechna literatura citovaná v textu je uvedena na konci práce, v kapitole 10.
Zároveň bych chtěla poděkovat RNDr. M. Rypkovi, CSc. za odborné vedení výzkumné práce a především za pomoc při měření a vyhodnocování mRNA analýz. Ráda bych poděkovala rovněž Prof. MUDr. Jaroslavu Veselému CSc. za poskytnutí pracovního zázemí, cenných rad a připomínek v průběhu studia. Děkuji i svým kolegům na pracovišti za vstřícnost při řešení problémů a za vytvoření příjemného pracovního prostředí.
V Olomouci 12.srpna 2009
OBSAH
1. Seznam použitých zkratek………………………………………… 5
2. Úvod…………………………………………………………………………. 8
3. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY………………………… 11
1. Metabolický syndrom…………………………………………………… 11
2. Jaderné receptory…………………………………………………………. 13
3. Receptory aktivované proliferátory peroxisomů (PPAR)……………… 15
1. PPAR a oxidační stres……………………………………………… 17
2. Izoforma PPAR-α a její funkce……………………………………… 17
3. Uplatnění aktivátorů PPAR v léčbě diabetu a metabolického syndromu 19
4. Transport FA v hepatocytech: úloha L-FABP………………………… 20
1. L-FABP ovlivňuje aktivaci PPAR-α…………………………………… 20
5. Protein kináza C……………………………………...………………… 21
1. Struktura PKC………………………………………………………… 22
2. Aktivace PKC mastnými kyselinami………………………...………… 23
3. Aktivace PKC nasycenými a nenasycenými FFA…………………...… 25
4. Izomery mastných kyselin…………………………………………… 27
5. Aktivace PKC vysokými hladinami glukózy………………………… 27
6. Steroidní hormony: dehydroepiandrosteron (DHEA)…………………. 28
1. DHEA a diabetes………………………………………………………… 31
4. Cíl práce…………………………………………………………………….. 33
5. POUŽITÝ MATERIÁL A METODY…………………………………………. 34
2 Chemikálie a materiál……………………………………………………. 34
3 Složení roztoků a pufrů………………………………………………….. 34
4 Kultivace lidských hepatomových buněk HepG2……………………….. 35
1. Příprava komplexů mastných kyselin s BSA……………………………... 35
2. Inkubace buněk s FA…………………………………………………… 35
5 Vliv cykloheximidu na expresi mRNA…………………………………. 36
1. Účinek aktinomycinu D na stabilitu mRNA…………………………….. 36
3. Inkubace buněk s DHEA………………………………………………… 36
1. Vliv cykloheximidu na exprese mRNA…………………………………. 36
6 Účinek aktinomycinu D na stabilitu mRNA…………………………… 37
7 Inkubace buněk s PMA…………………………………………………. 37
8 Purifikace mRNA, syntéza cDNA a real time PCR……………………… 37
9 Příprava buněčných lyzátů……………………………………………….. 38
10 Buněčná frakcionace……………………………………………………... 38
2. Příprava cytosolové a membránové frakce………………………………. 38
3. Příprava cytosolové a jaderné frakce…………………………………….. 39
11 Stanovení viability buněk MTT testem…………………………………… 39
12 Elektroforéza a blotting…………………………………………………… 40
4. Imunodetekce………………………………………………………………40
13 Statistické hodnocení………………………………………………………40
6. výsledky…………………………………………………………………….. 41
1. Ověření metody pro stanovení translokace PKC-ε……………………… 42
2. Vliv kyseliny olejové v přítomnosti různých koncentrací glukózy………. 42
3. Stanovení mechanismu účinku kyseliny olejové…………………………. 45
4. Vliv dehydroepiandrosteronu (DHEA)…………………………………….49
5. Stanovení mechanismu účinku DHEA…………………………………….50
7. Diskuze……………………………………………………………………… 53
8. SOUHRN…………………………………………………………………………60
9. SUMMARY…………………………………………………………………….. 62
10. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY…………………………………………… 64
11. PŘEHLED PUBLIKACÍ AUTORA…………………………………………….. 74
1. Publikace…………………………………………………………………. 74
2. Abstrakta a posterová sdělení…………………………………………….. 74
3. Řešitelství v grantových projektech………………………………………. 75
1. Seznam použitých zkratek
ActD aktinomycin D
ACTH adrenokortikotropní hormon
AKT (PKB) protein kináza B
AP-1 „activator protein-1“
apoB apolipoprotein B
BSA „bovine serum albumin“
CAR „constitutive androstane receptor“
ChREBP „carbohydrate responsive element-binding protein“
CHX cykloheximid
CoA koenzym A
CyclA cyklofilin A
DMSO dimethylsulfoxid
DHEA dehydroepiandrosteron
DM2 diabetes 2. typu
DMEM „Dulbecco’s modified Eagle’s medium“
DTT dithiothreitol
EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová
EGTA kyselina ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)- N,N'-tetraoctová
EMEM „Eagle minimum essential medium“
ER estrogenový receptor
FA mastné kyseliny
FABP „fatty acid binding protein“
FBS „fetal bovine serum“
FFA volné mastné kyseliny
FOXO „forkhead box class O“
GAPDH glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza
GR glukokortikoidní receptor
GSK „glycogen synthase kinase“
HPRT hypoxanthin fosforibosyltransferáza
HRP „horseradish peroxidase“
HDL „high density lipoproteins“
HepG2 lidská hepatomová buněčná linie
HNF „hepatocyte nuclear factor“
HRE „hormone response elements“
HSD „hydroxysteroid dehydrogenase“
IKK-β „IκB kinase-β“
IL interleukin
IP3 „inositol 1,4,5-trisphosphate“
IR inzulínová rezistence
IRS „insulin receptor substrate“
JNK „c-Jun N-terminal kinase“
L-FABP „liver fatty acid-binding protein“
LCFA „long-chain fatty acid“
LDL „low density lipoproteins“
LXR „liver X receptor“
MAPK „mitogen-activated protein kinase“
MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide
NAFLD „nonalcoholic fatty liver disease“
NASH „nonalcoholic steatohepatitis“
NCoR „nuclear receptor corepressor“
NEFA neesterifikované mastné kyseliny
NFκB „nuclear transcripting factor κB“
OL kyselina olejová
PA kyselina palmitová
PADB „primary antibody dilution buffer“
PAGE polyakrylamidová gelová elektroforéza
PBS „phosphate buffered saline“
PEPCK „phosphoenolpyruvate carboxykinase“
PI3K „phosphatidylinositol 3-kinase“
PIP2 „phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate“
PKA protein kináza A
PKC protein kináza C
PLC „phospholipase C“
PMA forbol 12-myristát 13-acetát
PMSF fenylmethylsulfonyl fluorid
PPAR „peroxisome proliferator-activated receptors“
PPRE „peroxisomal proliferator response element“
PRC „PGC-1-related coactivator“
PXR „pregnan X receptor“
R-Smad receptorový Smad protein
RAR „retinoic acid receptor“
RXR „retinoid X receptor“
ROS „reactive oxygen species“
RT-PCR „reverse transcription-polymerase chain reaction“
SDS „sodium dodecyl sulphate“
SH2 Src-homologní doména
SMRT „silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptor“
SOD superoxid dismutáza
SREBP1c „sterol regulatory element-binding protein-1c“
ST kyselina stearová
stat „signal transducers and activators of transcription“
TBS „tris buffered saline“
TG triglyceridy
TGF „transforming growth factor“
TR „thyroid hormone receptor“
TNF-α „tumor necrosis factor α“
UCP „uncoupling protein“
VLDL „very low density lipoprotein“
2. Úvod
Rozšíření obezity, diabetu 2. typu (DM2) a metabolického syndromu je označováno za epidemii a v současné době ohrožuje zdraví lidí v celosvětovém měřítku. Světová zdravotnická organizace (WHO) odhaduje, že diabetes mellitus v současné době postihuje asi 180 miliónů lidí a předpokládá, že v roce 2030 bude tento počet více než zdvojnásoben. (WHO, Fact sheet N°312, 2006). Hlavní příčinou rozvoje metabolického syndromu je obezita a s ní spojená onemocnění, která jsou důležitými předpoklady pro hromadění dalších rizikových faktorů a poruch jako nadváha, dyslipidémie, hypertenze a inzulínová rezistence/DM2 (Berge et al. 2005).
Pro rozvoj diabetu je nejnebezpečnější centrální obezita, při níž se hromadí viscerální tuk. Viscerální tuk je metabolicky odlišný od tuku podkožního a rychlost lipolýzy je ve viscerální tukové tkáni zrychlena. Výsledkem zvýšené lipolýzy je posun směrem k ukládání mastných kyselin (FA) v neadipózních tkáních, tzn. v játrech, svalech, srdci a pankreatických β-buňkách (Obr.1). V játrech dále probíhá zvýšená glukoneogeneze a ve svalech pak snížené vychytávání glukózy z cirkulace zprostředkované inzulínem (Masopust 2005). Mezi nepříznivé metabolické důsledky zvýšené hladiny FA patří dyslipidémie a jaterní steatóza, poruchy metabolismu glukózy a vnímavosti k inzulínu v játrech a svalech, hyperinzulinémie v periferních tkáních a narušená funkce pankreatických (-buněk (Lewis et al. 2002). Zvýšené hladiny mastných kyselin v plazmě způsobují inzulínovou rezistenci (IR) v játrech a kosterním svalstvu a hrají tak klíčovou roli v rozvoji DM2 (Boden 1999; Boden and Laakso 2004).
Obr. 1. Vliv FA na zvýšenou tvorbu VLDL v játrech a na ztukovatění jater. Pro IR a DM2 jsou charakteristické poruchy esterifikace a reesterifikace FA v tukové tkáni a také oslabení inzulínem zprostředkované inhibice hormon-senzitivních lipáz (HSL). Zvýšený přísun FA z tukové tkáně a volné mastné kyseliny (FFA) uvolňované lipolýzou z VLDL částic a chylomikronů jsou odváděny z tukové tkáně k jiným orgánům, kde se projeví jejich škodlivé účinky. Zvýšený přísun FFA do jater zvyšuje zásoby FA v hepatocytech. Za podmínek jaterní hyperinzulinémie/inzulínové rezistence stoupá de novo lipogeneze (DNL) a esterifikace přijímaných FA je upřednostňována před jejich oxidací. Esterifikované FA jsou buď skladovány jako triglyceridy (TG) v cytosolu nebo směrovány k syntéze VLDL částic. Většina FA uvolněných z cytosolových zásob TG je reesterifikována a recyklována v cytosolu nebo vyloučena ve formě VLDL částic. Vysoká produkce VLDL částic zvyšuje v plazmě koncentraci VLDL, ale i střevních chylomikronů, protože si při eliminaci z plazmy vzájemně konkurují. Vysoké koncentrace těchto lipoproteinů v plazmě vedou k rychlejšímu uvolňování FFA a tvorbě zbytků při lipolýze lipoproteinovými lipázami (LPL). FFA a zbytky lipoproteinů se podílí na zvýšení zásob FA v hepatocytech, tím vyvolávají uzavřený kruh a dále podporují produkci VLDL (převzato z Lewis et al. 2002).
Na studiu mechanismu rozvoje DM2 a metabolického syndromu se podílí mnoho výzkumných týmů u nás i ve světě. Výsledky těchto prací poskytují prostor pro vývoj farmak používaných v léčbě diabetických pacientů. V posledních 15 letech byl nalezen nový typ regulace metabolických drah na transkripční úrovni, jehož klíčovým článkem je jaderný receptor PPAR (peroxisome proliferator-activated receptors) aktivovaný lipidy. Na rozdíl od steroidních receptorů, které vážou jeden ligand s vysokou afinitou, PPAR rozeznají řadu strukturálně odlišných molekul. Současná farmakologická léčba diabetu se opírá především o agonisty nukleárních receptorů PPAR, mezi které patří fibráty, thiazolidindiony a nově i glitazary. Jednou z molekul, na kterou jsme se v této práci zaměřili je izoforma PPAR-α, která je exprimována především v játrech a aktivuje geny účastnící se katabolismu lipidů. Mechanismus, kterým jsou přirozené ligandy PPAR i léčiva transportovány k těmto receptorům, není dosud zcela objasněn. Za vhodného kandidáta na tuto funkci je v současnosti považován transportér L-FABP (liver fatty acid-binding protein) (Wolfrum et al. 2001), který je také předmětem našeho výzkumu.
Důležitou funkcí jaderného receptoru PPAR je schopnost regulace genové exprese procesem transaktivace. Bylo zjištěno, že na regulaci této transaktivační aktivity se podílí signální dráha protein kináz C (PKC). PKC jsou signální přenašeče mnoha funkcí, mezi které patří snížení citlivosti receptorů, regulace transkripce, zprostředkování imunitních odpovědí a regulace buněčného růstu (Blanquart et al. 2004). Izoforma PKC-ε se účastní na rozvoji IR a bližší objasnění její role v tomto procesu je jedním z cílů této studie.
V současné době je na IR spojenou s obezitou nahlíženo jako na komplexní onemocnění. Bylo popsáno mnoho potenciálních molekul, systémů a signálních drah, které by mohly způsobovat IR, a tak pohled, kdy jediný faktor je primárně odpovědný za spojení mezi obezitou a IR je zjevně zjednodušený. Mnoho endokrinních, zánětlivých a neurálních drah je porušeno současně a mohou dále ovlivňovat jiné signální dráhy, které jsou aktivní v mnoha metabolických tkáních včetně tukové tkáně, jater a svalů, ale také v imunitním a nervovém systému. Důležitým úkolem současného i budoucího výzkumu je určit, které články poškozené v IR prostředí by bylo možno regulovat s příznivým metabolickým výsledkem, aniž by došlo ke spuštění jiných onemocnění (Qatanani a Lazar 2007).
3. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY
Z výsledků posledních let je zřejmé, že abnormálně zvýšené volné mastné kyseliny (FFA) v krevní plazmě se významně uplatňují v rozvoji plurimetabolického syndromu a spolu s tím i jiných civilizačních chorob. FFA mají důležitou patogenetickou úlohu nejen při vzniku kardiovaskulárních onemocnění (ischemické nemoci srdeční, trombózy, cévních zánětů, okluzní periferní arteriální nemoci, hypertenze, apod.), ale také diabetes mellitus typu 2 a nealkoholické steatózy jater.
Zvýšené FFA anebo triglyceridy (TG) představují nezávislý rizikový faktor uvedených onemocnění a jsou obvykle přítomny už v jejich počátečních fázích, ještě před jejich zřejmou klinickou manifestací.
1. Metabolický syndrom
Metabolický syndrom je definován jako skupina rizikových faktorů metabolického původu, která zahrnuje hypertenzi, atherogenní dyslipidémii, inzulínovou rezistenci (IR), prozánětlivý a prothrombocytní stav. Atherogenní dyslipidémie přechází v atherosklerózu, která je charakterizována progresivním usazováním lipidů na stěnách arterií, a to vede ke zvýšenému riziku rozvoje atherosklerotických kardiovaskulárních onemocnění. Za průvodní jevy tohoto onemocnění je považována zvýšená hladina TG a apolipiproteinu B (apoB) v séru, zvýšená hladina LDL částic a snížená koncentrace HDL cholesterolu. Zvýšené množství TG v séru je také nazýváno hypertriglyceridémie, která je definována jako hladina TG v plazmě překračující 150 mg/dl (Grundy et al. 2004).
V roce 2001, National Cholesterol Education Program (NCEP) Adult Treatment Panel III (ATP III) definovala diagnózu metabolického syndromu při výskytu 3 a více z následujících diagnostických kritérií: obvod pasu ≥102 cm u mužů a ≥88 cm u žen indikující centrální obezitu, zvýšené TG ((≥ 1.69 mmol/l), snížený HDL cholesterol (< 1.04 mmol/l pro muže, < 1.29 mmol/l pro ženy), zvýšený krevní tlak (≥ 130/85 mm Hg) nebo pacient léčený na hypertenzi a hladina glukózy na lačno ≥ 5.6 mmol/l) (shrnuto v Grundy et al. 2005).
Je všeobecně uznáváno, že rizikové faktory metabolického syndromu se vyskytují spolu, ale není zcela jasné jak jsou propojeny (Reaven GM 1988). Obezita podmiňuje rozvoj IR, protože při ní dochází k uvolňování neesterifikovaných mastných kyselin (NEFA) do oběhu (Heptulla et al. 2001). Zmnožení viscerálního tuku však může být přítomné i bez obezity. Nejnebezpečnější je uložení tuku v dutině břišní, tedy tzv. abdominální neboli viscerální obezita. Viscerální tuk je zvláště citlivý k lipolýze. Velké množství uvolněných FFA z viscerálního tuku směřuje přímo do jater, kde jsou zdrojem tvorby TG a glukoneogeneze. Nadbytek FFA v játrech pak přispívá ke vzniku dyslipidemie a ke vzniku poruchy glukózové tolerance. Jaterní TG jsou tvořeny mastnými kyselinami buď z plazmy anebo syntézou de novo. Před jejich uvolněním do oběhu jsou TG spolu s nosným proteinem apoB100 sbaleny do lipoproteinových částic VLDL. Za normálních okolností inzulín inhibuje produkci a uvolnění VLDL částic z jater, ale u pacientů s IR nedochází k inhibici inzulínem, což částečně vysvětluje zvýšené hladiny VLDL u pacientů s diabetem 2.typu (DM2) a s metabolickým syndromem (Obr. 2) (shrnuto v Koo and Montminy 2006).
[pic]
Obr. 2: Patofyziologie metabolického syndromu. Nadbytek tukové tkáně uvolňuje zvýšené množství FA. V játrech FA zvyšují produkci glukózy, TG a sekreci VLDL. S tím jsou spojeny další anomálie jako je pokles HDL a vzestup LDL částic. Ve svalech FA inhibují absorpci glukózy zprostředkovanou inzulínem a tím snižují citlivost svalových buněk k inzulínu. To dále vede ke zmenšené přeměně glukózy na glykogen a k dalšímu hromadění tuků v TG. Zvýšené množství glukózy, a do jisté míry i FA v oběhu zvyšuje sekreci inzulínu a má za následek rozvoj hyperinzulinémie. Hyperinzulinémie může vést ke zvýšené reabsorpci sodíku, k nárůstu aktivity sympatiku a také přispívat k rozvoji hypertenze (převzato z článku Eckel et al. 2005).
Hlavní pojítko mezi obezitou a IR/DM2 představují mastné kyseliny (FA). FA vedou k akumulaci triglyceridů v myocytech s aktivací proteinkinázy C (PKC), která ovlivňuje signální cestu inzulínu v inzulínových receptorech. V játrech FA inhibují inzulínem stimulovanou produkci oxidu dusnatého, a tím ovlivňují endoteliální funkci a produkci kyslíkových radikálů. Nedávno bylo prokázáno, že FA aktivují cestou cytokinů celou řadu zánětlivých procesů. Zvýšené hladiny FA tedy způsobují IR na úrovni svalu, jater, endoteliálních buněk a aktivují zánětlivý proces.
IR způsobuje nedostatečný přísun glukózy do buněk tukové a svalové tkáně, sníženou utilizaci glukózy (glykolýza), zvýšenou glykogenolýzu a glukoneogenezi v játrech a vede tak k rozvoji hyperglykémie. Nadprodukce glukózy v játrech je způsobena nadbytkem glukagonu vzhledem k množství funkčního inzulínu. Mechanismy spojující obezitu s IR a diabetem 2. typu nebyly dosud zcela objasněny, přestože je jejich studiu věnován intenzivní výzkum (Randle et al. 1963; Shulman 2000; Petersen and Shulman 2002; Qatanani a Lazar 2007; Savage et al. 2007; Chahal et al. 2008).
Metabolický syndrom je hlavním rizikovým faktorem pro rozvoj nealkoholického ztučnění jater (NAFLD). NAFLD je klinickopatologický syndrom, u kterého dochází k poškození jater na úrovních steatózy až nealkoholické formy steatohepatitidy (NASH), které se může dále rozvinout k fibróze až cirhóze jater. Volné mastné kyseliny se účastní patogeneze a průběhu NASH. Bylo prokázáno, že nahromadění volných mastných kyselin v hepatocytech vede ke zvýšené náchylnosti k poškození endotoxiny a TNF-α, což vyvolává oxidační stres a peroxidaci lipidů. Peroxidace lipidů se vyskytuje u akutní i chronické steatózy a je v játrech spojována s aktivací hvězdicových buněk a syntézou kolagenu I. typu, což může způsobit fibrózu a apoptózu. TNF-α je důležitým mediátorem IR u lidí i hlodavců. Mechanismus, kterým mastné kyseliny vyvolávají produkci TNF-α zahrnuje permeabilizaci lysosomů a následné uvolnění proteáz. Ty spustí kaskádu, která vede k aktivaci NFκB a další expresi TNF-α. TNF-α pak přispívá k IR tím, že aktivuje IKK-β, JNK a dále destabilizuje lysosomy, čímž dále zvyšuje poškození jater (Feldstein et al. 2004 a citace tam uvedené).
Intenzivní zájem o výzkum látek vhodných k léčbě metabolického syndromu je v posledních letech zaměřen na jaderné receptory, jako jsou PPAR (receptory aktivované proliferátory peroxisomů). PPAR působí jako regulátory energetické homeostázy a jejich přirozenými ligandy jsou FFA. Tyto receptory jsou rozhodujícím faktorem při diferenciaci adipocytů a cílovým místem působení antidiabetických léčiv (Šedová a Šeda 2006).
2. Jaderné receptory
Členové superrodiny jaderných receptorů jsou transkripčními faktory, které přenášejí fyziologické podněty k regulačním oblastem cílových genů. V současné době se výzkum mnoha týmů zaměřuje na molekulární spojení mezi vnějším podnětem, signální cestou a jadernými receptory, které regulují transkripci. Regulační funkce jaderných receptorů je závislá na množství endogenního ligandu a dostupnosti partnerů pro tvorbu heterodimerů. Mnoho biologických dějů je řízeno na úrovni transkripce navázáním transkripčních faktorů do regulační oblasti cílových genů zvané responzivní elementy. Regulace transkripce jadernými receptory je zprostředkována navázáním koaktivátorů anebo korepresorů v kombinaci s dalšími modifikacemi jako jsou fosforylace, methylace, acetylace. Aby transkripční faktor pronikl k cílové DNA v chromatinu je třeba jeho sbalenou strukturu částečně rozplést. Navázání ligandu vede k vypuzení korepresorového komplexu a k současnému navázání koaktivátorového komplexu. Koaktivátorové komplexy využijí své histon acetyltransferázové aktivity k rozbalení struktury chromatinu, a tím aktivují transkripci cílového genu (Finck and Kelly 2006; Kumar et al. 2005; Smith and O’Malley 2004).
Jaderné receptory mohou regulovat genovou expresi čtyřmi různými způsoby (Obr. 3). V nepřítomnosti ligandů interagují s komplexy korepresorů, které obsahují jaderné receptorové korepresory (například NCoR anebo SMRT), a tím aktivně potlačují transkripci. Tento proces se nazývá „aktivní represe“. V přítomnosti ligandu se PPAR vážou do svých responzivních elementů peroxisomálních proliferátorů (PPRE) v promotorové oblasti cílových genů, čímž zvýší genovou transkripci. Pro přechod z aktivní represe k aktivaci transkripce je nutná disociace korepresorů a navázání koaktivátorů. Mnoho koaktivátorových proteinů je součástí multiproteinových komplexů, které se vyznačují enzymatickými účinky jako je histon acetyltransferázová aktivita, histon methyltransferázová aktivita, schopnost remodelovat nukleosom a další. Tento proces se nazývá „transaktivace“. Třetí mechanismus souvisí s fyzikální interakcí mezi jaderným receptorem s navázaným ligandem a jinými transkripčními faktory (NFκB, AP-1) v jejich responsivních elementech, čímž inhibuje jejich aktivaci transkripce. Tento proces je známý jako „transreprese“ a předpokládá se, že je základem protizánětlivého působení jaderných receptorů jako jsou glukokortikoidní receptor (GR), PPAR a LXR. Naopak, jaderné receptory mohou v procesu zvaném koaktivace působit jako koaktivátory jiných transkripčních faktorů (shrnuto v Li and Glass 2004).
[pic]
Obr. 3: Jaderné receptory mohou jak aktivovat tak inhibovat expresi genů. (A) Transaktivace: Primární působení jaderných receptorů je aktivace transkripce závislá na ligandu, ke které dochází po navázání jaderných receptorů do specifických responzivních elementů v promotorové oblasti cílových genů. (C) Koaktivace: Jaderné receptory také působí jako koaktivátory jiných transkripčních faktorů a tím se podílí na aktivaci genů. Zde je znázorněn případ glukokortikoidního receptoru (GR), který aktivuje stat-5 responzivní geny. (B) Aktivní represe: Podskupina jaderných receptorů, které heterodimerizují s retinoidním X receptorem (RXR), včetně receptoru pro tyroidní hormon (TR) a receptoru kyseliny retinové (RAR) se mohou v nepřítomnosti ligandu navázat do jejich HRE a aktivně blokovat cílové geny. (D) Transreprese: Některé jaderné receptory (například GR) mohou v přítomnosti ligandů inhibovat aktivitu jiných tříd transkripčních faktorů (například AP-1) (převzato z článku Glass and Rosenfeld 2000).
3. Receptory aktivované proliferátory peroxisomů (PPAR)
PPAR jsou jaderné receptory, které patří do rodiny transkripčních faktorů aktivovaných peroxisomálními proliferátory, mastnými kyselinami a jimi podobnými ligandy. Peroxisomální proliferátory jsou skupinou strukturálně odlišných sloučenin, které podněcují proliferaci jaterních peroxisomů a ve farmakologických dávkách stimulují aktivitu PPAR (Gottlicher et al. 1992). V peroxisomech probíhá oxidace delších mastných kyselin, syntéza cholesterolu, žlučových kyselin a složitějších lipidů.
PPAR řídí expresi mnoha cílových genů regulujících metabolismus sacharidů, metabolismus tuků a zánětlivé procesy v mnoha tkáních. Mechanismus, kterým PPAR reguluje transkripci, zahrnuje tvorbu heterodimerů s retinoidním X receptorem (RXR). Komplexy PPAR/RXR se pak vážou do svých specifických PPRE v promotorové oblasti cílových genů.
Je zdokumentováno v mnoha pracích, že agonisté PPAR nejen řídí expresi genů, ale také působí na biochemické markery v lidské plazmě. Například rosiglitazon, který aktivuje PPAR-γ, významně snižuje koncentraci glukózy, C peptidu, inzulínu a neesterifikovaných mastných kyselin měřených na lačno a postprandiálně u pacientů s DM2. Aktivátory PPAR-α, fenofibráty, zase snižují riziko rozvoje koronárních onemocnění tím, že snižují hladinu triglyceridů a naopak zvyšují hladinu HDL cholesterolu. Také snižují koncentraci C-reaktivního proteinu, který je významným markerem zánětu, tkáňového poškození a infekce (Despres et al. 2004; Ikewaki et al. 2004; Raskin et al. 2000).
Rozpoznáváme tři základní zástupce: PPAR-α, -β/δ a –γ. PPAR-α je exprimován především v játrech, ale i v mnoha dalších metabolicky aktivních tkáních včetně ledvin, srdce, kosterních svalů, hnědého tuku a jiných (Auboeuf et al. 1997; Braissant et al. 1996). U lidí bylo nalezeno několik různých mRNA pro PPAR-γ označované jako PPAR-γ1 - γ4. PPAR-γ1 a PPAR-γ2 se liší pouze tím, že izoforma PPAR-γ2 má navíc 30 aminokyselin na svém N-konci díky využití jiného promotoru v rámci stejného genu a následujícím alternativním sestřihem. mRNA ostatních izoforem se liší pouze v nepřekládané oblasti na 5‘- konci a mají společný translační produkt PPAR-γ1. Jednotlivé izoformy PPAR-γ vykazují specifickou tkáňovou distribuci. PPAR-γ2 je exprimován primárně v adipozní tkáni, zatímco PPAR-γ1 je exprimován v široké škále tkání včetně srdce, kosterních svalů, tenkého a tlustého střeva, ledvin, žlučníku a sleziny. PPAR-γ3 byl zatím nalezen pouze v tlustém střevě a makrofázích (shrnuto v Francis et al. 2003; Lazar 2002). Třetí, a jako poslední identifikovaná, izoforma PPAR-β/δ je hojně exprimována v lidských orgánech s výjimkou její nízké exprese v játrech a předpokládá se, že působí jako senzor lipidů (Kliewer et al. 1994; Chawla et al. 2003). Její uplatnění by mohlo být v prevenci a léčbě atherosklerózy (Li and Palinski 2006).
PPAR-α aktivuje geny účastnící se katabolismu lipidů a to především peroxisomální a mitochondriální β-oxidace (Peters et al. 1997). Naproti tomu PPAR-γ a PPAR-β/δ hrají významnou úlohu v adipogenezi stejně jako při diferenciaci a proliferaci adipocytů (Bhatia a Viswanathan 2006), a na rozdíl od PPAR-α nereagují na přítomnost proliferátorů peroxisomů (Ferré 2004).
1. PPAR a oxidační stres
Předpokládá se, že transkripční faktory PPAR jsou schopné ovlivňovat ukládání i spalování tuků a zároveň redukovat oxidační stres. Ukládání tuků je totiž na jedné straně nezbytné pro přežití a odolnost vůči zranění nebo infekci, ale na druhé straně zvyšuje oxidační stres a může zkrátit délku života. Cesty, kterými PPAR mohou snižovat oxidační stres, zahrnují řízení exprese mitochondriálního rozpřažujícího proteinu (UCP), optimalizaci aktivity faktoru FOXO (forkhead box class O) a potlačení NFκB na úrovni transkripce (Nunn et al. 2007). Aktivace PPAR zvyšuje expresi mitochondriálních UCP – rodiny homologních proteinů, které rozpojují protonový gradient v mitochondriích a tím snižují produkci reaktivních kyslíkových intermediátů (ROS) (Ježek et al. 2004). Transkripční faktory FOXO jsou negativně regulovány inzulínem a spojují energetický metabolismus s odolností proti oxidačnímu stresu (zvyšují množství superoxid dismutázy (SOD)), dále regulují buněčný cyklus, opravu DNA a zajišťují přežití během hladovění. Během hladovění je zvýšená aktivita PPAR-α spojena se sníženou produkcí inzulínu, a tím se zvyšuje exprese FOXO, který zvyšuje odolnost proti oxidačnímu stresu. S věkem se aktivita PPAR ovšem snižuje (Sung et al. 2004), zatímco aktivita NFκB stoupá (Spencer et al. 1997). NFκB vytváří oxidační stres v obraně proti zranění nebo infekci. Tvorba ROS zde slouží jednak jako signál a jednak jako obranný mechanismus (Nunn et al. 2007). PPAR tedy mohou hrát důležitou roli v regulaci aktivity NFκB a zánětlivých procesů spojených s věkem (Poynter and Daynes 1998).
2. Izoforma PPAR-α a její funkce
V naší práci jsme se zaměřili na izoformu PPAR-α, která je klíčovým regulátorem homeostázy lipidů v hepatocytech. PPAR-α je cílovým bodem pro FA, hypolipidemické léky a jiné hypolipidemické proliferátory; je například receptorem fibrátů, syntetických hypolipidemických léčiv, které snižují koncentraci TG a naopak zvyšují hladinu HDL cholesterolu (Kliewer et al. 2001). PPAR-α aktivuje transkripci široké škály genů, které jsou součástí metabolismu lipidů jako jsou fatty acyl CoA oxidáza, cytochrom P450 4A (CYP4A), karnitin palmitoyltransferáza I a další. Exprese PPAR-α v játrech je pozitivně regulována glukokortikoidy, n-3 polynenasycenými mastnými kyselinami a hladověním, zatímco inzulín snižuje expresi PPAR-α (Hsu and Huang 2007 a citace tam uvedené). PPAR-α je také nezbytný pro expresi genů vyvolanou hormonem DHEA. DHEA ovšem není, na rozdíl od ostatních peroxisomálních proliferátorů, ligandem PPAR-α, ani ho v in vitro testech (transfekční/transaktivační analýzy) není schopen aktivovat přímo. To naznačuje, že pro aktivaci PPAR v játrech je nutný buď specifický buněčný transport, jiný metabolismus steroidů nebo přítomnost dalších proteinů a jaderných faktorů (např.RXR nebo HNF-4), které regulují aktivitu PPAR. Mechanismus, kterým DHEA aktivuje PPAR-α, není dosud objasněn (Krey et al. 1997; Peters et al. 1996; Waxman 1996; Ripp et al. 2002; Ripp et al. 2003).
Nedávno bylo prokázáno, že exprese proteinu PPAR-α je také přímo a pozitivně regulována vlastními ligandy. Předpokládá se tedy, že gen PPAR-α je tak jedním z cílových genů svého vlastního produktu, transkripčního faktoru PPAR-α. Indukce genů PPAR-α svými ligandy je navíc druhově závislá. Kyselina linolová byla například účinnější v lidských hepatomových buňkách HepG2 než v potkaních, zatímco klofibrát (derivát kyseliny fibrové) se choval opačně (Akbiyik et al. 2004). Aktivita PPAR-α může být také regulována na úrovni posttranslačních modifikací. PPAR-α je například fosforylován signálními dráhami MAPK a PKA (Blanquart et al. 2004).
Na rozdíl od steroidních receptorů, které vážou své ligandy s vysokou afinitou (vazebná konstanta je v rozmezí nanomolů), přirozené ligandy PPAR se vážou s relativně nízkou afinitou (vazebná konstanta je v rozmezí mikromolů) (Kliewer et al. 1997). Izomery PPAR vážou různé typy mastných kyselin s rozdílnou afinitou. Nasycené mastné kyseliny se vážou na PPAR-α a s menší afinitou na PPAR-β/δ, ale účinně se nevážou na PPAR-γ. Nasycené mastné kyseliny s řetězcem o délce 20 a více uhlíků neinteragují s žádnou izoformou PPAR. Nenasycené mastné kyseliny se zato vážou na všechny tři izoformy PPAR podle účinnosti v tomto pořadí: PPAR-γ > PPAR-β/δ > PPAR-α. PPAR-α je v tomto směru nevybíravý, protože polynenasycené kyseliny pro něj nejsou lepšími ligandy než nasycené nebo mononenasycené mastné kyseliny o stejném počtu uhlíků (Xu et al. 1999).
PPAR-α reguluje příjem buňky a β-oxidaci mastných kyselin. Vyvolává expresi přenašečů mastných kyselin a enzymů, které se podílí na katabolismu mastných kyselin jako lipoproteinová lipáza, acetyl-CoA syntháza mastných kyselin, acyl-CoA oxidáza a karnitin palmitoyltransferáza I (shnuto v Moller and Berger 2003). Oxidace mastných kyselin, které jsou nasycené, nevětvené a mají dlouhý uhlíkový řetězec, probíhá především v peroxisomech. Tam se také nachází většina oxidáz produkujících peroxid vodíku. Nejvýznamnějším zdrojem reaktivních kyslíkových částic jsou právě peroxisomální oxidázy a mikrosomální enzymy cytochromu P450, které jsou při fyziologických podmínkách odpovědné za produkci 80% peroxidu vodíku v játrech. Peroxid vodíku a příbuzné oxidanty se pravděpodobně podílejí na poškození jater a hepatocelulární karcinogenezi. PPAR-α je indukován proliferátory peroxisomů a zvyšuje β-oxidaci mastných kyselin v mitochondriích i v peroxisomech a také ω-oxidaci mastných kyselin v mikrosomech a hraje pravděpodobně klíčovou roli v komunikaci mezi těmito oxidačními systémy (Akbiyik et al. 2004 a citace tam uvedené).
3. Uplatnění aktivátorů PPAR v léčbě diabetu a metabolického syndromu
Kromě pozitivních účinků při léčbě dyslipidémie mají ligandy PPAR-α antidiabetické účinky. Mechanismus těchto účinků pravděpodobně zahrnuje snížení množství lipidů v jaterní a svalové tkáni. Těmito hypolipidemickými účinky se vyznačují fibráty a syntetičtí agonisté PPAR-α, ale jejich účinky na IR jsou rozporuplné. Agonisté PPAR-γ, thiazolidindiony (rosiglitazon a pioglitazon), zvyšují na rozdíl od agonistů PPAR-α citlivost k inzulínu, ovšem bez dalšího zásadního vlivu na hladiny lipidů. V současné době je věnována pozornost výzkumu duálních agonistů PPAR-α/γ, tzv. glitazarů, které by mohly působit současně jako antidiabetika i hypolipidemika (Obr. 4) (Fievet et al. 2006; Šedová a Šeda 2006). Aktivace PPAR-α také vyvolává protizánětlivé účinky v mnoha typech buněk, např. inhibuje aktivaci dráhy NFκB v buňkách hladkého svalu aorty anebo snižuje koncentraci zánětlivého cytokinu interleukin 6 (IL-6) v plazmě u lidí léčených fibráty (shrnuto v Moller and Berger 2003).
[pic]
Obr. 4. Koncept duálního agonismu PPAR-α/γ (převzato z článku Šedová a Šeda 2006).
3. Transport FA v hepatocytech: úloha L-FABP
Téměř všechny savčí buňky jsou schopny získávat FA ze svého extracellulárního prostředí a využívat je ve svých metabolických procesech. FA jsou vedle glukózy hlavním zdrojem aerobně produkované energie v játrech a svalech a jsou dodávány orgánům ve formě komplexu s albuminem anebo ve formě TG, které jsou součástí chylomikronů a částic VLDL. FA jsou špatně rozpustné ve vodném prostředí, proto využívají intracelulárních proteinů, které usnadňují jejich pohyb cytoplazmou (Veerkamp 1995; Luxon 1996). FABP zvyšuje solubilitu mastných kyselin a usnadňuje transport mastných kyselin z plazmatické membrány k místům oxidace FA (mitochondrie, peroxisomy), esterifikace FA na TG a fosfolipidy, nebo do jádra, kde mají regulační funkci (Glatz and van der Vusse 1996; Jump et al. 2005). Předpokládaným transportním proteinem v hepatocytech, kde jsou exprimovány všechny izoformy receptoru PPAR, je jaterní protein vázající mastné kyseliny L-FABP (Glatz and van der Vusse 1996; Wolfrum et al. 2001).
Rodina FABP tvoří skupinu nejméně devíti rozdílných typů proteinů. Jsou to 14-15 kDa proteiny, které jsou pojmenovány podle prvních tkání, ve kterých byly izolovány nebo identifikovány. Některé tkáně obsahují více typů FABP. Jaterní cytoplazmatický protein L-FABP je exprimován v játrech, ale i v žaludku, slinivce, střevech a ledvinách (shrnuto v Boord et al. 2002). FABP obecně vážou 1 mol ligandu na 1 mol proteinu. Vyjímkou je L-FABP které může vázat až dva ligandy, v závislosti na jejich velikosti. Například hem a žlučové soli váže L-FABP v poměru 1:1, zatímco mastné kyseliny, bilirubin a eikosanoidy váže v poměru 2:1. Vazné místo pro ligandy je u L-FABP více hydrofobní a navázaný ligand je více pohybově omezen než u jiných forem FABP. Díky těmto rozdílům je rychlost výměny FA nižší u L-FABP než u jiných typů (shrnuto v Glatz and van der Vusse 1996).
1. L-FABP ovlivňuje aktivaci PPAR-α
L-FABP řídí vstup agonistů PPAR-α do jádra, a tím nepřímo (prostřednictvím PPAR-α) reguluje genovou expresi (Obr. 5). Receptor PPAR-α má vysokou afinitu k peroxisomálním proliferátorům (v rozsahu 10 nmol), ale nízkou k FA (100 nmol). Na rozdíl od toho, L-FABP váže FA s vysokou afinitou v prvním vazném místě (10 nmol) a nízkou afinitou v druhém vazném místě (100-500 nmol). Peroxisomální proliferátory váže s afinitou pouze kolem 1 mmol. Proto je PPAR-α schopna vytěsnit peroxisomální proliferátory z obou vazných míst L-FABP, zatímco FA jen z druhého vazného místa s nižší afinitou (Wolfrum et al. 2001). Peroxisomální proliferátory, například fibráty, tak aktivují PPAR-α snadněji než FA.
[pic]
Obr. 5. L-FABP může ovlivnit expresi genů nepřímo, prostřednictvím PPAR (převzato z Wolfrum et al. 2001).
Změny v aktivitě metabolismu tuků se odrážejí na množství FABP ve tkáních a L-FABP je v mnoha případech citlivější na tyto změny než jiné typy FABP. Například vysoký obsah tuků v potravě značně zvyšuje koncentraci cytoplazmatického FABP v játrech, střevech, srdci a ledvinách. Také působení pohlavních steroidních hormonů velmi ovlivňuje množství L-FABP v játrech zvířat. FABP se také podílí na regulaci syntézy lipofilních sloučenin (FA a v případě L-FABP také eikosanoidy, atd.), a to nejpravděpodobněji tím, že urychluje odvádění produktu, a tak zabraňuje zpětnovazebné inhibici (shrnuto v Glatz and van der Vusse 1996).
V poslední době se pohled na L-FABP zaměřuje na jeho schopnost transportovat různé sloučeniny do jádra k PPAR. Například buňky, které po transfekci exprimují L-FABP se zdají být citlivější k mitogenetickým vlivům peroxisomálních proliferátorů. Genový promotor L-FABP obsahuje PPRE, ale hladina jeho mRNA je také zvyšována FA, dikarboxylovými kyselinami a kyselinou retinovou (shrnuto v Boord et al. 2002).
4. Protein kináza C
Výsledky z mnoha studií ukazují, že abnormálně zvýšené FA v krevní plazmě se významně uplatňují v rozvoji plurimetabolického syndromu a spolu s tím i jiných civilizačních chorob. Donedávna se negativní účinky FA na působení inzulínu vysvětlovaly mechanismem substrátové kompetice, jak ho formulovali Randle se spolupracovníky (současný přehled viz Randle, 1998). Dnes se má za to, že FA též mohou cíleně zasahovat určité články signální kaskády inzulínu. Za prostředníka tohoto působení FA je označována zejména protein kináza C (PKC).
1. Struktura PKC
PKC jsou multigenní rodinou rozdílných enzymových izoforem, které se liší svými katalytickými a regulačními vlastnostmi. Všechny PKC jsou tvořeny jedním polypeptidovým řetězcem, který se skládá ze dvou domén: N-terminální regulační domény a C-terminální katalytické domény. Podle rozdílných vlastností regulačních domén se PKC dělí na tři skupiny: konvenční izoformy (cPKC), mezi které patří PKC-α, -β1, -β2 a -γ, nové izoformy (nPKC) zahrnující PKC-δ, -ε, -η a -θ a atypické izoformy (aPKC) reprezentované PKC-ζ a -ι/λ (PKC-λ je myší homolog lidské PKC-ι ). V cytoplazmě fosforylují postranní řetězce serinu a treoninu četných proteinů, a tím se podílejí na odpovědi buněk na velké množství počátečních stimulů (Parekh et al. 2000; Parker a Murray-Rust 2004; Poczatková et al. 2005). Za určitých patologických podmínek mohou vystupovat jako společný mediátor poruch, které provázejí závažná metabolická onemocnění (Brown a McIntosh, 2003; Lam et al. 2003). Klasický obraz aktivace a translokace PKC předpokládá hydrolýzu fosfolipidů plazmatické membrány, k níž dojde na základě vnějšího (např. hormonálního) stimulu, jakým může být inzulín. Vnější signál se realizuje navázáním agonisty na povrchový receptor. Receptor aktivuje specifickou fosfolipázu třídy C (PLC). Aktivní PLC se zakotvuje svou Src-homologní (SH2) doménou v membráně, v bezprostřední blízkosti svých substrátů. Primárně hydrolyzuje fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát (PIP2). Vznikají DAG a inositol-1,4,5-trisfosfát (IP3). DAG zůstává v membránách, v místě svého vzniku, a působí jako klíčový alosterický aktivátor pro cPKC a nPKC, které se na membránu – pravděpodobně přímo na DAG – vážou svými N-koncovými C1 a C2 subdoménami (Dempsey et al. 2000; Parekh et al. 2000; Parker a Murray-Rust 2004). Naproti tomu PIP2 a IP3 jsou klíčovými články fosfoinositolové kaskády. Ve vzájemných přeměnách druhých poslů této významné kaskády má nezastupitelnou roli enzym fosfatidylinositol 3´-kináza (PI3K), která hraje důležitou roli při fosforylaci PKC. Regulační podjednotka p85 PI3K obsahuje doménu SH2. Díky ní může být PI3K aktivována řadou tyrosinkinázových, G-protein-dependentních a jiných receptorů, a proto se podílí na přenosu signálů velkého počtu nitrobuněčných drah (Cantrell, 2001). Hydrofilní IP3 difunduje cytoplazmou k endoplasmatickému retikulu, z něhož uvolní ionty Ca2+. Vápenaté ionty potom mj. podporují i aktivaci cPKC. Všechny PKC také požadují navázání kofaktoru fosfatidylserinu, který podněcuje uvolnění pseudosubstrátu z aktivního místa, a tím umožňuje navázání substrátu (Parekh et al. 2000; Newton 1997).
2. Aktivace PKC mastnými kyselinami
Různé FA mají rozdílné účinky. Některé jsou tolerovány velmi dobře, nebo dokonce působí protektivně, jiné se už při mírném zvýšení projevují jako „lipotoxické“. K abnormálním výkyvům hladin mastných kyselin dochází zejména po jídle. Postprandiální dyslipidémie a hyperglykémie jsou zřejmě zcela běžné, vyskytují se spolu souběžně a dlouho před tím, než se rozvine IR a než porucha glukózové tolerance vyústí v diabetes (Paolisso et al. 1995).
Nutno však mít na paměti, že PKC nejsou jediným identifikovaným kandidátem na mediátory IR stimulované anebo snad dokonce vyvolané mastnými kyselinami. Vedle PKC se podařilo identifikovat řadu transkripčních faktorů, které jsou přímo regulovány FA. Patří tam již zmíněné izoformy PPAR-α, -γ(-γ1,-γ2) a -δ, HNF-4α a SREBP1c a jiné. Pro účast těchto transkripčních faktorů v rozvoji IR vyvolané mastnými kyselinami svědčí řada údajů (Lam et al. 2003). Jejich funkce je navíc úzce spojena s činností ChREBP (Uyeda et al. 2002). Dále mohou FA aktivovat např. IKK, která může fosforylovat Ser/Thr inzulínového receptoru, IRS anebo adaptorového proteinu Shc s podobnými následky, jaké byly výše popsány po fosforylaci ze strany PKC (Kim et al. 2001; Samuel et al. 2002). Aktivace dráhy IKK/NF-κB je navíc spojena s produkcí zánětlivých a proaterogenních proteinů. Tím se mohou vysvětlovat častá cévní onemocnění obézních pacientů s DM2 včetně chorob věnčitých tepen (Boden and Laakso 2004).
V souhrnu se popsané účinky FA řadí po bok jiným významným potenciálním mechanismům vzniku IR, jakými mohou být fosforylace článků inzulínové kaskády JNK, jež může být extracelulárně stimulována TNF-α (White 2003), dále působením hexosaminové biosyntetické dráhy anebo konečně účinky volných kyslíkových radikálů (McClain a Crook 1996).
Představy o úloze mastných kyselin v rozvoji IR cestou aktivace PKC byly původně formulovány na základě následujících zjištění. Volné mastné kyseliny aktivovaly PKC a podporovaly jejich translokaci do membrán hepatocytů (Diaz-Guerra et al. 1991). Obézní potkani se zvýšenou hladinou triglyceridů měli vyšší aktivitu PKC v játrech než hubení (Qu et al. 1999). Zvýšení FA po infuzi Intralipidu s heparinem stimulovalo translokaci izoformy PKC-δ z cytosolu do membrán v potkaních játrech in vivo (Lam et al. 2002). O aktivovaných PKC se proto dnes uvažuje jako o klíčových mediátorech jaterní IR vyvolané vysokými koncentracemi FA. Důležitost těchto závěrů je patrná z ústřední úlohy jater při udržování hyperglykémie při diabetu.
Podle Lam et al. (2002) byla lipidy stimulována pouze translokace izoformy PKC-δ do membrán buněk potkaních jater, na rozdíl od izoforem PKC-α, -β, -ε a -θ. Tato nPKC izoforma se však možná aktivuje a její translokace se indukuje pouze v některých, a ne ve všech modelech (Caruso et al. 2001). Nová studie provedená na potkanech in vivo naopak upozornila, že při hromadění tuku v játrech se aktivuje především izoforma PKC-ε. Zároveň se zvýšila aktivita JNK-1, přičemž cílové proteiny této kinázy zatím nebyly odhaleny (Samuel et al. 2004). PKC-ε se ovšem také významně účastní regulace transkripce LDL-receptorů v játrech. Dále bylo zjištěno, že nedostatek sterolů vede k aktivaci fosfolipáz a následně ke změně aktivity PKC-ε (Mehta et al. 2002). Jiní autoři už dříve uvedli, že nejen aktivita PKC-δ, ale také aktivity izoforem PKC-α, -ε a -ζ, sdružených s jaterními membránami, byly vyšší u obézních hypertriglyceridemických potkanů a diabetických pacientů než u kontrol (Considine et al. 1995; Qu et al. 1999). To je v souladu se zjištěním, že translokace PKC ve tkáních mimo játra zpravidla zahrnuje více než jednu izoformu. V kosterních svalech je např. hlavní izoformou PKC-θ (Yamada et al. 1995). FA zde ovšem indukují nejen translokaci PKC-θ, ale také PKC-ε, -δ a -β1 do plazmatické membrány (Griffin et al. 1999; Itani et al. 2002; Schmitz-Peiffer 1999).
Výše uvedené rozdílné nálezy by mohly vyplývat z mezidruhových nebo tkáňových zvláštností, odlišností ve směsích mastných kyselin podávaných in vivo či přidávaných do inkubačních médií in vitro, nebo také z různého načasování experimentů vzhledem k probíhajícím fyziologickým rytmům a buněčným procesům. Nicméně současný výzkum provedený na modelu potkanů s NAFLD podporuje hypotézu, že PKC-ε je klíčovým článkem v rozvoji jaterní IR (Obr. 6) (Samuel et al. 2007).
[pic]
Obr. 6. Mechanismus inzulínové rezistence indukované mastnými kyselinami v játrech. Zvýšená lipogeneze anebo snížená oxidace FA v mitochondriích zvyšují množství intracelulárního DAG, který aktivuje PKC-ε. PKC-ε váže a aktivuje kinázu inzulínového receptoru, což vede k nižší inzulínem stimulované fosforylaci tyrosinu IRS-1 a IRS-2. To dále snižuje i aktivaci PI3K a AKT2. Pokles aktivace AKT2 vede ke snížené fosforylaci GSK3 a FOXO, která dále vede k inzulínem stimulované syntéze glykogenu v játrech a nedostatečnému zastavení jaterní glukoneogeneze (převzato ze Savage et al. 2007).
3. Aktivace PKC nasycenými a nenasycenými FFA
Mastné kyseliny nestejné délky, nenasycenosti, nebo jejich polohové (pozice dvojných vazeb) či geometrické (cis, trans) izomery se při navození IR nechovají stejně. Polynenasycené FA (sójový olej) způsobují menší rezistenci vůči inzulínu v jaterní tkáni než mononenasycené (oleát) nebo nasycené (sádlo) (Lam et al. 2003). Polynenasycené FA mění metabolismus FFA spíše směrem k jejich oxidaci než k esterifikaci na TG (Leyton et al. 1987). Použití inhibitorů oxidace ukázalo, že inhibice přenosu inzulínového signálu nebyla závislá na oxidaci FA. V případě esterifikace tomu může být jinak. Nahromadění TG, které jsou koncovým produktem esterifikace, je obvyklou průvodní známkou jaterní IR. FA s dlouhým řetězcem (LCFA-CoA), DAG anebo TG se ve větší míře hromadí v játrech právě v přítomnosti nasycených nebo mononenasycených FA. LCFA-CoA a DAG stimulují PKC (Lam et al. 2002; Seifert R et al.1988). Zdá se proto, že nasycené anebo mononenasycené FA by mohly vyvolat rezistenci snadněji než polynenasycené (Obr.7) (Lam et al. 2003).
[pic]
Obr. 7. Při nadbytku FA v plazmě se v hepatocytech nahromadí LCFA-CoA, DAG nebo TG. Jak LCFA-CoA, tak i DAG vyvolají translokaci PKC-δ z cytosolu do plazmatické membrány. Aktivovaná PKC-δ pak fosforyluje buď Ser nebo Thr inzulínového receptoru nebo signálních molekul inzulínu. To vede k inhibici účinku inzulínu ke zvýšené produkci glukózy v játrech (Lam et al. 2003). CER, ceramidy
Dosavadní údaje ale nejsou jednoznačné. Diaz-Guerra et al. (1991) zaznamenali, že pouze cis-mono- anebo polynenasycené FA, jako kyselina olejová nebo arachidonová, byly schopny indukovat translokaci PKC z cytosolu do membrán hepatocytů, na rozdíl od nasycených (palmitová), esterifikovaných (ethylester kyseliny linolové) anebo trans-nenasycených (elaidová) FA. Přitom mononenasycená kyselina olejová podporovala translokaci PKC již během prvních 10-20 minut jejího působení (Diaz-Guerra et al. 1991). Také jiní autoři uvedli, že palmitová kyselina neovlivňuje aktivitu PKC, když v buněčných liniích jaterního původu zaznamenali nejvyšší nárůst aktivity PKC po přidání vysoce nenasycené FA. Účinek kyseliny linolenové a linolové byl podobný, ale nižší než u kyseliny dokosahexaenové. Účinek kyseliny olejové byl ještě nižší, což podle autorů naznačuje, že proti očekávání by aktivace PKC mohla být úměrná stupni nenasycenosti (Sung et al. 2004). Ve stejném roce byla provedena studie v adipocytech, která neprokázala vliv stupně nenasycenosti FA na fosforylaci IRS-1 (Gao et al. 2004).
Kromě tvorby DAG může LCFA-CoA potencovat de novo syntézu ceramidů (obr. 7). Ceramidy se rovněž podílejí na IR vyvolané lipidy, ale zatím nejasným způsobem (Brindley et al. 1999; Hajduch et al. 2001; Schmitz-Peiffer et al. 1999).
4. Izomery mastných kyselin
Polohové a geometrické izomery mastných kyselin, jako např. konjugované izomery kyseliny linolové, také mají rozdílné účinky (Brown et al. 2001; Brown a McIntosh 2003). Je to známo jak ze studií provedených na zvířatech, tak z klinických zkoušek (Clement et al. 2002; Riserus et al. 2002; Tsuboyama-Kasaoka et al. 2000). Chronická, ne akutní léčba trans-10,cis-12 konjugovanou kyselinou linolovou zřetelně potlačuje obsah TG v adipocytech a vyvolává IR a lipoatrofický diabetes. Naproti tomu cis-9, trans-11 izomer konjugované linolové kyseliny zvyšuje hromadění TG v adipocytech a nevyvolává IR (Brown et al. 2001). Mechanismus rozdílných účinků konjugovaných izomerů kyseliny linolové je nejasný a účinky těchto izomerů na aktivitu PKC zatím nejsou dostatečně prostudovány.
5. Aktivace PKC vysokými hladinami glukózy
Jak už bylo uvedeno výše, PKC je důležitá pro zprostředkování transportu glukózy do buněk po stimulaci inzulínem. Na druhé straně je sama aktivována vysokými hladinami glukózy v plazmě a extracelulární tekutině.
Zvýšené koncentrace glukózy ovlivňovaly membránovou translokaci PKC-δ a PKC-ε v buňkách HepG2 (Nakajima et al. 2000). PKC-δ, aktivovaná vysokými koncentracemi glukózy v mesangiálních buňkách, podněcovala fosforylaci R-Smad – proteinu, zprostředkujícího transkripci v signální dráze transformačního růstového faktoru β (TGF-β, transforming growth factor-β), jeho asociaci se Smad-4 a akumulaci výsledného komplexu v buněčných jádrech (Hayashida a Schapner 2004). Choudhury (2004) se na základě svých zjištění domnívá, že podobné spojení, zprostředkované PKC-ε, by mohlo existovat mezi vysokými hladinami glukózy a dráhou STAT, realizující účinky interferonů. Pokud je tomu tak, může glukóza alterovat signální dráhy rodin uvedených růstových regulátorů a cytokinů a spolu s nimi samotnou kaskádu inzulínu. Paralelně s tím vyslovili Li et al. (2004) předpoklad, že aktivovaná izoforma PKC-δ může ovlivnit citlivost buněk k oxidačnímu stresu spojenému s hyperglykémií.
Hyperglykémie aktivuje izoformy PKC v srdečním svalu. Zároveň podněcuje apoptózu kardiomyocytů. Inhibitory PKC-β2/β1 a PKC-ζ, na rozdíl od inhibitorů PKC-ε, zablokovaly přenos apoptického signálu v potkaních myocytech. Aktivovaná PKC-ε sama inhibovala apoptózu a chránila myocyty před smrtí vyvolanou hyperglykémií (Malhotra et al. 2005).
Zcela nově se ukazuje, že toxičnost FFA, která sama o sobě nemusí být příliš vysoká, se může enormně zvětšit právě při vyšších extracelulárních koncentracích glukózy (El-Assaad et al. 2003). Tyto nálezy jsou pro budoucí výzkumy mimořádně důležité. Demonstrují, že účinky zvýšených koncentrací FA a glukózy, které dosud bývají studovány zpravidla odděleně, je třeba vidět komplexně a nejen v souvislostech substrátových, ale i tkáňových interakcí (Rakatzi et al. 2004).
V naší práci jsme se proto zaměřili na studium účinků zvýšené koncentrace kyseliny olejové v přítomnosti různých koncentrací glukózy. Mezi sledované proteiny jsme zařadili také izoformu PKC-ε, která se zdá být jedním z prostředníků účinků FA a glukózy na metabolismus energetických substrátů.
5. Steroidní hormony: dehydroepiandrosteron (DHEA)
Některé studie uvádějí, že s rozvojem metabolického syndromu jsou spojeny také změny v metabolismu glukokortikoidů a androgenů. V oblasti výzkumu diabetu je v posledních letech věnovaná pozornost steroidnímu hormonu dehydroepiandrosteronu (DHEA). Hormon DHEA a jeho konjugovaný sulfoderivát (DHEA-S) jsou hlavními sekrečními produkty kůry nadledvinek a jeho široké působení zahrnuje centrální nervový systém, imunitní systém, buněčný růst a metabolismus glukózy. Nadledvinky u lidí vylučují tři různé třídy steroidů - glukokortikoidy, mineralkortikoidy a androgeny. Glukokortikoidy, mezi které patří u lidí a většiny savců kortizol a u hlodavců a nižších obratlovců kortikosteron, vykazují široké spektrum účinku na buněčné funkce v zásadě ve všech orgánech (regulace metabolismu sacharidů a aminokyselin, udržování krevního tlaku, řízení odpovědí na stres a zánět, atd). Mineralkortikoidy, u lidí především aldosteron, primárně ovlivňují extracelulární rovnováhu sodíku a draslíku ve tkáních jako jsou ledviny, tlusté střevo a slinné žlázy (shrnuto v Nobel et al. 2001). Prekurzorem androgenů je DHEA, který se od kortisolu a aldosterolu liší poklesem své hladiny s věkem, tzv. adrenopauzou (Nawata et al. 2004). Tato sekrece závislá na věku byla pozorována pouze u lidí a primátů (Webb et al. 2006).
[pic]
Obr. 8: Metabolická dráha syntézy a využití DHEA včetně zúčastněných enzymů. HSD, hydroxysteroid dehydrogenáza; KSR, ketosteroid reductáza; HSS, hydroxysteroid sulfotransferáza; SS, sterol sulfatáza (upraveno podle Webb et al. 2006).
Výchozí sloučeninou pro biosyntézu DHEA (5-androsten-3β-ol-17-on) je cholesterol, ze kterého vzniká sérií reakcí katalyzovaných P450-dependentní monooxygenázou a hydroxysteroid dehydrogenázou (Obr. 8). V krevním oběhu se DHEA vyskytuje převážně ve formě sulfátu (DHEA-S), který je zachycen v cílových tkáních a působením sulfatáz je převeden na DHEA, ze kterého může být přeměněn na jiné steroidní hormony jako jsou androstenedion, androsteron, testosteron a estradiol. Sekrece DHEA je řízena adrenokortikotropním hormonem (ACTH) a jinými faktory z hypofýzy. Nadledvina odpovídá na stresovou stimulaci ACTH zvýšením výdeje kortizolu a snížením DHEA-S. Kůra nadledvinek denně syntetizuje 75-90% celkového množství DHEA a zbytek je produkován varlaty a vaječníky (Kajita et al. 2000; Ripp et al. 2003; Webb et al. 2006). Během hladovění je zvýšená produkce většiny enzymů katalyzujících syntézu DHEA, zatímco produkce enzymů zapojených do rozkladu DHEA nebo přeměny DHEA na jiné hormony je zpomalena. Z toho vyplývá, že tělo se snaží udržet během hladovění tak vysokou hladinu DHEA jak jen to je možné (Bauer et al. 2004).
DHEA vyvolává proliferaci peroxisomů, a proto, stejně jako jiné proliferátory peroxisomů, vyžaduje k řízení exprese genů receptor PPAR-α (Ripp et al. 2002). Data některých autorů ukazují, že DHEA a některé jeho metabolity mohou buď aktivovat anebo se vázat na receptory jako PPAR, PXR (pregnan X receptor), CAR (konstitutivní androstanový receptor) a estrogenový receptor β (ER) (shrnuto ve Webb et al. 2006). Zároveň výsledky jiných výzkumných týmů podporují možnost existence membránového receptoru pro DHEA, který zatím nebyl izolován (Liu and Dillon 2002; Widstrom and Dillon 2004).
S vyšším věkem dochází ke změnám v metabolismu glukózy, k rozvoji obezity a jiných onemocnění. Stárnutí doprovází také úbytek DHEA v plazmě. Hladina DHEA se liší u mužů a žen (u mužů je vyšší) a je také považována za objektivní ukazatel stáří organismu, protože lidé stejného věku mohou mít jinou hladinu DHEA podle svého způsobu života. To podporuje nedávno provedená studie, ve které se projevil pozitivní vztah mezi nízkou morbiditou a hladinou DHEA-S (Roth et al. 2002).Ve třetí dekádě života dosahuje DHEA-S asi 5-10 µM koncentrace a pak klesá. Za dramatickým poklesem sekrece DHEA a DHEA-S s věkem by mohla být snížená aktivita enzymu 17,20-lyázy, který katalyzuje přeměnu pregnenolonu na DHEA (Obr. 8) (Nawata et al. 2004).
Předpokládá se, že DHEA a glukokortikoidy působí antagonisticky. DHEA u myší zvrátila imunitní změny způsobené glukokortikoidy po traumatu/krvácení tím, že došlo k normalizaci hladiny kortikosteronu (Catania et al. 1999), což naznačuje působení na prereceptor 11β-HSD1. 11β-HSD1 je oxidoreduktáza, která je schopna v tkáních reaktivovat inaktivní kortikosteroidy, a tak zesílit působení glukokorikoidů. Snížení exprese po aplikaci DHEA bylo nedávno popsáno na modelu hepatocytů potkanů (Gu et al. 2003). Z toho může být usuzováno, že během stárnutí dochází ke zvýšenému působení glukokortikoidů na imunitní systém přes aktivaci 11β-HSD1, díky redukovanému antagonistickému vlivu DHEA, jehož sekrece s věkem klesá (Arlt and Hewison 2004).
V úvahu je ale také třeba vzít nedávno zveřejněné výsledky, které ukazují, že exprese mRNA a aktivita PPAR také klesá s věkem (Sung et al. 2004). Ačkoliv fyziologická funkce DHEA je stále nejasná, nízké hladiny DHEA jsou mnohými považovány za rizikový faktor ke vzniku kardiovaskulárních onemocnění a vůbec doprovázejí rozvoj civilizačních chorob jako jsou obezita, DM2, rakovinové bujení, onemocnění oběhového systému a poruchy paměti (Campbell et al. 2004; Webb et al. 2006). Jiní autoři však považují koncentraci DHEA-S za spíše nespecifický indikátor stárnutí a zdravotního stavu, než za ukazatel rizika rozvoje určitých onemocnění (Kapoor et al. 2005).
1. DHEA a diabetes
DHEA může mít retardační účinek na vývoj řady degenerativních onemocnění. Existuje několik prací, které podporují tvrzení, že DHEA zamezuje vzniku IR a rozvoji diabetes mellitus (Aoki et al. 1999; Kimura et al. 1998; Mukasa et al. 1998). Mechanismus antikancerogenních, antiobezitních, imunomodulačních a antidiabetogenních účinků DHEA(S) není přesně znám. Uváděno bývá několik možností. První je interakce DHEA anebo DHEA-S s intracelulárními receptory, které se chovají jako transkripční faktory. Další možností je antiglukokortikoidní účinek DHEA, který však neprobíhá cestou kompetice tohoto steroidu s glukokortikoidy na jejich receptorech. DHEA také působí jako proliferátor peroxisomů, tím že zvyšuje počet peroxisomů a vyvolává expresi enzymů asociovaných s peroxisomy. Tento účinek zahrnuje aktivaci signální dráhy PPAR-α. Jinou eventualitou je negenomické působení steroidů, které zprostředkovávají membránové receptory. DHEA také vykazuje antioxidační účinky a inhibuje aktivaci NFκB. Dosud nebylo určeno, který z těchto anebo mnoha dalších potenciálních mechanismů souvisí přímo s účinky DHEA (shrnuto v Dillon 2005).
Fyziologický význam DHEA není dosud zcela jasný. Na základě zveřejněných výzkumů se předpokládá, že DHEA hraje důležitou roli v prevenci diabetu. Například podání DHEA db/db myším vedlo ke zlepšení IR (Coleman et al. 1982; Coleman et al. 1984), ke zvýšení absorpce glukózy a redistribuci PKC-β a PKC-ζ (Ishizuka et al. 1999). U hlodavců sice není DHEA produkována nadledvinkami, ale jeho omezené množství je produkováno z progesteronu ve steroidogenních tkáních (van Weerden et al. 1992; Pelletier et al. 1992).
U diabetiků byly nalezeny signifikantně nižší hladiny testosteronu i DHEA oproti kontrolním pacientům, a to i se zřetelem na obezitu a rozložení tuků pacientů. Také hyperinzulinémie u starších lidí je spojována s nižšími hladinami androgenů (shrnuto v Kapoor et al. 2005). Vysoké hladiny FFA a nízké podíly polynenasycených FA (zvláště kyseliny arachidonové) v séru doprovázejí IR spjatou s obezitou a DM2. Signifikantní snížení hladin FFA v séru účinkem DHEA bylo pozorováno jak u hubených tak obézních Zucker potkanů. DHEA také mění profily FA ve svalové tkáni obézních potkanů, konkrétně zvýšením podílu kyseliny arachidonové a poklesem podílu kyseliny olejové (Abadie et al. 2000; Abadie et al. 2001). Dále byl popsán vliv DHEA-S na β-buňky, u kterých zvýšil produkci inzulínu vyvolanou glukózou (Dillon et al. 2000) a také zlepšení glukózové tolerance u geneticky diabetických nebo obézních myší (Coleman et al. 1984). DHEA také ovlivňuje metabolismus glukózy v játrech tím, že přímo snižuje enzymovou aktivitu, hladinu mRNA a expresi proteinu glukózo-6-fosfatázy v buňkách HepG2. Navíc byla pozorována snížená genová exprese PEPCK, dalšího klíčového enzymu glukoneogeneze vlivem DHEA. Nicméně molekulární mechanismus poklesu genové exprese těchto glukoneogenních enzymů je nejasný (Yamashita et al. 2005; Aoki et al. 2003). DHEA je také schopen zvýšit absorpci glukózy v lidských fibroblastech (Nakashima et al. 1995), potkaních (Kajita et al. 2000) i lidských adipocytech (Perrini et al. 2004) a hepatomových buňkách HepG2 (Yamashita et al. 2005). Účinek DHEA na transport glukózy v adipocytech je zprostředkován PI3K, PLC γ a konvenční izoformou PKC-β1 (Perrini et al. 2004). V adipocytech potkanů byla pozorována aktivace jak konvenčních tak atypických izoforem PKC (Kajita et al. 2000). Na druhou stranu výsledky prací některých autorů ukazují, že ne všechny účinky DHEA musejí být prospěšné. Bylo popsáno, že pankreatické β-buňky ovlivněné DHEA vykazovaly velmi nízkou citlivost ke glukóze a sníženou bazální sekreci inzulínu (Liu et al. 2006).
Ačkoliv fyziologická koncentrace DHEA u lidí je 0,7-50 nM, koncentrace DHEA v plazmě myší , které vykazovaly signifikantní antidiabetický účinek, byly 10-krát vyšší než u kontrolní skupiny, což naznačuje že pozitivní účinky DHEA mohou být způsobeny tzv. farmakologickými dávkami, které do značné míry přesahují fyziologické koncentrace (Yamashita et al. 2005). S dávkováním také souvisí diskutovaný vliv DHEA na produkci reaktivních kyslíkových intermediátů. Kolektiv autorů Mastrocola et al. (2003) pozoroval antioxidační působení DHEA v játrech potkanů pouze po aplikaci DHEA v nízkých dávkách přičemž vysoké, farmakologické dávky DHEA vedly ke zvýšení produkce hladiny H2O2 (Mastrocola et al. 2003). Na druhou stranu jiní autoři již dříve demonstrovali, že některé účinky DHEA na energetický metabolismus zcela vymizí, pokud je DHEA aplikovaná v nízkých dávkách (Aoki et al. 2004; Gu et al. 2003; Mastrocola et al. 2003; Peters et al. 1996; Ripp et al. 2002), a tak názory na podávané množství DHEA jsou stále rozoruplné.
4. Cíl práce
Cílem disertační práce bylo studium účinků a mechanismu působení kyseliny olejové v přítomnosti tří různých koncentrací glukózy, a studium účinků a mechanismu hormonu DHEA na expresi mRNA PPAR-α, L-FABP a PKC-ε, které jsou klíčovými články energetického metabolismu. Současně jsme sledovali změny v translokaci těchto proteinů mezi buněčnými kompartmenty. Studie byla provedena v lidských hepatomových buňkách HepG2.
Konkrétní cíle práce zahrnují:
1. Zavedení metody buněčné frakcionace s následnou imunodetekcí na naše pracoviště a ověření metody pomocí známého aktivátoru PKC, forbol myristát acetátu (PMA).
2. Určit vliv 300 μM kyseliny olejové v přítomnosti nulové, normální a vysoké koncentrace glukózy:
a. na distribuci proteinů PKC-ε, PPAR-α a L-FABP mezi buněčnými kompartmenty pomocí zavedené metody
b. na expresi mRNA PKC-ε, PPAR-α a L-FABP metodou RT-PCR
c. pomocí inhibitoru transkripce (aktinomycin D) a translace (cykloheximid) blíže určit mechanismus působení výše uvedených stimulantů
3. Stanovení účinků 100 μM DHEA:
a. na distribuci proteinů PKC-ε, PPAR-α a L-FABP mezi buněčnými kompartmenty
b. na expresi mRNA PKC-ε, PPAR-α a L-FABP metodou RT-PCR
c. pomocí inhibitoru transkripce (aktinomycin D) a translace (cykloheximid) blíže určit mechanismus působení výše uvedených stimulantů
POUŽITÝ MATERIÁL A METODY
15 Chemikálie a materiál
Buněčná linie lidských hepatocytů HepG2, Eagle minimum essential medium (EMEM), pyruvát sodný, L-glutamin, penicilin, streptomycin, trypsin, hovězí sérový albumin (BSA), fatty-acid free BSA, mastné kyseliny (FA), D-glukóza, cykloheximid, aktinomycin D, DHEA, forbol 12-myristát 13-acetát (PMA), CPS Substrate (ProteoQwest Chemiluminiscent Western Blotting Kit), EGTA, MgCl2, sodium pyrofosfát, NaF, phosphatase inhibitor cocktail 1, Tris base, MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide), PMSF a DMSO byly zakoupeny od Sigma-Aldrich. Dulbecco’s modified Eagle’s medium bez glukózy (DMEM) a fetální bovinní sérum (FBS) byly objednány u firmy Gibco. Protilátky goat PPAR-α, Anti-Goat IgG HRP-linked antibody a Anti-Mouse IgG HRP-linked antibody byly dodány firmou Santa Cruz Biotechnology, mouse L-FABP od firmy Abcam, mouse PKC-ε od firmy BD Transduction a mouse α-tubulin od firmy Calbiochem. High Pure RNA Isolation Kit, LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I a Transkriptor First Strand cDNA Synthesis Kit pro RT-PCR byly zakoupeny u firmy Roche Diagnostics, stejně jako inhibitory proteáz Mini Complete. Oligonukleotidy (primery) byly objednány od firmy Metabion International. Ostatní chemikálie byly zakoupeny u následujících společností: nitrocelulózová membrána, Precision Plus Protein Standards – Dual Color a Tween20 (Bio-Rad), Tris-HCl (Amersham), EDTA a NaHCO3 (Lachema), Triton X-100 (Serva).
ve studii byly využity následující přístroje: Ultracentrifuga Hitachi Automatic Preparative Micro Ultracentrifuge model CS120, spektrofotometr Helios α Unicam, Mini-PROTEAN 3 (Bio-Rad), imunodetekční systém Chemi Genius Bio Imaging Systém (Syngene), sonikátor BANDELIN SONOREX RK 100, TRANS-BLOT® SD (Bio-Rad), Light Cycler (Roche), inkubátor WTB Binder, ELISA reader METERTECH Σ960
16 Složení roztoků a pufrů
Lyzační pufr: 0,125 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 % SDS, 30 % glycerol, 10 μl/ml β-merkaptoethanol, 150 μl/ml Protease inhíbitor cockteil, 1 mM PMSF
Pufr A:
20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 1 mM NaHCO3, 2 mM Na3VO4, 10 mM sodium pyrofosfát, 100 mM NaF, 1 mM PMSF, phosphatase inhibitor cocktail 1, inhibitory proteáz Mini Complete.
Pufr B:
Pufr A + 1% Triton X-100
Pufr I:
10 mM Hepes (pH 8), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% NP-4, 1 mM DTT, 1 mM PMSF
Pufr II:
20 mM Hepes pH 8, 1,5 mM MgCl2, 25 % glycerol, 420 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF
TBS (10x Tris Buffered Saline): na 1 litr 10x TBS: 24,2g Tris base, 80g NaCl,
Blokovací pufr: 1x TBS, 0,1% Tween20 s 5% netučným sušeným mlékem Milli.
TBS/T (promývací pufr): 1x TBS, 0,1% Tween20
PADB (Primary Antibody Dilution Buffer): 1x TBS, 0,1% Tween20, 5% BSA.
17 Kultivace lidských hepatomových buněk HepG2
Pro kultivaci a ovlivnění byla použita lidská imortalizovaná hepatomová linie HepG2 pravidelně kontrolovaná na přítomnost kontaminantů rodu Mycoplasma za použití real-time RT- PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) podle Harasawy et al. (2005). Buňky byly pěstovány v EMEM s přídavkem pyruvátu sodného, L-glutaminu, penicilinu, streptomycinu a FBS (10%) při 37 °C v atmosféře 5% CO2. Buňky byly pasážovány 2x týdně. Po dosažení 80 % konfluence (asi 3 dny po pasážování) byly buňky připraveny k ovlivnění příslušnými stimulanty.
18 Příprava komplexů mastných kyselin s BSA
Komplexy mastných kyselin s BSA byly připraveny v molárním poměru 2:1 (FA:BSA). Během rozpouštění byly vzorky vortexovány, mírně zahřívány (max do 40°C) a sonikovány (20 min). Hladina BSA byla u všech pokusů včetně kontrol doplněna na 1 %. Pro ovlivnění byly použity nasycené FA (kyselina palmitová, PA; kyselina stearová, ST) a mononenasycená kyselina olejová (OL). Výsledné koncentrace mastných kyselin v médiu byly 100 μM pro pilotní studii, v dalších pokusech jsme použili 300 μM OL.
19 Inkubace buněk s FA
Buňky narostlé do ~80% konfluence byly dvakrát promyty PBS a medium bylo vyměněno za DMEM s 1% FBS s komplexy mastných kyselin nebo v případě kontroly pouze za DMEM s 1% FBS a s 1% BSA. V pilotní studii byly buňky inkubovány s kyselinami PA, ST a OL v koncentraci 100 μM. Při stanovení vlivu OL a různých koncentrací glukózy, bylo k inkubaci použito medium DMEM s 1% FBS bez glukózy (G0), s normální glukózou (5,5 mM; Gn) nebo s vysokou koncentrací glukózy (30mM; Gv) a OL v konečné koncentraci 300 μM. Inkubace při 37°C byla ukončena odsátím média a dvojnásobným promytím PBS. Buňky byly uvolněny trypsinem a spočítány. Buněčné pelety byly po centrifugaci (4000 otáček, 2min) zváženy a zamraženy v –80°C.
Pro zablokování transkripce a translace byly použity inhibitory cykloheximid (CHX) a aktinomycin D (ActD).
20 Vliv cykloheximidu na expresi mRNA
Buňky HepG2 narostly do 80 % konfluence a poté byly inkubovány s různými koncentracemi glukózy v přítomnosti/absenci 300 μM kyseliny olejové a 1,4 μg/ml translačního inhibitoru CHX nebo pouze v médiu s 1% FBS (kontrola). Po 4 hodinách byla izolována celková RNA a byla měřena exprese mRNA (viz níže).
21 Účinek aktinomycinu D na stabilitu mRNA
Buňky HepG2 narostly do 80 % konfluence a poté byly inkubovány s různými koncentracemi glukózy v přítomnosti/absenci 300 μM kyseliny olejové po dobu 4 hodin. Hodinu před ukončením inkubace byla transkripce mRNA zastavena přidáním ActD do konečné koncentrace 4 μg/ml. Souběžně bylo provedeno ovlivnění buněk oběma inhibitory najednou, tj. ActD (4 μg/ml) a CHX (1,4 μg/ml). Kontrolní vzorky byly inkubovány bez inhibitorů. Po ukončení inkubace byla celková RNA izolována a byla měřena exprese mRNA (viz níže).
22 Inkubace buněk s DHEA
Buňky narostlé do 80% konfluence byly 2-krát promyty PBS a medium bylo vyměněno za médium bez séra (kontrola) nebo za médium bez séra spolu se 100 μM DHEA. Stimulace DHEA byla provedena ve 2 hod, 12 hod a 20 hod intervalech.
Pro zablokování transkripce a translace byly použity inhibitory CHX a ActD.
23 Vliv cykloheximidu na expresi mRNA
Buňky HepG2 narostly do 80 % konfluence a poté byly inkubovány v přítomnosti/absenci 100 μM DHEA a translačního inhibitoru CHX nebo pouze v médiu bez séra (kontrola). Konečná koncentrace CHX v médiu byla 1,4 μg/ml. Po 20 hodinách byla izolována celková RNA a byla změřena exprese mRNA (viz níže).
24 Účinek aktinomycinu D na stabilitu mRNA
Buňky HepG2 narostly do 80 % konfluence a stimulovány 12 hod se 100 μM DHEA. Po 12 hod byla transkripce mRNA zastavena přidáním ActD na dalších 2,5 hod, 5 hod a 8 hod. Konečná koncentrace ActD v médiu byla 4 μg/ml. Kontrolní buňky byly stimulovány s ActD bez DHEA ve stejných časových intervalech. Po ukončení inkubace byla celková RNA izolována a byla změřena exprese mRNA (viz níže).
25 Inkubace buněk s PMA
Metodu buněčné frakcionace a následné imunodetekce translokovaných izoforem PKC jsme ověřili inkubací buněk HepG2 se PMA. PMA byl rozpuštěn v DMSO a přidán k inkubačnímu médiu do konečné koncentrace 100 nM (v případě kontroly byl přidán pouze DMSO; konečná koncentrace 0,1%) a buňky byly stimulovány 30 min, 4 hod a 20 hod.
26 Purifikace mRNA, syntéza cDNA a real time PCR
Frakce celkové RNA byla získána s využitím High Pure RNA Isolation kitu navázáním RNA na povrch skleněných vláken. Případné zbytky kontaminujících DNA jsou odstraněny deoxyribonukleázou. Po promytí a eluci jsou eluáty RNA rozděleny do podílů a zamrazeny při –80°C. Takto připravené eluáty byly použity na syntézu cDNA. RNA byla reverzně transkribována do cDNA podle protokolu Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kitu. Pro navržení části primerů byla použita NCBI (National Center for Biotechnology Information) nukleotidová databáze a LightCycler Probe Design Software. Primery byly navrženy tak, aby přesahovaly rozhraní mezi exony a předešlo se případné amplifikaci genomické DNA. Primery jednotlivých stanovovaných složek včetně referenčních, tzv. housekeeping genů jsou uvedeny v tabulce 1.
20 μl reakční směsi skládající se z FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I, forward a reverse primerů a 2 μl vzorku cDNA, bylo vloženo do skleněné kapiláry. Paralelně s každou skupinou primerů byla provedena negativní kontrola. Pro vyrovnání variability vstupního množství RNA byly hodnoty expresí mRNA každého vzorku normalizovány faktorem, odvozeným z expresí několika vnitřních referenčních genů – hypoxanthin fosforibosyltransferázy (HPRT), glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH), cyklophilinu A (CyclA) a β-aktinu. Kvalita PCR produktů byla dále potvrzena kontrolou křivky tání a v iniciálních fázích experimentů také elektroforézou produktů amplifikace v agarózovém gelu.
[pic]
Tab. 1. Seznam stanovovaných složek a housekeepingových genů použitých pro normalizaci. Primery pro L-FABP a HPRT byly navrženy na našem ústavu.
27 Příprava buněčných lyzátů
K peletě buněk byl přidán lyzační pufr (100 μl/106 buněk) a směs byla na ledu několikrát protažena stříkačkou. Po 30 minutách stání na ledu byl buněčný lyzát 5 min povařen, zchlazen a centrifugován (14 000 x g, 4°C, 10 min). V supernatantu bylo změřeno množství proteinů Bradfordovou metodou a supernatant byl uchováván při -20°C jako celkový lyzát.
28 Buněčná frakcionace
29 Příprava cytosolové a membránové frakce:
Metoda přípravy cytosolových a membránových frakcí vychází z práce Nakajima et al. 2000 a byla dále upravena.
Peleta buněk byla resuspendována v pufru A (50 μl/10 mg buněk) pomocí jehly, sonikována a za občasného míchání 30 min inkubována na ledu. Suspenze byla centrifugována při 100 000 g 60 minut a supernatant byl odebrán jako cytosolová frakce. Peleta po centrifugaci byla resuspendována v pufru B (42 μl/10 mg buněk) pomocí jehly a za občasného promíchání 30 min inkubována na ledu. Suspenze byla opět centrifugována při 100 000 g 60 minut a supernatant byl odebrán jako membránová frakce. Z každé frakce byl odebrán vzorek k pozdějšímu měření proteinů metodou Bradfordové. Ke 100 μl cytosolové nebo membranové frakce bylo přidáno 50 μl 3 x Laemmliho pufru. Vzorky byly ponechány 20 minut na ledu, 5 minut povařeny, alikvotovány a uchovány při -20°C. Čistota frakcí byla ověřena kontrolou obsahu α-tubulinu.
30 Příprava cytosolové a jaderné frakce:
Příprava cytosolových a jaderných extraktů vychází z metody frakcionace podle Dignama (Mercier et al. 1999) a byla dále upravena.
Buněčná peleta byla spolu s pufrem I (20 μl/106 buněk) resuspendována pipetou a poté protažena injekční stříkačkou, centrifugována při 12 000 g 10 min a supernatant byl oddělen jako cytosolová frakce. Po promytí pufrem I byla peleta homogenizována v pufru II a následnou centrifugací při 30 000 g byla získána jaderná frakce. Z každé frakce byl odebrán vzorek k pozdějšímu měření proteinů. Ke každé frakci byl přidán Laemmliho pufr a po povaření (4 min) byly vzorky rozalikvotovány a uchovány při –20°C. Čistota frakcí byla ověřena kontrolou obsahu α-tubulinu.
31 Stanovení viability buněk MTT testem
Tento test je založen na redukci tetrazoliové soli na tmavě modré, ve vodě nerozpustné krystalky formazánu, kterou zprostředkovává mitochondriální enzym sukcinyl dehydrogenáza viabilních buněk. Buněčná membrána zdravých buněk je pro vznikající formazán nepropustná a krystalky se hromadí v buňkách. Viabilita hepatomových buněk HepG2 byla testována po 20 hodinách působení kyseliny olejové (0,1–1 mM). Po skončení inkubace buněk bylo na 100 μl média do každé jamky přidáno 10 μl čerstvě připraveného MTT roztoku (5 mg/ml) v PBS. Po 4 hodinách inkubace při 37°C byly krystalky vzniklého formazánu rozpuštěny přidáním 100 μl roztoku NH3 v DMSO (1:100). Absorbance produktu, měřena spektrofotometricky při 540 nm, je ukazatelem množství přežívajících, resp. metabolicky aktivních buněk. Z Obr. 9 vyplývá, že kyselina olejová nemá za podmínek experimentu významný vliv na viabilitu buněk HepG2.
Obr. 9. Viabilita buněk HepG2 v přítomnosti kyseliny olejové. Naměřené hodnoty z MTT testu byly vztaženy ke kontrole (100%), která obsahovala buňky ovlivněné pouze 1% BSA.
32 Elektroforéza a blotting
Připravené vzorky byly dále rozděleny SDS - PAGE a přeneseny na nitrocelulózovou membránu metodou Western-blotting. Elektroforéza probíhala v 0,75 mm silných, 10 % polyakrylamidových příp. 7,5-15 % gradientových gelech v systému Mini-PROTEAN 3. Lyzáty nebo vzorky po frakcionaci byly naneseny v množství 20 μg celkových proteinů na jamku a na každý gel byl nanesen standard (Precision Plus Protein Standards – Dual Color). Poté následoval transfer proteinů z gelu na nitrocelulósovou membránu Semi-dry systémem od firmy Bio-Rad. Kontrola přenosu proteinů byla provedena barvením membrán v Ponceau S. Obarvené membrány byly skenovány pro případnou kontrolu a následně odbarveny promytím v PBS.
33 Imunodetekce
Membrány byly po odbarvení ponořeny na 5 min do transferového pufru, 2 x 5 min promyty TBS a pak přemístěny na třepačku do blokovacího pufru na 1 hod při pokojové teplotě. Po následném promytí 2 x 5 min v TBS/T byly inkubovány s primární protilátkou naředěné v PADB po dobu 1 hodiny nebo za stálého třepání přes noc při 4°C. Po dalším promývání v TBS/T (10 x 5 min) se membrány 1 hodinu inkubovaly v sekundární protilátce naředěné v blokovacím pufru. Po posledním promývání v TBS/T (10 x 5 min) byla membrána překryta vrstvou chemiluminiscenčního substrátu a vyhodnocena pomocí Chemi Genius Systém.
34 Statistické hodnocení
Každý experiment byl proveden ve třech nezávislých pokusech a každý vzorek byl stanoven v dubletu. Na proteinové úrovni byly získané výsledky statisticky hodnoceny pomocí jedno- a dvouvýběrového Studentova t-testu a programem SPSS verze 14. Kvantitativní real time PCR stanovení byla normalizována faktorem odvozeným z exprese housekeepingových genů a statisticky vyhodnocena pomocí t-testu nebo ANOVA + post-hoc testem na 5% hladině významnosti.
výsledky
V prvním experimentálním modelu jsme zvolili kyselinu palmitovou (PA), stearovou (ST) a olejovou (OL), které jsou převažujícími složkami FA. Vliv 100 μM PA, ST a OL na PKC-ε jsme sledovali na úrovni proteinů i mRNA. Doba inkubace byla 4 hod a 20 hod. Z každého vzorku jsme odebrali 1 milión buněk na RT-PCR analýzu a zbytek jsme použili na buněčnou frakcionaci. Protože šlo o pilotní studii, byly jednotlivé inkubace provedeny jen v singletech (Obr. 10A, B).
[pic][pic]
Obr. 10. Vliv vybraných mastných kyselin na aktivaci a expresi PKC-ε. (A) Distribuce PKC-ε mezi buněčnými kompartmenty. (B) Změny exprese mRNA PKC-ε měřené metodou RT-PCR. Měření byla provedena v singletech. Kontrolní vzorky (hodnoty 100%) byly ovlivněny pouze 1% BSA.
1. OVĚŘENÍ METODY PRO STANOVENÍ TRANSLOKACE PKC-ε
Metoda na stanovení aktivity PKC byla testována pomocí PMA (forbol myristát acetát), který je známým aktivátorem PKC. Buňky byly ovlivněny 100 nM PMA po dobu 5 minut, 30 minut, 4 hodin a 20 hodin. Na blotech je viditelný přesun PKC-ε do membrán po 30 minutách a 4 hodinách inkubace s PMA (Obr. 11A, B, C).
[pic] [pic]
[pic]
Obr. 11. Vliv PMA na distribuci PKC-ε mezi buněčnými kompartmenty. (A) Přesun PKC-ε mezi cytosolovou (cyt) a membránovou (mem) frakcí. Kontrolní vzorky (hodnoty 100%) byly ovlivněny pouze 0,1% DMSO. (B) Aktivace PKC-ε vyjádřená jako poměr denzit membránové a cytosolové frakce. (C) Imunodetekce PKC-ε v jednotlivých frakcích. Hodnoty v (A) a (B) vyjadřují průměr tří nezávislých experimentů ± SD.
2. VLIV KYSELINY OLEJOVÉ V PŘÍTOMNOSTI RŮZNÝCH KONCENTRACÍ GLUKÓZY
K dalšímu výzkumu jsme se rozhodli použít kyselinu olejovou (OL), která je hlavní cirkulující mastná kyselina v krvi a je považována za aktivátor PKC v játrech a svalech (Chen 2006). Protože jsme za podmínek zvolených v pilotní studii nepozorovali translokaci PKC-ε, rozhodli jsme se prověřit účinek kyseliny olejové v 3-krát vyšší koncentraci, tzn. 300 µM, a to v přítomnosti různých koncentrací glukózy simulujících hyperglykémii (30 mM glukóza; Gv), normoglykémii (5,5 mM glukóza; Gn) nebo extrémní hypoglykémii (bez glukózy; G0). Současně byl sledován účinek samotné zvýšené, příp. nulové hladiny glukózy. Z předchozích studií je známo, že OL podporuje translokaci PKC již během prvních 10-20 minut jejího působení (Diaz-Guerra et al. 1991). Také účinek PMA byl nejvyšší po 30 minutách a 4 hodinách (Obr. 11). Opustili jsme dále 20-hodinový interval inkubace a buňky byly ovlivněny jen po dobu 30 minut a 4 hodin. Po 30-minutové inkubaci s 300 μM kyselinou olejovou skutečně došlo k translokaci PKC-ε do membrán nezávisle na koncentraci glukózy (180%, 213% a 200% pro OL+G0, OL+Gn a OL+Gv oproti kontrole Gn; p < 0,05), zatímco 4-hodinová inkubace vedla k navrácení zpět do cytosolu (Obr.12A).
Kromě PKC-ε jsme sledovali aktivaci dalších článků metabolismu lipidů, PPAR-α a L-FABP. Aktivace PPAR-α a L-FABP se projevuje přesunem těchto proteinů z cytosolu do jádra. 30 minutová ani 4 hodinová inkubace nevyvolala translokaci proteinů PPAR-α a L-FABP z cytosolu do jádra (Obr. 12B, C). Celkové množství proteinů v buněčných lyzátech zůstalo nezměněno u všech sledovaných proteinů.
[pic]
[pic] [pic]
D Cytosol: Membrány:
K OL+G0 OL+Gn OL+Gv K OL+G0 OL+Gn OL+Gv
30 min
PKC-ε
4 hod
30 min
PPAR-α
4 hod
30 min
L-FABP
4 hod
α-tubulin
Obr. 12. Vliv kyseliny olejové a glukózy na translokaci PKC-ε, PPAR-α a L-FABP. Po buněčné frakcionaci a imunodetekci byla aktivace sledovaných proteinů vyjádřená jako poměr denzit membránové a cytosolové frakce (mem/cyt), resp. jaderné a cytosolové frakce (jad/cyt). Translokace PKC-ε (A), PPAR-α (B) a L-FABP (C). Ukázka imunoblotů po detekci protilátkami proti PKC-ε, PPAR-α, L-FABP a α-tubulinu (D).
T-test (*) p < 0,05 oproti kontrole (Gn = 100%). Vzájemné rozdíly všech skupin pak byly hodnoceny metodou ANOVA a post hoc testu; (#) p < 0,05 při porovnání dvou časových intervalů; (●) p < 0,05 oproti kontrole s příslušnou hladinou glukózy (G0; Gn; Gv = 100%); NS - není signifikantní. Hodnoty vyjadřují průměr tří nezávislých experimentů ± SD.
Změny po ovlivnění OL byly také měřeny na úrovni mRNA. Po 30 minutách inkubace s OL a různými koncentracemi glukózy jsme nezjistili žádné statisticky významné změny relativní exprese mRNA PKC-ε, L-FABP ani PPAR-α (Obr. 13A). Naopak po 4 hodinách jsme na úrovni mRNA pozorovali u buněk inkubovaných v médiu s OL + G0 statisticky významný pokles exprese PPAR-α vůči kontrolním buňkám pěstovaným v médiu s Gn (na 55%; p < 0,05). Tento pokles byl také signifikantní jak vzhledem k buňkám inkubovaným pouze v G0, tak i vzhledem k buňkám inkubovaným s OL + Gn. Dále jsme v přítomnosti OL + G0 pozorovali zvýšenou expresi L-FABP, která byla statisticky významná vzhledem k buňkám inkubovaným s G0, a také OL + Gn. V přítomnosti OL + Gv pak dále došlo k mírnému nárůstu mRNA PPAR-α oproti buňkám inkubovaným s nadbytkem glukózy (Gv) (Obr. 13B). Exprese PKC-ε zůstala po skončení obou inkubací nezměněna (Obr. 13A, B).
[pic] [pic]
Obr. 13. Vliv kyseliny olejové a glukózy na relativní expresi mRNA sledovaných složek. Po 30 minutách (A) a 4 hodinách (B) inkubace HepG2 s 300 µM OL a různou koncentrací glukózy (G0; Gn; Gv) byly metodou RT-PCR stanoveny exprese mRNA. T-test (*) p < 0,05 proti kontrole (Gn = 100%). Vzájemné rozdíly všech skupin pro každý gen (PPAR-α, L-FABP a PKC-ε) a interval 4h pak byly hodnoceny ještě pomocí analýzy ANOVA a post hoc testu; (●) p < 0,05. Hodnoty vyjadřují průměr tří nezávislých experimentů ± SD.
3. Stanovení mechanismu účinku kyseliny olejové
Abychom porozuměli mechanismu působení OL na expresi PPAR-α a L-FABP, provedli jsme dva experimenty s využitím aktinomycinu D (inhibitor transkripce, ActD), a cykloheximidu (inhibitor translace, CHX). K ověření a bližší specifikaci mechanismu přeměny mRNA jsme se rozhodli inkubovat buňky také v přítomnosti obou zmíněných inhibitorů současně.
Inkubace buněk s ActD vedla k poklesu mRNA PPAR-α (75%; p < 0,05) pouze při vysoké koncentraci glukózy (Gv). OL + ActD neměly vliv na expresi mRNA PPAR-α (Obr. 14A). Ovlivnění CHX způsobilo signifikantní pokles jak po inkubaci bez glukózy (G0 na 43%; p < 0,05), tak i v prostředí vysoké glukózy (Gv na 78%; p < 0,05). Pokles exprese mRNA PPAR-α způsobený CHX v přítomnosti G0 byl navíc signifikantně nižší než u buněk inkubovaných v prostředí Gn nebo Gv (Obr. 14B). Také po inkubaci s OL + CHX došlo k úbytku mRNA PPAR-α (G0 na 46%; Gn na 67% a Gv na 72%; p < 0,05) (Obr. 14B). Ovlivnění oběma inhibitory současně (ActD + CHX) naopak vedlo ke zvýšení exprese mRNA PPAR-α po inkubaci s vysokou glukózou (Gv na 151%; p < 0,05). Zvýšení exprese jsme také pozorovali po ovlivnění oběma inhibitory a kyselinou olejovou (ActD + CHX + OL) v přítomnosti vysoké (Gv na 172%; p < 0,05) či nulové glukózy (G0 na 164%; p < 0,05) (Obr. 14A). V obr. 14C a 14D jsme vyjádřili vliv jednotlivých inhibitorů tak, že exprese po inkubaci s inhibitory byly porovnány s daty po ovlivnění bez inhibitorů (tj. kontroly pro OL + ActD a OL + ActD + CHX jsou buňky inkubované v prostředí dané koncentrace glukózy současně s kyselinou olejovou, zatímco kontroly pro ActD a ActD + CHX jsou, stejně jako u grafů A a B, buňky inkubované v přítomnosti pouze dané koncentrace glukózy).
[pic][pic] [pic] [pic]
Obr. 14. Vliv kyseliny olejové a glukózy na mRNA PPAR-α v přítomnosti aktinomycinu D a cykloheximidu. (A; C) Účinek inhibitoru ActD a současný účinek inhibitorů ActD + CHX na relativní expresi PPAR-α. (B; D) Účinek inhibitoru CHX na relativní expresi PPAR-α.
(A; B) T-test (*) p < 0,05 oproti kontrole s příslušnou hladinou glukózy (G0; Gn; Gv = 100%). (C; D) T-test (*) p < 0,05. Naměřené hodnoty před aplikací inhibitorů byly definovány jako 100 % (K; OL + G0; OL + Gn; OL + Gv = 100%).
(A; B; C; D) Vzájemné rozdíly všech skupin pak byly hodnoceny ještě pomocí analýzy ANOVA a post hoc testu (#) p < 0,05. Hodnoty vyjadřují průměr tří nezávislých experimentů ± SD. NS, není signifikantní vůči G0.
ActD samotný, ani v přítomnosti OL nevyvolal změny mRNA L-FABP. Rovněž po inkubaci s oběma inhibitory jsme nezaznamenali žádné rozdíly v relativní expresi mRNA L-FABP (Obr. 15A). Jiným způsobem porovnání jsme zjistili, že ActD v přítomnosti kyseliny olejové (OL + Act) a vysoké glukózy (Gv) destabilizoval mRNA L-FABP (84% oproti OL v přítomnosti Gv; p < 0,05) (Obr. 15C). CHX samotný způsobil mírný nárůst mRNA L-FABP po inkubaci s nulovou (G0 na 113%; p < 0,05) a normální koncentrací glukózy (Gn na 119%; p < 0,05). Inkubace buněk spolu s OL + CHX způsobila zvýšení nezávisle na koncentraci glukózy (na 132%, 114% a 112% pro G0, Gn a Gv oproti kontrole; p < 0,05) (Obr. 15B). Jiným způsobem porovnání (Obr. 15D) jsme konstatovali, že mírné zvýšení mRNA L-FABP zaznamenané v přítomnosti OL + CHX a Gv na obr. 15B není statisticky významné.
[pic][pic] [pic]
[pic]
Obr. 15. Vliv kyseliny olejové a glukózy na mRNA L-FABP v přítomnosti aktinomycinu D a cykloheximidu. (A; C) Účinek inhibitoru ActD a současný účinek inhibitorů ActD + CHX na relativní expresi L-FABP. (B; D) Účinek inhibitoru CHX na relativní expresi L-FABP.
(A; B) T-test (*) p < 0,05 oproti kontrole s příslušnou hladinou glukózy (G0; Gn; Gv = 100%). (C; D) T-test (*) p < 0,05. Naměřené hodnoty před aplikací inhibitorů byly definovány jako 100 % (K; OL + G0; OL + Gn; OL + Gv = 100%).
(A; B; C; D) Vzájemné rozdíly všech skupin pak byly hodnoceny ještě pomocí analýzy ANOVA a post hoc testu (#) p < 0,05. Hodnoty vyjadřují průměr tří nezávislých experimentů ± SD.
4. Vliv dehydroepiandrosteronu (DHEA)
DHEA má pozitivní účinky na redukci tělesné hmotnosti a je tak nadějným prostředkem v boji proti obezitě. DHEA je známým induktorem jaterních peroxisomů, zatímco jeho vliv na L-FABP a izoformu PKC-ε nebyl dosud zkoumán. Použili jsme fyziologické (1 µM) a suprafyziologické (100 µM) koncentrace DHEA k ovlivnění hepatomových buněk HepG2 po dobu 2, 12 a 20 hod. Ovlivnění 1 µM DHEA nevedlo na úrovni mRNA k žádným signifikantním změnám (data nejsou uvedena), zatímco 100 µM DHEA vedla k upregulaci mRNA PPAR-α a PKC-ε, a naopak k downregulaci mRNA L-FABP (Obr. 16A). Úroveň mRNA PPAR-α a PKC-ε stoupla po 12 hodinách na 159%, resp. na 193% (p < 0,05). Po 20 hodinách ovlivnění DHEA jsme pozorovali nárůst exprese mRNA PKC-ε až na 296% (p < 0,05), zatímco exprese mRNA PPAR-α zůstala oproti 12 hodinovému intervalu nezměněna (157%; p < 0,05). Na rozdíl od tohoto zvýšení exprese jsme po 12 hodinách působení 100 µM DHEA zaznamenali signifikantní pokles exprese mRNA L-FABP (76%, p < 0,05). K dalšímu snížení až na 46% (p < 0,05) oproti kontrole došlo po 20 hodinové inkubaci. Stimulace 100 µM DHEA po dobu 2 hodin neovlivnila koncentraci mRNA žádného ze sledovaných proteinů (Obr. 16A). Koncentrace proteinů ve frakcích byla stanovena po 2 a 20 hodinách ovlivnění 100 µM DHEA, ale naměřené změny nebyly signifikantní (Obr. 16B).
[pic]
[pic]
Obr. 16. Vliv DHEA na aktivaci a relativní expresi mRNA sledovaných složek. (A) Změny exprese mRNA po inkubaci s DHEA. (B) Distribuce proteinů mezi buněčnými kompartmenty vyjádřená jako poměr denzit membránové a cytosolové frakce (mem/cyt), resp. jaderné a cytosolové frakce (jad/cyt). T-test (*) p < 0,05 proti kontrole (100% pro buňky inkubované bez DHEA). Hodnoty vyjadřují průměr tří nezávislých experimentů ± SD.
5. Stanovení mechanismu účinku DHEA
Dále nás zajímalo, zda DHEA ovlivňuje expresi genů na úrovni transkripce anebo se uplatní posttranskripční modifikace, jako je změna stability mRNA. Buňky jsme inkubovali 12 hodin se 100 µM DHEA a poté jsme do média přidali 4 μg/ml ActD na 2,5 hodiny, 5 hodin a 8 hodin. Křivky znázorňující úbytek mRNA po přidání ActD jsou zobrazeny na obr. 17.
Přítomnost DHEA zpomalila úbytek mRNA PKC-ε způsobený ActD (63% pro PKC-ε_DHEA oproti 42% pro PKC-ε_K po 2,5 hod s ActD; p < 0,05), zatímco pokles mRNA PPAR-α zůstal v přítomnosti DHEA nezměněn (80% pro PKC-ε_K a 83% pro PKC-ε_DHEA po 2,5 hod s ActD; p < 0,05). Přestože se hodnoty pro mRNA L-FABP naměřené v přítomnosti ActD a DHEA signifikantně lišily od hodnot naměřených pouze v přítomnosti ActD (113% pro PKC-ε_K a 102% pro PKC-ε_DHEA po 2,5 hod s ActD; p < 0,05), nezpůsobil inhibitor ActD pokles exprese mRNA L-FABP u žádného ze vzorků (Obr. 17).
[pic]
Obr. 17. Vliv DHEA na mRNA stabilitu sledovaných složek v přítomnosti inhibitoru transkripce aktinomycinu D. Naměřené hodnoty před aplikací ActD byly definovány jako 100 %. Pomocí t-testu pak byly porovnány hodnoty naměřené v HepG2 ovlivněných pouze ActD (kontrola; K) proti kombinaci ActD a DHEA; (*) p < 0,05. Hodnoty vyjadřují průměr tří nezávislých experimentů ± SD.
Buňky byly inkubovány také 20 hodin s CHX anebo s CHX a DHEA (Obr. 18). CHX způsobil výrazný pokles exprese mRNA PPAR-α (20% oproti kontrole; p < 0,05). Také v přítomnosti DHEA + CHX jsme zaznamenali signifikantní pokles exprese mRNA PPAR-α až na 47% (p < 0,05) ve srovnání s kontrolou i se vzorky inkubovanými pouze s DHEA (152%; p < 0,05). CHX také způsobil úbytek bazální exprese mRNA L-FABP na 74% (p < 0,05) oproti kontrole. Na rozdíl od PPAR-α došlo po inkubaci s DHEA a CHX k dalšímu snížení exprese mRNA L-FABP až na 54% (p < 0,05) oproti kontrole i CHX samotnému, které se nelišilo od inkubace s DHEA (51%; p < 0,05). Exprese mRNA PKC-ε vlivem CHX vzrostla na 126% (p < 0,05) oproti kontrole, ale přesto je tento nárůst stále signifikantně nižší než nárůst v případě DHEA + CHX (173%; p < 0,05). Proto, na rozdíl od PPAR-α a L-FABP, je mRNA PKC-ε stabilizována po zablokování syntézy proteinů.
[pic]
Obr. 18. Vliv DHEA na mRNA stabilitu sledovaných složek v přítomnosti inhibitoru translace cykloheximidu. T-test (*) p < 0,05 oproti kontrole. Vzájemné rozdíly všech skupin pro každý gen (PPAR-α, L-FABP a PKC-ε) a interval 20h pak byly hodnoceny metodou ANOVA a post hoc testu (#) p < 0,05. Hodnoty vyjadřují průměr tří nezávislých experimentů ± SD.
7. Diskuze
Mezi faktory ovlivňující rozvoj civilizačních onemocnění patří zvýšené hladiny FA, ale také nízké hladiny hormonu DHEA, jehož účinky jsou považovány za protektivní proti rozvoji diabetu, aterosklerózy, obezity a dalších civilizačních chorob (Campbell et al. 2004; Webb et al. 2006). V provedené studii jsme na úrovni proteinů a také mRNA sledovali vliv OL spolu s různými koncentracemi glukózy a vliv hormonu DHEA na členy signálních kaskád energetického metabolismu.
Za účelem detekce izoforem PKC v cytosolových a membránových frakcích jsme na Ústavu patologické fyziologie nově zavedli metodu buněčné frakcionace a imunodekce za použití chemiluminiscenčního substrátu. Neaktivní PKC se za fyziologických podmínek nacházejí v buňkách převážně v cytosolové frakci. Charakteristickým rysem aktivace PKC je právě jejich vratné, ale specifické ukotvení do buněčných membrán – tzv. translokace PKC. Celková metoda stanovení translokace, která zahrnuje kultivaci, ovlivnění stimulanty, buněčnou frakcionaci, Western blotting a imunodetekci s denzitometrickým vyhodnocením, byla testována pomocí forbol myristát acetátu (PMA), který je známým aktivátorem PKC (Obr.11).
V první části této studie byl proveden screening vlivu FA na translokaci a expresi PKC-(. PKC-( patří do rodiny serin-threoninových proteinkináz, které se podílí na regulaci metabolismu tuků a sacharidů.
Pro ovlivnění hepatomových buněk HepG2 byly použity nasycené kyseliny palmitová (PA) a stearová (ST), a mononenasycená kyselina olejová (OL). Běžně se koncentrace FA v plazmě zdravých lidí pohybuje kolem 300-400 µmol/l, zatímco u jedinců s inzulínovou rezistencí stoupá až k hodnotám 500-800 µmol/l (Kashyap SR, 2004). Koncentrace FA v médiu jsme v případě tohoto pokusu zvolili po 100 μM. Pilotní studie ovšem neodhalila žádné významné změny jak na hladině mRNA PKC-(, tak ani na proteinové úrovni (Obr. 10). Translokaci aktivované PKC-( do membránové frakce jsme ověřili po ovlivnění PMA (Obr. 11). Již dříve bylo popsáno, že dlouhodobá inkubace buněk s PMA vede ke snížení celkového množství PKC (Maloney et al. 1998). To se po 20 hod stimulace potvrdilo poklesem jak v cytosolové, tak i v membránové frakci (Obr. 11A). Podobnou tendenci jsme pozorovali také po 20-hodinovém působení PA, ST a OL (Obr. 10A).
V plazmě se vyskytují nasycené a nenasycené FA, ale i rozvětvené a trans-FA, jejichž přítomnost závisí buď na jejich zastoupení v přijaté potravě nebo při nedostatku příjmu energie na jejich uvolnění z tukových zásob. Podstatnou část, asi 70% celkového množství FA v plazmě tvoří mononenasycecená OL spolu s nasycenými FA (PA a ST). V naší práci jsme se pokusili ověřit a rozšířit výsledky studií jiných autorů, kteří se rovněž zabývali kyselinou olejovou a její úlohou v metabolismu.
Účinky FA a glukózy jsou v převážné většině studií sledovány odděleně. Přitom hyperglykémie i vysoké koncentrace volných FA v plazmě jsou rizikovými faktory pro rozvoj diabetu 2. typu a metabolického syndromu a často se vyskytují zároveň. Synergický účinek zvýšených koncentrací glukózy a nasycených FA byl dosud zkoumán převážně v β-buňkách, kde krátké ovlivnění vedlo ke zvýšení sekrece inzulínu, zatímco dlouhodobé ovlivnění způsobilo snížení citlivosti, potlačení sekrece inzulínu a indukovalo apoptózu (El-Assaad et al. 2003; Newsholme et al. 2007).
Abychom lépe prostudovali vliv obou faktorů v hepatomové linii HepG2, inkubovali jsme buňky s 300 µM kyselinou olejovou spolu s různými koncentracemi glukózy a sledovali vliv stimulantů na expresi a translokaci proteinů PKC-ε, PPAR-α a L-FABP, které jsou součástí energetického metabolismu.
Po 30 minutové inkubaci s OL jsme pozorovali translokaci PKC-ε z cytosolu do membrán a to v přítomnosti jak nulové (OL + G0), normální (OL + Gn) i vysoké (OL + Gv) koncentrace glukózy, zatímco po 4 hodinách inkubace došlo k přesunu PKC-ε z membrán zpět do cytosolu, jak je vidět ze snížených hodnot podílů frakcí na obr. 12A. K relokalizaci docházelo také po 4 hodinách inkubace v médiu bez OL a glukózy (G0). Dále jsme zjistili, že významné rozdíly mezi oběma intervaly jsou pouze u vzorků ovlivněných kyselinou olejovou. Z těchto výsledků vyvozujeme, že translokace PKC-ε do membrán je vyvolaná akutní zvýšenou hladinou kyseliny olejové, zatímco po delší 4-hodinové inkubaci dochází k návratu do cytosolu. Dále tyto výsledky naznačují, že pozorované translokace nejsou závislé na koncentraci glukózy. Vyšší, statisticky významné hodnoty podílů membránových a cytosolových frakcí PKC-ε po 30 minutách inkubace s kyselinou olejovou oproti 4 hodinám jsou v souladu s výsledky předchozích studií, kde OL vyvolávala translokaci PKC již během prvních 10-20 minut jejího působení (Diaz-Guerra et al. 1991). Porovnáním skupin se stejnou koncentrací glukózy jsme zjistili signifikantní změnu po 30 minutovém ovlivnění OL v přítomnosti vysoké (OL + Gv) a normální (OL + Gn) koncentrace glukózy (Obr. 12A, signifikace označené plným kolečkem). Samotná kyselina olejová tak způsobuje translokaci PKC-ε v přítomnosti jak normální (Gn), tak i vysoké glukózy (Gv). Naopak za podmínek G0 vyvolává OL signifikantní změnu pouze proti Gn, zatímco vzhledem k G0 není změna signifikantní. Měření relativní exprese mRNA PKC-ε ovšem neukázalo žádné statisticky významné změny ani v jednom časovém intervalu (Obr. 13A,B). Kyselina olejová tedy ovlivňuje PKC-ε především na proteinové úrovni.
PPAR-α se vyskytuje především v játrech, kde reguluje expresi genů, jejichž produkty jsou enzymy nezbytné pro oxidaci FA, transport lipidů a glukoneogenezi. PPAR-α aktivuje transkripci genů v přítomnosti svých ligandů, mezi které patří FA (Krey et al. 1997; Blanquart et al. 2004). Je mu také připisována klíčová role v odpovědi na hladovění (Hashimoto et al. 2000; Kersten et al. 1999). Fujiwara et al. (2003) popsal 1,4 násobný pokles mRNA PPAR-α po 24hodinové inkubaci buněk HepG2 s 250 µM OL v přítomnosti normální koncentrace glukózy a 10% FBS. Na rozdíl od citované práce, byl v naší studii hormonální vliv, který reguluje rovnováhu mezi nasyceností a hladověním, omezen na 1% FBS a délka stimulace byla 30 minut a 4 hodiny. Signifikantní pokles exprese mRNA PPAR-α oproti kontrole Gn jsme zaznamenali po 4 hodinách inkubace s 300 µM OL a nulovou glukózou (OL + G0). Tento účinek kyseliny olejové jsme nepozorovali v přítomnosti normální (OL + Gn) ani vysoké (OL + Gv) hladiny glukózy (Obr.13B). Tyto protichůdné výsledky oproti výše zmíněné práci jsou pravděpodobně způsobeny rozdílnými experimentálními podmínkami. Dále jsme konstatovali, že tento pokles PPAR-α byl vyvolaný přítomností obou faktorů, tzn. OL i absencí glukózy, současně. V přítomnosti vysoké koncentrace glukózy vyvolala kyselina olejová (OL + Gv) statisticky významný nárůst hladiny mRNA PPAR-α vzhledem k Gv (Obr. 13B). Žádné signifikantní změny jsme nepozorovali v distribuci PPAR-α mezi cytosolovou a jadernou frakcí (Obr. 12B).
Působení ActD vedlo k poklesu mRNA PPAR-α pouze v případě Gv (Obr. 14A), zatímco v přítomnosti OL + Gv + ActD již pokles hladiny mRNA PPAR-α nebyl pozorován. Po vyhodnocení vlivu ActD a následného porovnání skupin na obr. 14C vyšlo najevo, že inkubace buněk s OL + ActD spolu s G0 nebo Gv stabilizuje mRNA PPAR-α oproti buňkám ovlivněným normální koncentrací glukózy. Výsledky naznačují, že absence glukózy nebo naopak zvýšená koncentrace glukózy spolu s OL stabilizuje mRNA PPAR-α. Z experimentů s inhibitorem translace CHX jsme pak zjistili, že pro udržení bazálního stavu PPAR-α je vyžadována syntéza proteinů v prostředí G0 a Gv (Obr.14B). Pokles zůstal nezměněn i v přítomnosti OL + CHX. Po vyhodnocení vlivu CHX a následného porovnání skupin (Obr. 14D) jsme zjistili, že změna relativní exprese PPAR-α po ovlivnění OL + CHX v přítomnosti G0 není signifikantní a tedy pokles na obr. 14B není vyvolaný působením CHX. To naznačuje, že OL + G0 může způsobovat pokles exprese PPAR-α i jiným mechanismem, než je de novo syntéza proteinů. Použití inhibitorů translace a transkripce tedy nevysvětlilo signifikantní pokles mRNA PPAR-α pozorovaný v přítomnosti OL + G0 (Obr. 13B). Abychom objasnili tento pokles, rozhodli jsme se inkubovat buňky v přítomnosti obou zmíněných inhibitorů současně.
Z grafu na Obr. 14A, C je zřejmé, že současné zablokování transkripce i translace vyvolalo superindukci mRNA PPAR-α. Tento jev, vyvolaný vlivem obou inhibitorů není ojedinělý. Podobné chování bylo popsáno ve studii Vercauteren et al. 2006, kde byla mRNA PRC v přítomnosti ActD spolu s CHX významně stabilizována. Vzhledem k tomu, že samotný ActD nevyvolal žádné významné změny relativní exprese mRNA PPAR-α a samotný CHX způsobil pokles sledované mRNA, je interpretace pozorované superindukce komplikovaná. Naše pozorování naznačuje, že použití inhibitorů transkripce a translace současně nevede k součtu účinků jednotlivých inhibitorů. Mechanismus pozorované superindukce zůstává prozatím nejasný. Mechanismus vlivu OL v přítomnosti G0 na mRNA PPAR-α by mohlo vysvětlit negenomické působení OL, které zahrnuje aktivaci signálních drah. K potvrzení tohoto mechanismu je zapotřebí provést další výzkum.
Zatímco funkci extracelulárního přenašeče FA zastává albumin, intracelulárním přenašečem je FABP. Vyskytuje se převážně v cytosolu, ale může být přítomen i v jaderné frakci, do které putuje zřejmě pouze s navázaným ligandem (Bordewick et al. 1989; Boord et al. 2002), kterým můžou být FA a také farmaka (Banner et al. 1993). Bylo například zjištěno, že L-FABP v přítomnosti 500 µM OL interaguje s jádry jaterních buněk potkanů (Lawrence et al. 2000). Jiná studie popsala nárůst mRNA L-FABP v hepatomové buněčné linii FAO po inkubaci s 320 µM OL (Meunier-Durmort et al. 1996).
L-FABP se běžně vyskytuje v cytosolu v koncentraci až 100-krát vyšší než v jádrech buněk, zatímco PPAR-α se vyskytuje především v jádrech hepatocytů (Wolfrum et al. 2001). V práci Wolfrum et al., 2001 jsou zmíněny dva potenciální mechanismy, kterými by se mohl L-FABP účastnit signální dráhy PPAR-α. První z nich naznačuje možnost, že L-FABP způsobuje pokles signálních molekul v cytosolu a je tedy negativním regulátorem aktivace PPAR-α v jádře (tzn. ke zvýšení aktivace PPAR-α dochází při snížené koncentraci L-FABP). Jiný možný mechanismus předpokládá pozitivní korelaci mezi aktivací PPAR-α a koncentraci L-FABP (tzn. L-FABP transportuje signální molekuly do jádra, kde aktivují PPAR-α). Autoři článku Wolfrum et al. 2001 popisují na modelu primárních myších hepatocytů protein-proteinovou interakci L-FABP a PPAR-α, ke které dochází po přenosu signální molekuly (např. FA) pomocí L-FABP do jádra a vede k aktivaci PPAR-α. Výsledky studie vedly tyto autory k závěru, že L-FABP je pozitivním regulátorem PPAR-α.
Za našich podmínek jsme nepozorovali žádnou translokaci L-FABP do jader po 30 minutách ani po 4 hodinách inkubace s 300 µM OL a různými koncentracemi glukózy (Obr. 12C). Na grafech a reprezentativních blotech vidíme, že ke změně lokalizace proteinů L-FABP a PPAR-α nedošlo ani po ovlivnění různými koncentracemi glukózy, ani po ovlivnění kyselinou olejovou (Obr. 12B, C, D). Stejně tak jsme nepozorovali zvýšení exprese PPAR-α, což by podle teorie pozitivní regulace byla adekvátní odpověď na přítomnost FA v jádře. V hepatomové linii HepG2 jsme zaznamenali mírně, ale signifikantně zvýšenou expresi mRNA L-FABP po 4 hodinách v přítomnosti OL + G0. Tento mírný nárůst je opět vyvolaný kombinací obou stimulantů, tak jako tomu bylo v případě PPAR-α (Obr. 13B). Nárůst exprese mRNA L-FABP byl ovšem doprovázen poklesem exprese PPAR-α. Výsledky naší práce se tedy přiklání spíše k mechanismu negativní regulace PPAR-α. Tento rozpor s výsledky výše zmíněných autorů vysvětluje jiný buněčný model a odlišně zvolené experimentální podmínky.
Vzájemným porovnáním vzorků s různou koncentrací glukózy a po inkubaci s OL + ActD + CHX vyšlo najevo, že změna relativní exprese L-FABP byla signifikantně nižší v prostředí Gn a Gv oproti G0. Také po stimulaci ActD + OL v prostředí Gv byla změna exprese nižší než v prostředí G0 (Obr. 15C). OL v prostředí G0 tedy stabilizuje mRNA L-FABP v porovnání s Gv. Z obr. 15B, D vyplývá, že bazální hladina mRNA L-FABP je závislá na syntéze proteinů v přítomnosti G0 a Gn. Přítomnost OL + CHX + G0 vedla ke zvýšení hladiny mRNA L-FABP vzhledem k CHX + G0, což naznačuje, že pozorovaný nárůst na obr. 13B způsobuje OL stimulací transkripce, což se ale po stimulaci ActD nepotvrdilo (Obr. 15C).
Druhá část této práce je věnována studiu účinků 100 μM DHEA na expresi mRNA PPAR-α, L-FABP a PKC-ε. Zároveň jsme sledovali vliv DHEA na distribuci proteinů mezi buněčnými kompartmenty. Mnoho údajných prospěšných účinků DHEA, např. antiadiabetických a proti obezitě, připomíná účinky moderních antilipidemických a antidiabetických léků. Tyto léky, fibráty a thiazolidindiony, jsou známy tím, že aktivují PPAR (Depreter et al. 2002; Yen 2001). Bylo zjištěno, že také DHEA aktivuje PPAR-α (Peters et al. 1996; Yen 2001). PPAR-α je hlavní izoformou PPAR v játrech a stimuluje jak mitochondriální, tak i peroxisomální oxidační procesy (shrnuto v Ferré 2004; Francis et al. 2003). V naší práci jsme pozorovali zvýšenou expresi mRNA PPAR-α po inkubaci buněk HepG2 s DHEA (Obr. 16A), což potvrzuje data zveřejněna jinými autory (Apostolova et al. 2005; Peters et al. 1996; Yen 2001). Navíc jsme s využitím inhibitorů ActD a CHX zjistili, že převládajícím faktorem odpovídajícím za pozorované zvýšení mRNA PPAR-α po aplikaci DHEA je stimulace transkripce (Obr. 17), zatímco stabilita mRNA PPAR-α je závislá na syntéze proteinů (Obr. 18).
Dřívější práce několika autorů referovaly o změnách ve složení tuků v játrech, plazmě i ve svalech potkanů po podání DHEA (Imai et al. 1999; Abadie et al. 2000). Jedna z prací informovala o nahromadění OL v játrech způsobené DHEA, zatímco v plazmě se množství OL nezměnilo, naopak byly v plazmě pozorovány nížší hladiny TG (Imai et al. 1999). Zajímalo nás, jestli DHEA také ovlivňuje expresi anebo translokaci L-FABP, který slouží jako přenašeč FA v játrech. Zatímco po 2 hod se exprese mRNA L-FABP nezměnila, 12-ti hodinová inkubace vedla k poklesu mRNA L-FABP na 76% a po 20 hodinách až na 46% oproti kontrole (Obr. 16A). Na úrovni proteinů jsme nezaznamenali žádné změny (Obr. 16B).
Inkubace s inhibitorem transkripce překvapivě nevedla k rozpadu mRNA L-FABP ani po 8 hod v přítomnosti ActD (Obr. 17). Tento jev, kdy ActD inhibuje destabilizaci mRNA a dokonce může mRNA stabilizovat byl pozorován u těch mRNA, které obsahují na svém 3‘-konci sekvence bohaté na adenin a uracil, tzv. ARE (AU-rich element) (Chen et al. 1995). Jinou příčinou chování mRNA L-FABP v přítomnosti ActD může být negenomické působení DHEA. Účinek steroidů zprostředkovaný negenomickou cestou je na rozdíl od genomického účinku rychlý a neovlivňuje expresi genů, ale aktivuje signální kaskády, což vede k rychlejší odezvě na podnět (Lösel and Wehling 2003). Účinek zprostředkovaný negenomickým mechanismem tak nemůže být oslaben inhibitorem transkripce ani translace, tak jako jsme pozorovali u mRNA L-FABP (Obr. 17, 18). Jestli je chování mRNA L-FABP v přítomnosti inhibitorů výsledkem negenomického působení DHEA anebo je důsledkem výskytu specifických úseků ARE bude předmětem dalšího výzkumu.
PKC jsou považovány za jeden z klíčových mediátorů inzulínové rezistence. DHEA je zase známý svými protektivními účinky v rozvoji inzulínové rezistence. Data jiných autorů ukazují, že DHEA může aktivovat izoformy PKC. Například fosforylace PKC ζ/λ vyvolaná inzulínem v kosterních svalech potkanů dále vzrostla u zvířat, kterým byl aplikován DHEA (Campbell et al. 2004). Bylo také popsáno, že DHEA vyvolává translokaci PKC-β a PKC-ζ z cytosolu do membrán adipocytů a následně zvyšuje absorpci glukózy v adipocytech potkanů (Ishizuka et al. 1999; Kajita et al. 2000). V buňkách dřeně nadledvin byla zjištěna snížená fosforylace PKC α/β způsobená nedostatkem séra obnovena v přítomnosti DHEA (Charalampopoulos et al. 2004). Tyto a další dosud publikované studie nebyly provedeny v hepatocytech a jejich autoři se zaměřili pouze na konvenční a atypické izoformy PKC, zatímco my jsme sledovali účinek DHEA na PKC-ε, která patří do skupiny tzv. nových izoforem PKC.
Ačkoliv jsme na úrovni proteinů nenalezli statisticky významné změny PKC-ε po 2 hod ani po 20 hod ovlivnění 100 µM DHEA (Obr. 16B), jinak tomu bylo na úrovni mRNA, kde po 20 hodinách došlo až k 3-násobnému zvýšení exprese mRNA PKC-ε (Obr. 16A) oproti kontrole.
Mechanismus, kterým DHEA zvyšuje expresi mRNA PKC-ε, jsme zkoumali pomocí inhibitorů transkripce a translace. Buňky inkubované pouze s ActD vykazují nejrychlejší rozpad mRNA PKC-ε vzhledem k ostatním sledovaným proteinům (Obr. 17; poločas 2 hod). Přítomnost DHEA částečně stabilizovala mRNA PKC-ε a zvýšila její poločas na 4 hod. Ovlivnění buněk hormonem DHEA spolu s CHX vede k mírnému, avšak statisticky významnému poklesu mRNA PKC-ε. To naznačuje, že nárůst exprese mRNA PKC-ε po inkubaci s DHEA je řízen nejen na úrovni transkripce, ale DHEA rovněž indukuje syntézu stabilizačních proteinů.
8. SOUHRN
Cílem experimentální části práce bylo prostudovat vliv 300 μM kyseliny olejové v přítomnosti nulové (G0), normální (Gn) a vysoké (Gv) koncentrace glukózy a dále působení 100 μM DHEA na expresi mRNA PKC-ε, PPAR-α a L-FABP metodou RT-PCR v hepatomových buňkách HepG2. Současně byl sledován účinek výše zmíněných stimulantů na distribuci proteinů PKC-ε, PPAR-α a L-FABP mezi buněčnými kompartmenty. Pro tento účel byla na našem pracovišti zavedena metoda buněčné frakcionace s následnou imunodetekcí. Metoda stanovení translokace PKC-ε byla ověřena pomocí PMA, známého aktivátoru PKC.
V pilotní studii jsme zkoumali vliv 100 μM PA, ST a OL na expresi a translokaci PKC-ε, ale žádné statisticky významné změny nebyly pozorovány. Dále jsme se proto zaměřili na výzkum účinků OL, která je hlavní cirkulující mastná kyselina v krvi.
Buňky HepG2 jsme ovlivnili vyšší, 300 μM koncentrací OL za podmínek G0, Gn a Gv v intervalech 30 minut a 4 hodiny. Zjistili jsme, že 30minutová stimulace OL vyvolává translokaci PKC-ε z cytosolu do membrán, a tak OL ovlivňuje PKC-ε především na proteinové úrovni. Na rozdíl od PKC-ε, OL nevyvolala translokaci PPAR-α ani L-FABP, ale ke změnám docházelo především na úrovni mRNA. K nejvýraznější změně došlo po 4hodinové stimulaci OL + G0, kdy se snížila exprese mRNA PPAR-α a zvýšila exprese mRNA L-FABP.
Mechanismus účinků OL na PPAR-α a L-FABP jsme sledovali po inkubaci buněk s inhibitory transkripce (ActD) a translace (CHX). Zablokování syntézy mRNA inhibitorem ActD odhalilo, že OL za podmínek G0 a Gv stabilizuje mRNA PPAR-α. Dále jsme demonstrovali, že de novo syntéza proteinů je vyžadována pro udržení bazálního stavu PPAR-α. Následné zablokování transkripce i translace současně vyvolalo superindukci mRNA PPAR-α. Použití obou inhibitorů současně nevede k součtu jejich účinků na expresi mRNA PPAR-α a L-FABP. Výsledky experimentu s inhibitory tedy dostatečně neobjasnili mechanismus sledovaných změn. Pokles mRNA PPAR-α a nárůst L-FABP v přítomnosti OL + G0 by mohl být vysvětlen aktivací signálních drah. K potvrzení tohoto mechanismu je zapotřebí provést další výzkum.
Dále jsme se zkoumali účinky a mechanismus působení 100 μM DHEA. Naměřené změny koncentrace sledovaných proteinů ve frakcích nebyly signifikantní. Prodloužené 12hod a 20hod inkubace buněk HepG2 s DHEA vedly ke zvýšené expresi mRNA PPAR-α, což potvrzuje data zveřejněná jinými autory. S využitím inhibitorů ActD a CHX jsme zjistili, že převládajícím faktorem odpovídajícím za pozorované zvýšení je stimulace transkripce. Zároveň jsme v obou prodloužených časových intervalech pozorovali zvýšení exprese mRNA PKC-ε a naopak snížení exprese mRNA L-FABP. Při studiu mechanismu těchto účinků jsme zjistili, že inkubace buněk HepG2 s ActD nevedla k rozkladu, ale ke stabilizaci mRNA L-FABP. Jestli je chování mRNA L-FABP v přítomnosti inhibitorů výsledkem negenomického působení DHEA anebo je důsledkem existence specifických úseků ARE bude předmětem dalšího výzkumu. U buněk inkubovaných pouze s ActD jsme pozorovali vzhledem k ostatním sledovaným proteinům nejrychlejší rozpad mRNA PKC-ε, který byl významně zpomalen v přítomnosti DHEA. Po inkubaci s inhibitorem CHX jsme zjistili, že na rozdíl od PPAR-α a L-FABP je mRNA PKC-ε po zablokování syntézy proteinů stabilizována. To naznačuje, že nárůst exprese mRNA PKC-ε po inkubaci s DHEA je řízen nejen na úrovni transkripce, ale rovněž na úrovni translace.
V této práci jsme demonstrovali účinky OL a DHEA na expresi mRNA a distribuci proteinů PKC-ε, PPAR-α a L-FABP, a zároveň jsme se pokusili získat více informací o mechanismu, kterým jsou pozorované změny způsobeny. Získaná data naznačují, že samotná transkripce není odpovědná za všechny pozorované změny na úrovni mRNA. Domníváme se, že OL, DHEA i glukóza mohou vést ke spuštění specifických stabilizačních a degradačních odpovědí u sledovaných mRNA. K objasnění uvedených nálezů na úrovni proteinů i genové exprese je potřeba provést další experimenty, které umožní lépe pochopit mechanismy regulace energetických substrátů a hormonu DHEA.
9. SUMMARY
To investigate the effects of 300 μM oleic acid (OL) in combination with different glucose levels and 100 μM dehydroepiandrosterone (DHEA) on PKC-ε, PPAR-α and L-FABP mRNA levels, we conducted quantitative real time RT-PCR study in hepatoma HepG2 cells. In addition, the proteins translocation between cell compartments was detected as well. For this purpose, the method of cell fractionation with subsequent immunodetection was established in our department. The method was verified by PMa, a known activator of PKC.
The HepG2 cells were incubated in the presence of 100 μM PA, ST and OL to reveal changes on the mRNA and protein levels of PKC-ε but we did not find any significant changes. Then we focused on the effects of OL that is the main circulating fatty acid in blood.
The HepG2 cells were affected by higher 300 μM OL for 30 minutes and 4 hours under the conditions of G0 (zero glucose), Gn (normal glucose) a Gv (high glucose). The 30-minute incubation led to the PKC-ε translocation to the membranes thus OL affected PKC-ε especially on the protein level. Contrary to PKC-ε, 30-minutes and 4-hours incubation did not lead to PPAR-α even L-FABP translocation while significant changes were observed on mRNA levels. The 4-hours stimulation with OL + G0 significantly suppressed PPAR-α mRNA level and mild enhanced L-FABP mRNA expression.
The inhibitors of transcription (ActD) and translation (CHX) were used to reveal the mechanism of the OL action on PPAR-α and L-FABP mRNA expression. In terms of G0 and Gv, ActD significantly stabilized PPAR-α mRNA content. We also demonstrated that in the presence of G0, de novo protein synthesis is required to maintain PPAR-α basal level. The inhibition of both, transcription and translation, led to superinduction of PPAR-α mRNA. The superinduction is not equal to sum of effects of the single inhibitors. Thus, the results of the experiment were not sufficient to elucidate the mechanism of OL. The decrease of mRNA PPAR-α and the increase of mRNA L-FABP in the presence of OL + G0 could be interpreted by an activation of signal transduction pathways. More research is needed to confirm this mechanism.
We subsequently investigated the effects and mechanism of 100 μM DHEA action. The changes of proteins concentration measured in fractions were not significant. Prolonged 12 hours and 20 hours incubations of HepG2 cells with DHEA induced significant enhance of PPAR-α mRNA expression which is incompliance with others authors published data. The application of ActD and CHX revealed that transcription is a predominant factor responsible for observed elevation. At the same time, we observed an increase in PKC-ε mRNA expression and in contrast the decrease in L-FABP mRNA expression in both prolonged time period. We found out that HepG2 cells incubation with ActD did not induce decay but surprisingly the stabilization of mRNA L-FABP was observed. Additional experiments must be conducted to determine if this mRNA L-FABP behavior in the presence of inhibitors is a result of nongenomic action of DHEA or rather the result of a specific element ARE existence.The fastest decay of PKC-ε mRNA was observed in cells incubated with ActD. This decay was significantly slowed down in the presence of DHEA. Contrary to PPAR-α and L-FABP, the PKC-ε mRNA was stabilized in the presence of inhibitor CHX suggesting that the increase of PKC-ε mRNA in the presence of DHEA is under the control of both transcription and translation.
In this study we demonstrated the effects of OL and DHEA on the mRNA expression as well as on the distribution of PKC-ε, PPAR-α and L-FABP proteins. At the same time we attempted to obtain more information about the responsible mechanisms. The acquired data suggested that the transcription alone is not responsible for all observed changes on the level of mRNA. We suppose that OL, DHEA and glucose could trigger specific stabilizing and degradating responses of observed mRNAs. Further experiments are needed to clarify the mentioned findings on the protein and mRNA levels which would facilitate the understanding of mechanisms responsible for regulation of energetic substrates and DHEA hormone.
10. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
Abadie, J.M., et al. Dehydroepiandrosterone alters lipid profiles in Zucker rats. Lipids. 2000, vol. 35, no. 6, s. 613-620.
Abadie J.M., et al. Dehydroepiandrosterone alters Zucker rat soleus and cardiac muscle lipid profiles. Exp Biol Med (Maywood). 2001, vol. 226, no. 8, s. 782-789.
Akbiyik, F., et al. Ligand- and Species-Dependent Activation of PPARα. Cell Physiol Biochem. 2004, vol. 14, s. 269-276.
Aoki, K., et al. Dehydroepiandrosterone suppresses the elevated glucose-6-phosphatase and fructose-1,6-bisphosphatase activities in C57BL/Ksj-db/db mice. Diabetes 1999, vol. 48, s. 1579–1585.
Aoki, K., et al. Prevention of diabetes, hepatic injury, and colon cancer with dehydroepiandrosterone. J Steroid Biochem Mol Biol. 2003, vol. 85, no. 2-5, s. 469-472.
Aoki, K., et al. Dehydroepiandrosterone decreases elevated hepatic glucose production in C57BL/KsJ-db/db mice. Life Sci. 2004, vol. 74, no. 25, s.3075-3084.
Apostolova, G., et al. Dehydroepiandrosterone inhibits the amplification of glucocorticoid action in adipose tissue. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2005, vol. 288, s. E957–E964.
Arlt, W., Hewison, M. Hormones and immune function: implications of aging. Aging Cell 2004, vol. 3, no. 4, s. 209–216.
Auboeuf, D., et al.. Tissue distribution and quantification of the expression of mRNAs of peroxisome proliferator-activated receptors and liver X receptor -alpha in humans: no alteration in adipose tissue of obese and NIDDM patients. Diabetes 1997, vol. 46, s. 1319–1327.
Banner, C.D., et al. A systematic analytical chemistry/cell assay approach to isolate activators of orphan nuclear receptors from biological extracts: characterization of peroxisome proliferator-activated receptor activators in plasma. J Lipid Res. 1993, vol. 34, s. 1583-1591.
Bauer, M., Hamm, A., Pankratz, M.J. Linking nutrition to genomics. Biol Chem. 2004, vol. 385, s. 593–596.
Berdiev, B.K., et al. Protein kinase C isoform antagonism controls BNaC2 (ASIC1) function. J Biol Chem. 2002, vol. 277, s. 45734–45740.
Berge, R.K., et al. The metabolic syndrome and the hepatic fatty acid drainage hypothesis. Biochemie. 2005, vol. 87, no. 1, s. 15-20.
Bhatia, V., Viswanathan, P. Insulin resistance and PPAR insulin sensitizers. Curr Opin Investig Drugs. 2006, vol. 10, s. 891-897.
Blanquart, C., et al. The protein kinase C signaling pathway regulates a molecular switch between transactivation and transrepression activity of the peroxisome proliferator-activated receptor alpha. Mol Endocrinol. 2004, vol. 8, s. 1906-1918.
Boden, G. Free fatty acids, insulin resistance, and type 2 diabetes mellitus. Proc Assoc Am Physicians. 1999, vol. 111, s. 241–248.
Boden, G., Laakso, M.. Lipids and Glucose in Type 2 Diabetes. What is the cause and effect? Diabetes Care. 2004, vol. 27, no. 9, s. 2253-2259.
Boord, J.B., Fazio, S., Linton, M.F. Cytoplasmic fatty acid-binding proteins: emerging roles in metabolism and atherosclerosis. Curr Opin Lipidol. 2002, vol. 13, s. 141-147.
Bordewick, U., et al. Compartmentation of hepatic fatty-acid-binding protein in liver cells and its effect on microsomal phosphatidic acid biosynthesis. Biol Chem Hoppe Seyler. 1989 vol. 370, no. 3, s. 229-238.
Braissant, O., et al. Differential expression of peroxisome proliferator-activated receptor (PPARs): tissue distribution of PPARalpha, -beta, and -gamma in the adult rat. Endocrinology 1996, vol. 137, s. 354–366.
Brindley, D.N., et al. Tumor necrosis factor-alpha and ceramides in insulin resistance. Lipids. 1999, vol. 34, Suppl, s. S85–S88.
Brown, J.M., et al. Trans-10, cis-12, but not cis-9, trans-11, conjugated linoleic acid attenuates lipogenesis in primary cultures of stromal vascular cells from human adipose tissue. J Nutr. 2001, vol. 131, s. 2316–2321.
Brown, J.M., McIntosh, M.K. Conjugated Linoleic Acid in Humans: Regulation of Adiposity and Insulin Sensitivity. J Nutr. 2003, vol. 133, s. 3041–3046.
Campbell, C.S., et al. The phosphatidylinositol/AKT/atypical PKC pathway is involved in the improved insulin sensitivity by DHEA in muscle and liver of rats in vivo. Life Sci. 2004, vol. 76, no. 1, s. 57-70.
Cantrell, D.A. Phosphoinositide 3-kinase signalling pathways. J Cell Sci. 2001, vol. 114, s. 1439−1445.
Caruso, M., et al. Activation and Mitochondrial Translocation of Protein Kinase C-δ Are Necessary for Insulin Stimulation of Pyruvate Dehydrogenase Complex Activity in Muscle and Liver Cells. J Biol Chem. 2001, vol. 276, s. 45088–45097.
Catania, R.A., et al.. Dehydroepiandrosterone restores immune function following trauma-haemorrhage by a direct effect on T lymphocytes. Cytokine 1999, vol. 11, s. 443– 450.
Chahal, J. et al. Regulation of Insulin-Response Element Binding Protein-1 in Obesity and Diabetes: Potential Role in Impaired Insulin-Induced Gene Transcription. Endocrinology 2008, in press.
Charalampopoulos, I., et al. Dehydroepiandrosterone and allopregnanolone protect sympathoadrenal medulla cells against apoptosis via antiapoptotic Bcl-2 proteins. PNAS 2004; vol. 101, s. 8209-8214.
Chawla, A., et al. PPARdelta is a very low-density lipoprotein sensor in macrophages. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2003, vol. 100, s.1268-1273.
CHEN, C.A., XU, N., SHYU, A. mRNA decay mediated by two distinct AU-rich elements from c-fos and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor transcripts: Different deadenylation kinetics and uncoupling from translation. Molecular and Cellular Biology. 1995, vol. 15, no. 10, s. 5777–5788.
Chen, S., et al. Oleate-induced decrease in hepatocyte insulin binding is mediated by PKC-d. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006, vol. 346, s. 931–937.
Choudhury, G.G. A Linear Signal Transduction Pathway Involving Phosphatidylinositol 3-Kinase, Protein Kinase Cε, and MAPK in Mesangial Cells Regulates Interferon-γ-induced STAT1α Transcriptional Activation. J Biol Chem. 2004, vol. 279, s. 27399 – 27409.
Clement, L., et al. Dietary trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid induces hyperinsulinemia and fatty liver in the mouse. J Lipid Res. 2002, vol. 43, s. 1400–1409.
Coleman, D.L., Leiter, E.H., Schwizer, R.W. Therapeutic effects of dehydroepiandrosterone (DHEA) in diabetic mice. Diabetes. 1982, vol. 31, s. 830-833.
Coleman, D.L., Schwizer, R.W., Leiter, E.H. Effect of genetic background on the therapeutic effects of dehydroepiandrosterone (DHEA) in diabetes-obesity mutants and in aged normal mice. Diabetes. 1984, vol. 33, no. 1, s. 26-32.
Considine, R.V., et al. Protein kinase C is increased in the liver of humans and rats with non-insulin-dependent diabetes mellitus: an alteration not due to hyperglycemia. J Clin Invest. 1995, vol. 95, s. 2938–2944.
Dempsey, E.C., et al. Protein kinase C isozymes and the regulation of diverse cell responses. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000, vol. 279, s. L429–L438.
Depreter, M., et al. Modulation of the peroxisomal gene expression pattern by dehydroepiandrosterone and vitamin D: therapeutic implications. J Endocrinol. 2002, vol. 175, s. 779–792.
Despres, J.P., Lemieux, I., Robins, S.J. Role of fibric acid derivatives in the management of risk factors for coronary heart disease. Drugs 2004, vol. 64, s. 2177-2198.
Díaz-Guerra, M.J., Junco, M., Bosca, L. Oleic acid promotes changes in the subcellular distribution of protein kinase C in isolated hepatocytes. J Biol Chem. 1991, vol. 266, s. 23568 –23576.
Dillon, J.S., et al. Dehydroepiandrosterone sulfate and beta-cell function: enhanced glucose-induced insulin secretion and altered gene expression in rodent pancreatic beta-cells. Diabetes. 2000, vol. 49, no. 12, s. 2012-2020.
Dillon, J.S. Dehydroepiandrosterone, Dehydroepiandrosterone Sulfate and Related Steroids: Their Role in Inflammatory, Allergic and Immunological Disorders. Current Drug Targets - Inflammation & Allergy 2005, vol. 4, s. 377-385.
Eckel, R.H., Grundy, S.M., Zimmet, P.Z. The metabolic syndrome. Lancet 2005, vol. 365, s. 1415–1428.
EL-ASSAAD, W., et al. Saturated Fatty Acids Synergize with Elevated Glucose to Cause Pancreatic β-Cell Death. Endokrinology. 2003, vol. 144, s. 4154–4163.
Feldstein, A.E., et al. Free Fatty Acids Promote Hepatic Lipotoxicity by Stimulating TNF-α Expression via a Lysosomal Pathway. Hepatology. 2004, vol. 40, s. 185–194.
Ferré, P. The biology of peroxisome proliferator–activated receptors. Relationship with lipid metabolism and insulin sensitivity. Diabetes 2004, vol. 53, Suppl 1, s. S43–S50.
Fievet, C., Fruchart, J.C., Staels, B. PPARalpha and PPARgamma dual agonists for the treatment of type 2 diabetes and the metabolic syndrome. Curr Opin Pharmacol. 2006, vol. 6, no. 6, s. 606-614.
Finck, B.N., Kelly, D.P. PGC-1 coactivators: inducible regulators of energy metabolism in health and disease. J Clin Invest. 2006, vol. 116, no. 3, 615-622.
Francis, G.A., et al. Nuclear receptors and the control of metabolism. Annu Rev Physiol 2003, vol. 65, s. 261-311.
Fujiwara, Y., et al. Analysis of comprehensive effects of polyunsaturated fatty acid on mRNA expression using a gene chip. J Nutr Sci Vitaminol, 2003, vol. 49, s. 125-132.
Gao, Z., et al. Inhibition of insulin sensitivity by free fatty acids requires activation of multiple serine kinases in 3T3-L1 adipocytes. Mol Endocrinol. 2004, vol. 18, no. 8, s. 2024-2034.
Glass, C.K., Rosenfeld, M.G. The coregulator exchange in transcriptional functions of nuclear receptors. Genes & Dev. 2000, vol. 14, no. 2, s. 121-141.
Glatz, J.F., van der Vusse, G.J. Cellular fatty acid-binding proteins: their function and physiological significance. Prog Lipid Res. 1996, vol.35, no. 3, s. 243-282.
Gottlicher, M. et al. Fatty acids activate a chimera of the clofibric acid-activated receptor and the glucocorticoid receptor. Proc Natl Acad Sci. 1992, vol. 89, s. 4653–4657.
Griffin, M.E., et al. Free fatty acid-induced insulin resistance is associated with activation of protein kinase C theta and alterations in the insulin signaling cascade. Diabetes. 1999, vol. 48, s. 1270–1274.
Grundy, S. M., et al. Definition of metabolic syndrome: Report of the National Heart, Lung, and Blood Institute/American Heart Association conference on scientific issues related to definition. Circulation 2004, vol. 109, s. 433-438.
Grundy, S. M., et al. Diagnosis and management of the metabolic syndrome: an American Heart Association/National Heart, Lung, and Blood Institute Scientific Statement. Circulation 2005, vol. 112, s. 2735-2752.
Gu, S., et al. Dehydroepiandrosterone affects the expression of multiple genes in rat liver including 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1: a cDNA array analysis. Mol Pharmacol. 2003, vol. 63, s. 722– 731.
Hajduch, E., et al. Ceramide impairs the insulin-dependent membrane recruitment of protein kinase B leading to a loss in downstream signalling in L6 skeletal muscle cells. Diabetologia. 2001, vol. 44, s. 173–183.
Harasawa, R., et al. Rapid detection and differentiation of the major mycoplasma contaminants in cell cultures using real-time PCR with SYBR Green I and melting curve analysis. Microbiol Immunol 2005, vol. 49, s.859-863.
Hashimoto, T., et al. Defect in peroxisome proliferator-activated receptor alpha-inducible fatty acid oxidation determines the severity of hepatic steatosis in response to fasting. J Biol Chem. 2000, vol. 275, no. 37, s. 28918-28928.
Hayashida, T., Schapner, H.W. High ambient glucose enhances sensitivity to as TGF-β1 via excellular signal-regulated kinase and protein kinase Cδ activities in human mesangial cells. J Am Soc Nephrol. 2004, vol. 15, s. 2032-2041.
Heptulla, R., et al. Tempoval patterns of circulating leptin levels in lean and obese adolescents: relationships to insulin, growth hormone, and free fatty acids rhythmicity. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001, vol. 86, s. 90-96.
Hsu, S.C., Huang, C.J. Changes in liver PPARa mRNA expression in response to two levels of high-safflower-oil diets correlate with changes in adiposity and serum leptin in rats and mice. J Nutr Biochem. 2007, vol.18, no. 2, s. 86– 96.
Ikewaki, K., et al. Fenofibrate effectively reduces remnants, and small dense ldl, and increases hdl particle number in hypertriglyceridemic men - a nuclear magnetic resonance study. J Atheroscler.Thromb. 2004, vol. 11, s. 278-285.
Imai, K., et al. Increase in Hepatic Content of Oleic Acid Induced by Dehydroepiandrosterone in the Rat. Biochem Pharmacol. 1999, vol. 58, no. 6, s. 925–933.
Ishizuka, T., et al. DHEA improves glucose uptake via activations of protein kinase C and phosphatidylinositol 3-kinase. Am J Physiol Endocrinol Metab. 1999, vol. 276, s. 196-204.
Itani, S.I., et al. Lipid-induced insulin resistance in human muscle is associated with changes in diacylglycerol, protein kinase C, and IkappaB-alpha. Diabetes. 2002, vol. 51, s. 2005–2011.
JeŽek, P., et al. Mitochondrial uncoupling proteins-facts and fantasies. Physiol Res. 2004, vol. 53, Suppl 1, s. 199-211.
Jump, D.B., et al. Fatty Acid Regulation of Hepatic Gene Transcription. J Nutr. 2005, vol. 135, s. 2503 - 2506.
Kajita, K., et al. The role of atypical and conventional PKC in dehydroepiandrosterone induced glucose uptake and dexamethasone-induced insulin resistance. Biochem Biophys Res Commun. 2000, vol. 277, no. 2, s. 361-367.
Kapoor, D., et al. Androgens, insulin resistance and vascular disease in men. Clin Endocrinol. 2005, vol. 63, s. 239–250.
Kashyap, S.R. Discordant effects of a chronic physiological increase in plasma FFA on insulin signaling in healthy subjects with or without a family history of type 2 diabetes. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2004, vol. 287, s. E537–E546.
Kemp, T.J., Causton, H.C., Clerk, A. Changes in gene expression induced by H2O2 in cardiac myocytes. Biochem Biophys Res Commun. 2003, vol. 307, s. 416–421.
Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. J Clin Invest. 1999, vol. 103, s. 1489–98.
Kim, J.K., et al. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J Clin Invest. 2001, vol. 108, s. 437–446.
Kimura, M., et al. Dehydroepiandrosterone decreases serum TNFa and restores insulin sensitivity: Independent effect from secondary weight reduction in genetically obese Zucker fatty rats. Endocrinology 1998, vol. 139, s. 3249–3253.
Kliewer, S.A., et al. Differential expression and activation of a family of murine peroxisome proliferatoractivated receptors. Proc Natl Acad Sci USA. 1994, vol. 91, s. 7355-7359.
Kliewer, S.A., et al. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors: From Genes to Physiology. Recent Prog Horm Res. 2001, vol. 56, s. 239-263.
Kliewer, S.A., et al. Fatty acids and eicosanoids regulate gene expression through direct interactions with peroxisome proliferator-activated receptors α and γ. Proc Natl Acad Sci USA. 1997, vol. 94, s. 4318–4323.
Koo, S.H., Montminy, M. Fatty acids and insulin resistance: a perfect storm. Mol Cell. 2006, vol. 21, no. 4, s. 449-450.
Krey, G., et al. Fatty acids, eicosanoids, and hypolipidemic agents identified as ligands of peroxisome proliferator-activated receptors by coactivator-dependent receptor ligand assay. Mol Endocrinol. 1997, vol. 11, no. 6, s. 779-791.
Kumar, R. et al. The Clinical Relevance of Steroid Hormone Receptor Corepressors. Clin Cancer Res. 2005, vol. 11, no.8, s. 2822-2831.
Lam, T.K., et al. Free fatty acid-induced hepatic insulin resistance: a potential role for protein kinase C-δ. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002, vol. 283, no. 4, s. E682–E691.
Lam, T.K., et al. Mechanisms of the free fatty acid-induced increase in hepatic glucose production. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2003, vol. 284, s. E863–E873.
Lawrence,J.W., Kroll, D.J., Eacho,P.I. Ligand-dependent interaction of hepatic fatty acid-binding protein with the nucleus. J Lipid Res. 2000, vol. 41, s. 1390.
Lazar, M.A. Becoming fat. Genes. 2002, vol. 16, s. 1-5.
LEWIS, G.F., et al. Disordered Fat Storage and Mobilization in the Pathogenesis of Insulin Resistance and Type 2 Diabetes. Endocr Rev. 2002, vol. 23, s. 201–229.
Leyton, J., Drury, P.J., Crawford, M.A. Differential oxidation of saturated and unsaturated fatty acids in vivo in the rat. Br J Nutr. 1987, vol. 57, s. 383–393.
Li, A.C., Glass, C.K. PPAR- and LXR-dependent pathways controlling lipid metabolism and the development of atherosclerosis. J Lipid Res. 2004, vol.45, no. 12, s. 2161-2173.
Li, B., et al. Distinct roles of c-Abl and Atm in oxidative stress response are mediated by protein kinase C delta. Genes Dev. 2004, vol. 18, s.1824-1837.
Li, A.C., Palinski, W. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors: How Their Effects on Macrophages Can Lead to the Development of a New Drug Therapy Against Atherosclerosis. Annu Rev Pharmacol Toxico.l 2006, vol. 46, s. 1-39.
Liu D., Dillon J.S. Dehydroepiandrosterone Activates Endothelial Cell Nitric-oxide Synthase by a Specific Plasma Membrane Receptor Coupled to Gαi2,3. J Biol Chem. 2002, vol. 277, no. 24, s. 21379–21388.
Liu, D.C., et al. A novel PPAR alpha/gamma dual agonist inhibits cell growth and induces apoptosis in human glioblastoma T98G cells. Acta Pharmacol Sin. 2004, vol. 25, s. 1312-1319.
Liu, H.K., et al. Deleterious Effects of Supplementation with Dehydroepiandrosterone Sulphate or Dexamethasone on Rat Insulin-Secreting Cells Under In Vitro Culture Condition. Biosci Rep. 2006, vol. 26, no. 1, s. 31-38.
Lösel, R., Wehling, M. Nongenomic actions of steroid hormones. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003, vol. 4, s. 46–56.
Luxon, B. A. Inhibition of binding to fatty acid binding protein reduces the intracellular transport of fatty acids. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 1996, vol. 271, no. 1, s. G113-G120.
Malhotra, A., et al. PKCepsilon inhibits the hyperglycemia-induced apoptosis signal in adult rat ventricular myocytes. Mol Cell Biochem. 2005, vol. 268, no. 1-2, s. 169-173.
Maloney, J.A., et al. Differential translocation of protein kinase C isozymes by phorbol esters, EGF, and ANG II in rat liver WB cells. Am J Physiol Cell Physiol. 1998, vol. 274, s. 974-982.
Masopust, J. Metabolický syndrom 1.(aneb proč tloustneme). [Online] Ústav klinické biochemie a patobiochemie, 2. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze. Labor Aktuell. 2005, vol. 4, s. 4-8.
Mastrocola, R., et al. Pro-oxidant effect of dehydroepiandrosterone in rats is mediated by PPAR activation. Life Sci. 2003, vol. 73, no. 3, s. 289-299.
McClain, D.A., Crook, E.D. Hexosamines and insulin resistance. Diabetes. 1996, vol. 45, s. 1003-1009.
Mehta, K.D., et al. Critical role of diacylglycerol- and phospholipid-regulated protein kinase C epsilon in induction of low-density lipoprotein receptor transcription in response to depletion of cholesterol. Mol Cell Biol. 2002, vol. 22, no. 11, s. 3783-93.
MEUNIER-DURMORT, C., et al. Up-regulation of the expression of the gene for liver fatty acid-binding protein by long-chain fatty acids. Biochem J. 1996, vol. 319, s. 483-487.
Moller, D.E., Berger, J.P. Role of PPARs in the regulation of obesity-related insulin sensitivity and inflammation. Int J Obes Relat Metab Disord. 2003, vol. 27, Suppl 3, s. S17–S21.
Mukasa, K., et al. Dehydroepiandrosterone (DHEA) ameliorates the insulin sensitivity in older rats. J Steroid Biochem Mol Biol. 1998, vol. 67, s. 355–358.
Nakajima, K., et al. Selective Attenuation of Metabolic Branch of Insulin Receptor Down-signaling by High Glucose in a Hepatoma Cell Line, HepG2 Cells. J Biol Chem. 2000, vol. 275, s. 20880–20886.
Nakashima, N., et al. Effect of dehydroepiandrosterone on glucose uptake in cultured human fibroblasts. Metabolism. 1995, vol. 44, no. 4, s. 543-548.
Nawata, H., et al. Adrenopause. Horm Res. 2004, vol. 62, Suppl 3, s. 110-114.
Newton, A.C. Regulation of protein kinase C. Curr Cell Biol. 1997, vol. 9, s. 161−167.
Nobel, S., Abrahmsen, L., Oppermann, U. Metabolic conversion as a pre-receptor control mechanism for lipophilic hormones. Eur J Biochem. 2001, vol. 268, s. 4113-4125.
Nunn, A.V., Bell, J., Barter, P. The integration of lipid-sensing and anti-inflammatory effects: how the PPARs play a role in metabolic balance. Nucl Recept. 2007, vol. 5, no. 1, s. 1.
Paolisso, G., et al. A high concentration of fasting plasma non-esterified fatty acids is a risk factor for the development of NIDDM. Diabetologia. 1995, vol. 38, no. 10, s. 1213-1217.
Parekh DB, Ziegler W, Parker PJ. Multiple pathways control protein kinase C phosphorylation. EMBO J. 2000, vol. 19, no. 4, s. 496-503.
Parker PJ, Murray-Rust J. PKC at a glance. J Cell Sci. 2004, vol. 117, no.2, s.131-132.
Pelletier, G., et al. Ontogeny and subcellular localization of 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) in the human and rat adrenal, ovary and testis. J Steroid Biochem Mol Biol. 1992, vol. 43, s. 451-467.
Poczatková H, et al. Struktura a aktivace proteinkinázy C (PKC). Československá fyziologie 2005, vol. 54, no. 4, s. 136-140.
Perrini, S., et al. Dehydroepiandrosterone stimulates glucose uptake in human and murine adipocytes by inducing GLUT1 and GLUT4 translocation to the plasma membrane. Diabetes. 2004, vol. 53, no. 1, s. 41-52.
Peters, J.M., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha required for gene induction by dehydroepiandrosterone-3 beta-sulfate. Mol Pharmacol. 1996, vol. 50, s. 67-74.
Peters, J.M., et al. Alterations in lipoprotein metabolism in peroxisome proliferator-activated receptor alpha-deficient mice. J Biol Chem. 1997, vol. 272, no.43, s. 27307-27312.
Petersen, K. F., Shulman, G. I. Pathogenesis of skeletal muscle insulin resistance in type 2 diabetes mellitus. Am J Cardiol. 2002, vol. 90, s.11G-18G.
Poynter, M.E., Daynes, R.A. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activation modulates cellular redox status, represses nuclear factor-kappaB signaling, and reduces inflammatory cytokine production in aging. J Biol Chem. 1998, vol. 273, s. 32833-32841.
Qatanani, M., Lazar, M.A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu.Genes & Dev. 2007, vol. 21,s. 1443 - 1455.
Qu, X., Seale, J.P., Donnelly, R. Tissue and isoform-selective activation of protein kinase C in insulin-resistant obese Zucker rats-effects of feeding. J Endocrinol. 1999, vol. 162, s. 207–214.
Rakatzi, I., et al. Adiponectin counteracts cytokine- and fatty acid-induced apoptosis in the pancreatic beta-cell line INS-1. Diabetologia. 2004, vol. 47, s. 249–258.
Randle, P. J., et al. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1963, vol. 1, s. 785-789.
Randle PJ. Regulatory interactions between lipids and carbohydrates: the glucose fatty acid cycle after 35 years. Diabetes Metab Rev. 1998, vol. 14, s. 263-283.
Raskin, P., et al. Rosiglitazone short-term monotherapy lowers fasting and post-prandial glucose in patients with type II diabetes. Diabetologia 2000, vol. 43, s. 278-284.
Reaven, G.M. Banting lecture 1988. Role of insulin resistance in human disease. Diabetes 1988, vol. 37, s. 1595-1607.
Ripp, S.L., et al. Induction of CYP3A gene expression by dehydroepiandrosterone: involvement of the pregnane X receptor. Drug Metab Dispos. 2002, vol. 30, s. 570–575.
Ripp, S.L., et al. Regulation of CYP2C11 by Dehydroepiandrosterone and Peroxisome Proliferators: Identification of the Negative Regulatory Region of the Gene. Mol Pharmacol. 2003, vol. 64, s. 113-122.
Riserus, U., et al. Treatment with dietary trans-10 cis-12 conjugated linoleic acid causes isomer-specific insulin resistance in obese men with the metabolic syndrome. Diabetes Care. 2002, vol. 25, s. 1516–1521.
Roth, G.S., et al.. Biomarkers of caloric restriction may predict longevity in humans. Science 2002, vol. 297, s. 811.
Samuel, V.T., et al. Mechanism of fat induced hepatic insulin resistance (Abstract). Diabetes. 2002, vol. 51, Suppl. 2, s. A68.
Samuel, V.T., et al. Mechanism of Hepatic Insulin Resistance in Non-alcoholic Fatty Liver Disease. J Biol Chem. 2004, vol. 279, s. 32345–32353.
Samuel, V.T., et al. Inhibition of protein kinase Cepsilon prevents hepatic insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Invest. 2007, vol. 117, no. 3, s. 739-745.
Savage, D.B., Petersen, K.F., Hulman, G.I. Disordered Lipid Metabolism and the Pathogenesis of Insulin Resistence. Physiol Rev. 2007, vol.87, s. 507 - 520.
Schmitz-Peiffer, C., Craig, D.L., Biden, T.J. Ceramide generation is sufficient to account for the inhibition of the insulin-stimulated PKB pathway in C2C12 skeletal muscle cells pretreated with palmitate. J Biol Chem. 1999, vol. 274, s. 24202–24210.
Seifert, R., et al. Activation of protein kinase C by cis- and trans-fatty acids and its potentiation by diacylglycerol. Biochem Biophys Res Commun. 1988, vol. 154, s. 20–26.
Shulman, G. I. Cellular mechanisms of insulin resistance. J Clin Invest. 2000, vol. 106, s. 171-176.
SMITH, C.L., O’MALLEY, B.W. Coregulator Function: A Key to Understanding Tissue Specificity of Selective Receptor Modulators. Endocr Rev. 2004, vol. 25, s. 45–71.
Spencer, N.F., et al. Constitutive activation of NF-kappa B in an animal model of aging. Int Immunol. 1997, vol. 9, s. 1581-1588.
Sumida, A., et al. Quantitative analysis of constitutive and inducible CYPs mRNA expression in the HepG2 cell line using reverse transcription-competitive PCR.. Biochem Biophys Res Commun. 2000, vol. 267, s. 756–760.
Sung, B., Park, S., Yu, B.P., Chung, H.Y. Modulation of PPAR in aging, inflammation, and calorie restriction. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2004, vol. 59, s. 997-1006.
Šedová, L., Šeda, O. Duální agonisté receptorů PPAR. Remedia 2006, vol. 16, s. 170–173.
Tsuboyama-Kasaoka, N., et al. Conjugated linoleic acid supplementation reduces adipose tissue by apoptosis and develops lipodystrophy in mice. Diabetes. 2000, vol. 49, s. 1534–1542.
Uyeda, K., Yamashita, H., Kawaguchi, T. Carbohydrate responsive element-binding protein (ChREBP): a key regulator of glucose metabolism and fat storage. Biochem Pharmacol. 2002, vol. 63, s. 2075-2080.
van Weerden, W.M., et al. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sci. 1992, vol. 50, s. 857-861.
Veerkamp, J. H. Fatty acid transport and fatty acid-binding proteins. Proc Nutr Soc. 1995, vol. 54, no. 1, s. 23-37.
Vercauteren, K., et al. PGC-1-related coactivator: immediate early expression and characterization of a CREB/NRF-1 binding domain associated with cytochrome c promoter occupancy and respiratory growth. Mol Cell Biol. 2006, vol. 26, s. 7409-7419.
Waxman, D.J. Role of metabolism in the activation of dehydroepiandrosterone as a peroxisome proliferator. J Endocrinol. 1996, vol. 150, Suppl, s. 129-147.
Webb, S.J.,et al. The biological actions of dehydroepiandrosterone involves multiple receptors. Drug Metab Rev. 2006, vol.38, no.1-2, s. 89-116.
White, M.F. Insulin signaling in health and disease. Science. 2003, vol. 302, s. 1710-1711.
WHO, Fact sheet N°312, Sep 2006 [Online]
Widstrom, R.L., Dillon, J.S. Is There a Receptor for Dehydroepiandrosterone or Dehydroepiandrosterone Sulfate? Semin Reprod Med. 2004, vol. 22, s. 289-298.
Wolfrum, C., et al. Fatty acids and hypolipidemic drugs regulace peroxisome proliferator-activated receptors a- and g-mediated gene expression via liver fatty acid binding protein: A signaling path to the nucleus. PNAS 2001, vol. 98, no. 5, s. 2323–2328.
XU, H.E.,et al. Molecular Recognition of Fatty Acids by Peroxisome Proliferator–Activated Receptors. Molecular Mol Cell. 1999, vol. 3, no. 3, s. 397–403.
Yamada, K., et al. Effects of insulin on the translocation of protein kinase C-theta an other protein kinase C isoforms in rat skeletal musles. Biochem J. 1995, vol. 508, s. 177-180.
Yamashita, R., et al. Effects of dehydroepiandrosterone on gluconeogenic enzymes and glucose uptake in human hepatoma cell line, HepG2. Endocr J. 2005, vol. 52, no. 6, s. 727-733.
Yen, S.S. Dehydroepiandrosterone sulfate and longevity: new clues for an old friend. Proc Natl Acad Sci. 2001, vol. 98, s. 8167-8169.
11. PŘEHLED PUBLIKACÍ AUTORA
1. Publikace
Poczatková, H., Rypka M., Veselý J., Riegrová D. Proteinkináza C (PKC) a její role v metabolismu mastných kyselin a glukózy. Čs fyziol. 2005, vol. 54, no. 3, s. 127-131.
Poczatková, H., Rypka, M., Veselý, J., Uherková, L., Červenková, K. Struktura a aktivace proteinkinázy C (PKC). Čs fyziol. 2005, vol. 54, no. 4, s. 136-140.
Rypka, M., Červenková, K., Uherková, L., Poczatková, H., Bogdanová, K., Veselý, J. Changes in mRNA levels of intracellular fatty acid metabolism regulators in human hepatoma HepG2 cells following their treatment with non-esterified fatty acids and dehydroepiandrosterone. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2005, vol. 149, no. 2, s.251-256.
UHERKOVÁ, L., Poczatková, H., Rypka, M., Veselý, J. Specifické fosforylace proteinů IRS a jejich úloha v inzulínové signalizaci. Čs fyziol. 2006, vol. 55, s. 22-29.
Rypka, M., Červenková, K., Uherková, L., Poczatková, H., Florschutz, A.V., Veselý, J. A novel simplified ultra-rapid freezing technique for cryopreservation of tissue slices. Kryobiology. 2006, vol. 52, s. 193-199.
BOGDANOVÁ, K., Poczatkova, H., Uherkova, L., Riegrova, D., Rypka, M., Feherb, J., Marchesinic, G., Vesely, J. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)—a novel common aspekt of the metabolit syndrome. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2006, vol. 150, s. 101-104.
Poczatková*, H., Bogdanová* K., Uherková, L., Červenková, K., Riegrová, D., Rypka, M., Veselý, J. Dehydroepiandrosterone effects on the mRNA levels of peroxisome proliferator-activated receptors and their coactivators in human hepatoma HepG2 cells. Gen Physiol Biophys. 2007, vol. 26, s. 268-274.
Bogdanová* K., Uherková* L., Poczatková, H., Rypka, M., Veselý, J. Effects of glucose deprivation and oleate on the mRNA levels of peroxisome proliferator-activated receptors and their coactivators in human hepatoma HepG2 cells. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2007, vol. 151, s. 237-245.
2. Abstrakta, přednášky a posterová sdělení
Kateřina Červenková, Lenka Uherková, Hana Poczatková, Kateřina Bogdanová Miroslav Rypka, Dagmar Riegrová a Jaroslav Veselý. Expression of heat shock proteins in HepG2 cells under the influence of different stress factors. 15. konference českých a slovenských patofyziologů, 22.-23.září 2004, Hradec Králové.
Hana Poczatková, Kateřina Bogdanová, Květoslava Dostálová, Lenka Uherková, Miroslav Rypka, Jaroslav Veselý. Některé výhody a nedostatky buněčné linie lidských hepatomových buněk HepG2 jako výzkumného modelu při studiu metabolického syndromu. 16. konferencie slovenských a českých patofyziológov, 9.-10.6.2006, Martin, Slovenská republika.
Kateřina Bogdanová, Lenka Uherková, Hana Poczatková, Kateřina Červenková, Miroslav Rypka, Květoslava Dostálová a Jaroslav Veselý. Hormon dehydroepiandrosteron (DHEA) ovlivňuje expresi složek kaskádyv receptorů aktivátorů peroxisomů (PPAR) a jaterního proteinu vázajícího mastné kyseliny (L-FABP) v buňkách HepG2. 16. konferencie slovenských a českých patofyziológov, 9.-10.6.2006, Martin, Slovenská republika.
Hana Poczatková, Kateřina Bogdanová, Lenka Uherková, Kateřina Červenková, Miroslav Rypka, Dagmar Riegrová a Jaroslav Veselý. Ovlivnění exprese izoforem PPAR a některých jimi řízených genů c buňkách HEPG2 hormonem dehydroepiandrosteronem (DHEA). XXIII. Konference České společnosti pro hypertenzi. Belgicko-české sympozium o hypertenzi, 5.-6.10.2006, Mariánské Lázně.
Hana Poczatková, Miroslav Rypka, Jaroslav Veselý, Giuseppe Poli. The monitoring of ROS production in HepG2 cells. 3rd COST B35 Action Meeting. New Approaches and Developments in Molecular Mechanisms of Lipid Peroxidation Associated Disorders, 18.06.2007, Istanbul, Turkey.
Hana Poczatková, Kateřina Bogdanová, Lenka Uherková, Kateřina Červenková, Miroslav Rypka, Dagmar Riegrová a Jaroslav Veselý. Ovlivnění článků kaskády PPAR dehydroepiandrosteronem na úrovni mRNA. XXIV.Konference české společnosti pro hypertenzi; XVI. Konference prac. skupiny Kardiologie ČKS; XII. Konference pracovní skupiny Srdeční selhání, 4.-6.10.2007. Mikulov.
3. Řešitelství v grantových projektech
COST B17.20 (2000-2005)
Molekulární poruchy sacharidového a lipidového metabolismu
v etiologii kardiovaskulárních nemocí.
COST OC B17.001 2005
Účinky dehydroepiandrosteronu (DHEA) na signální dráhy regulace
energetického metabolismu v lidských hepatocytech.
COST OC153, B-35 (2006-2010)
Změny genetické exprese signálních molekul funkčně spřažených
s receptory aktivovanými proliferátory peroxisomů (PPAR). Indukce
změn mastnými kyselinami a glukózou.
Vnitřní grant LF UP 91110091 (2007)
Studium exprese L-FABP v buňkách HepG2 ovlivněných mastnými
kyselinami a hormonem dehydroepiandrosteronem (DHEA).
MSM 6198959205 (2006-2007)
Studium genů a molekulárních mechanismů účastnících se řízení
krvetvorby, jejich klinický význam a využití k cílené léčbě
(SPP 30110074).
-----------------------
[pic]
................
................
In order to avoid copyright disputes, this page is only a partial summary.
To fulfill the demand for quickly locating and searching documents.
It is intelligent file search solution for home and business.
Related searches
- theses definition world history
- theses and dissertations definition
- theses and dissertations pdf
- 1 or 2 374 374 1 0 0 0 1 168 1 1 default username and password
- 1 or 3 374 374 1 0 0 0 1 168 1 1 default username and password
- 1 or 2 711 711 1 0 0 0 1 168 1 1 default username and password
- 1 or 3 711 711 1 0 0 0 1 168 1 1 default username and password
- 1 or 2 693 693 1 0 0 0 1 168 1 1 default username and password
- 1 or 3 693 693 1 0 0 0 1 168 1 1 default username and password
- 1 or 2 593 593 1 0 0 0 1 or 2dvchrbu 168 1 1 default username and password
- 1 or 3 593 593 1 0 0 0 1 or 2dvchrbu 168 1 1 default username and password
- 1 or 2 910 910 1 0 0 0 1 168 1 1 default username and password