Theses.cz



UNIVERZITA PALACK?HO V?OLOMOUCIP?írodovědecká fakultaKatedra biochemieAnal?za zinek rezistentní prostatické nádorové buně?né liniediplomová PR?CEAutor:Bc. Martina AxmanováStudijní program:B1406 BiochemieStudijní obor:BiochemieForma studia:Prezen?níVedoucí práce:RNDr. Michal Masa?ík, Ph.D.Rok: 2014Prohla?uji, ?e jsem diplomovou práci vypracovala samostatně s vyzna?ením v?ech pou?it?ch pramen? a spoluautorství. Souhlasím se zve?ejněním diplomové práce podle zákona ?. 111/1998 Sb., o vysok?ch ?kolách, ve znění pozděj?ích p?edpis?. Byla jsem seznámena s tím, ?e se na moji práci vztahují práva a povinnosti vypl?vající ze zákona ?. 121/2000 Sb., autorsk? zákon, ve znění pozděj?ích p?edpis?. V Brně, 25.4.2014Poděkování: M?j velk? dík pat?í vedoucímu RNDr. Michalu Masa?íkovi Ph.D. za odborné vedení, motivaci, rady, p?ipomínky, věnovan? ?as i lidské doprovázení. Děkuji t?mu student? i?zaměstnanc? z ?stavu patologické fyziologie LF MU za vytvo?ení motivujícího zázemí ke zpracování praktické ?ásti této práce.Děkuji také doc. PharmDr. Petru Babulovi Ph.D. z?Veterinární a?farmaceutické univerzity v?Brně za mo?nost detekce fluorescen?ní mikroskopií. Dále děkuji MUDr. Ji?ímu Lenzovi Ph.D. z?Patologicko-anatomického ústavu Fakultní nemocnice u?svaté Anny v?Brně, díky jeho? ochotě byly po?ízeny fotografie histologick?ch preparát?. Dal?í, neméně podstatn? dík pat?í m?m rodi??m, kte?í mě podporují nejen p?i studiu. A?té? sourozenc?m a kamarád?m za povzbuzení, p?átelství, pomoc a rady.Bibliografická identifikaceJméno a p?íjmení autoraBc. Martina AxmanováNázev práceAnal?za zinek rezistentní prostatické nádorové buně?né linieTyp práce DiplomováPracovi?tě?stav patologické fyziologie, LF MUVedoucí práceRNDr. Michal Masa?ík, Ph.D.Rok obhajoby práce2014Abstrakt: Zine?naté ionty jsou d?le?itou sou?ástí ?ady protein?. Jsou zapojeny do?buně?n?ch proces? jako je diferenciace, buně?n? cyklus, genová exprese, p?e?ívání buněk nebo apoptosa. U karcinomu prostaty byly zji?těny podstatné změny v?metabolismu a?transportu zine?nat?ch iont? oproti zdravé prostatické tkáni. K?detekci dlouhodobého p?sobení zinku byla vytvo?ena zinek rezistentní buně?ná linie PC3. S?vyu?itím qRT-PCR byla stanovena expresní hladina vybran?ch gen? souvisejících s?metabolismem a transportem zine?nat?ch iont?. V?závislosti na koncentraci zinku byla prokázána statisticky v?znamná korelace u exprese gen? MT1A (p=0,004), MT2A (p=0,002) a ZnT-1 (p=0,007). S?vyu?itím ANOVA testu bylo ur?eno, ?e vliv na expresní profil detekovan?ch gen? má koncentrace zine?nat?ch iont? v?kultiva?ním médiu (p=0,024), nikoli v?ak získaná rezistence buněk k?zinku (p=0,609). Byla detekována hodnota IC50 pro cytostatikum cisplatinu a?pro Zn2+. U?obou látek byla hodnota IC50 zv??ená v?porovnání s?linií wild type. Imunocytochemickou detekcí protein? byla potvrzena anal?za genové exprese. Migra?ní schopnost nádorov?ch buněk in vitro byla detekována scratch testem. Zinek rezistentní buňky migrovaly pomaleji, ne? buňky linie wt. Volné thiolové skupiny, které jsou zodpovědné za vazbu kov?, byly detekovány fluorescen?ní mikroskopií v?jád?e a?v?cytoplasmě. Zine?naté ionty byly lokalizovány difúzně. Klí?ová slovaprostata, karcinom prostaty, PC3, zinek, zinek rezistentní buně?ná linie, zinkové transportéryPo?et stran78Po?et p?íloh8Jazyk?esk?Bibliographical identificationAutor’s first name and surnameBc. Martina AxmanováTitleAnalysis of zinc resistant prostate tumor cell linesType of thesis DiplomaDepartmentDepartment of Pathological Physiology Faculty of Medicine, Masaryk UniversitySupervisorRNDr. Michal Masa?ík, Ph.D.The year of presentation2014Abstract: Zinc ions are important components of many proteins. They are involved in?cellular processes such as differentiation, cell cycle, gene expression, cell survival or?apoptosis. It was found out that the zinc ion metabolism and zinc transportation in?prostate cancer cells differ from healthy prostatic tissues. To detect the long-term effect of zinc, a zinc-resistant cell line PC3 was developed. The expression profiles of?selected genes related to zinc ion metabolism and transportation were determined by?using qRT-PCR. We disclosed statistically significant correlation between zinc concentration and expression of genes MT1A (p=0,004), MT2A (p=0,002) and ZnT-1 (p=0,007). Using ANOVA test was determined, that concentration of zinc ions in?the?medium has an effect on the expression profile of detected genes (p=0,024), but not?the acquired ukleusce of cells to zinc (p=0,609). A half of the maximal inhibition concentration was detected for cytostatic cisplatin and for Zn2+. For both substances, the IC50 value was higher than the IC50 of wild type cell line. The?expression analysis was confirmed by immunocytochemical detection of proteins. Scratch test was used for detection of the ability of tumor cells to migrate in vitro. Zinc-resistant cells migrated slower than the wt cells. Free thiols, which are?responsible for metals binding, were detected by fluorescent microscopy in?the?nucleus and in the cytoplasm. Zinc ions were localized diffusely.?Keywordsprostate, prostate cancer, PC3, zinc, zinc-resistant cell line, zinc transportersNumber of pages78Number of appendices8LanguageCzechOBSAH TOC \o "1-4" \u 1 ?VOD PAGEREF _Toc386190349 \h 102 OBECN? ?VOD DO PROBLEMATIKY PAGEREF _Toc386190350 \h 122.1 Anatomie, fyziologie a histologie prostatické ?lázy PAGEREF _Toc386190351 \h 122.2 Patologie prostaty PAGEREF _Toc386190352 \h 132.2.1 Záněty prostaty (prostatitis) PAGEREF _Toc386190353 \h 132.2.2 Benigní hyperplasie prostaty PAGEREF _Toc386190354 \h 132.2.3 Karcinom prostaty PAGEREF _Toc386190355 \h 142.2.3.1 Epidemiologie, patogeneze a etiologie PAGEREF _Toc386190356 \h 142.2.3.2 Klinick? obraz PAGEREF _Toc386190357 \h 152.2.3.3 Screening, diagnostika, klasifikace PAGEREF _Toc386190358 \h 152.2.3.4 Lé?ba PAGEREF _Toc386190359 \h 163 SOU?ASN? STAV ?E?EN? PROBLEMATIKY PAGEREF _Toc386190360 \h 183.1 Zinek a prostata PAGEREF _Toc386190361 \h 183.1.1 Prostata fyziologicky PAGEREF _Toc386190362 \h 183.1.1.1 Produkce citrátu PAGEREF _Toc386190363 \h 183.1.1.2 Terminální oxidace PAGEREF _Toc386190364 \h 193.1.1.3 Vliv zinku na apoptosu PAGEREF _Toc386190365 \h 193.1.2 Metabolické změny v?akumulaci zinku související s CaP PAGEREF _Toc386190366 \h 193.2 Zinek PAGEREF _Toc386190367 \h 223.2.1 Formy zinku v?buňce PAGEREF _Toc386190368 \h 233.2.2 Zinek a nádorová transformace PAGEREF _Toc386190369 \h 233.3 Zinkové transportéry PAGEREF _Toc386190370 \h 243.3.1 Zip PAGEREF _Toc386190371 \h 253.3.1.1 Struktura PAGEREF _Toc386190372 \h 263.3.1.2 P?ehled transportér? Zip PAGEREF _Toc386190373 \h 263.3.2 ZNT PAGEREF _Toc386190374 \h 273.3.2.1 Struktura PAGEREF _Toc386190375 \h 273.3.2.2 P?ehled transportér? ZNT PAGEREF _Toc386190376 \h 283.4 Zinek vazebné struktury PAGEREF _Toc386190377 \h 323.4.1 Nízkomolekulární organické kyseliny PAGEREF _Toc386190378 \h 323.4.2 Metalothionein PAGEREF _Toc386190379 \h 323.4.2.1 Struktura PAGEREF _Toc386190380 \h 323.4.2.2 Funkce PAGEREF _Toc386190381 \h 333.4.2.3 Exprese PAGEREF _Toc386190382 \h 333.4.3 Metal regula?ní transkrip?ní faktor PAGEREF _Toc386190383 \h 343.4.4 Matrixové metaloproteinasy PAGEREF _Toc386190384 \h 343.4.5 Tkáňové inhibitory matrixov?ch metaloproteinas PAGEREF _Toc386190385 \h 354 C?LE PAGEREF _Toc386190386 \h 365 EXPERIMENT?LN? ??ST PAGEREF _Toc386190387 \h 375.1 Materiál a metodika PAGEREF _Toc386190388 \h 375.1.1 Práce s buně?n?mi kulturami PAGEREF _Toc386190389 \h 375.1.2 Vytvá?ení zinek rezistentních buně?n?ch linií PAGEREF _Toc386190390 \h 385.1.3 Izolace mRNA PAGEREF _Toc386190391 \h 395.1.4 Reverzní transkripce PAGEREF _Toc386190392 \h 405.1.5 Kvantitativní PCR v?reálném ?ase (qRT-PCR) PAGEREF _Toc386190393 \h 415.1.6 Imunocytochemie PAGEREF _Toc386190394 \h 425.1.7 MTT PAGEREF _Toc386190395 \h 455.1.8 Po?ítání buněk PAGEREF _Toc386190396 \h 465.1.9 Detekce zinku a voln?ch thiol? PAGEREF _Toc386190397 \h 475.1.10 Scratch assay PAGEREF _Toc386190398 \h 486 V?SLEDKY PAGEREF _Toc386190399 \h 506.1 Zinek rezistentní linie PAGEREF _Toc386190400 \h 506.2 Anal?za exprese vybran?ch gen? PAGEREF _Toc386190401 \h 506.3 Anal?za viability buněk (MTT) PAGEREF _Toc386190402 \h 556.4 Imunocytochemická anal?za PAGEREF _Toc386190403 \h 566.5 Fluorescen?ní zna?ení PAGEREF _Toc386190404 \h 596.5.1 Detekce voln?ch thiol? PAGEREF _Toc386190405 \h 596.5.2 Detekce zinku PAGEREF _Toc386190406 \h 596.6 Scratch assay PAGEREF _Toc386190407 \h 607 DISKUSE PAGEREF _Toc386190408 \h 637.1 Expresní profil PAGEREF _Toc386190409 \h 637.2 Buně?ná viabilita PAGEREF _Toc386190410 \h 657.3 Imunocytochemická detekce PAGEREF _Toc386190411 \h 667.4 Detekce voln?ch thiol? a zinku PAGEREF _Toc386190412 \h 677.5 Migrace buněk in vitro PAGEREF _Toc386190413 \h 677.6. Srovnání anal?zy zinek rezistentní buně?né linie PC3 s?linií wt PC3 PAGEREF _Toc386190414 \h 678 Z?V?R PAGEREF _Toc386190415 \h 699 LITERATURA PAGEREF _Toc386190416 \h 7010 SEZNAM POU?IT?CH ZKRATEK PAGEREF _Toc386190417 \h 7511 P??LOHY PAGEREF _Toc386190418 \h 7811.1 Seznam p?íloh PAGEREF _Toc386190419 \h 781 ?VOD Adenokarcinom prostaty je jedním z?nejvíce studovan?ch onkologick?ch onemocnění z?d?vodu vysokého v?skytu u mu??. Je ?azen mezi nej?astěj?í p?í?iny úmrtí na?nádorové onemocnění (Mare?, 2003; Morgan a McCance, 2010). Poodhalení transportních a metabolick?ch systém? zine?nat?ch iont? je d?le?ité pro pochopení patogeneze a progrese karcinomu prostaty. Právě zine?naté ionty hrají z?ejmě v?tomto onemocnění v?znamnou roli, nebo? jejich koncentrace je zásadně odli?ná ve zdravé prostatické tkáni ve srovnání s?karcinomem (Desouki et al., 2007; Costello a Franklin, 2011).Zinek je d?le?it? stopov? prvek. Zine?naté ionty hrají klí?ovou úlohu v buně?n?ch procesech, jako je oxida?ní stres, programovaná buně?ná smrt, proliferace a buně?ná diferenciace. Podílí se také na regulaci syntézy DNA a je zapojen do regulace buně?ného cyklu. Intracelulární koncentrace zinku je p?ísně regulována. Naru?ení homeostasy zinku m??e mít vá?né patologické následky (Kambe et al., 2004; Murakami a Hirano, 2008; Costello et al., 2011a). D?le?itou funkci pro udr?ení homeostasy zine?nat?ch iont? mají zinkové transportéry (rodina transmembránov?ch p?ena?e?? Zip a ZnT), metalothionein a?metal regula?ní transkrip?ní faktor. Fyziologická koncentrace zinku v?prostatické tkáni má vliv mj. na produkci citrátu, energetick? metabolismus ?i na apoptosu (Franklin et al., 2005b; Costello a Franklin, 2011). P?edchozí studie byly víceméně zamě?eny na vliv zine?nat?ch iont? p?i krátkodobém p?sobení na nádorové prostatické buně?né kultury. K?anal?ze dlouhodobého vlivu vysoké koncentrace zine?nat?ch iont? v?nádorově transformovan?ch buňkách byla vytvo?ena zinek rezistentní buně?ná linie. Tato linie byla odvozena a?vyselektována z?wild type (wt) PC3 prostatické buně?né linie (agresivní karcinom). Tato práce je zamě?ena na podrobněj?í anal?zu zinek rezistentní PC3 linie ve?srovnání s?buně?nou linií wt PC3 pomocí standardních metod biochemie a?molekulární biologie. Zamě?ila jsem se na expresní anal?zu vybran?ch gen? souvisejících s?metabolismem a?transportem zine?nat?ch iont?, na imunocytochemickou detekci vybran?ch protein? v?buně?n?ch kulturách. Rezistence byla ově?ena MTT testem, byla detekována hodnota IC50 pro cytostatikum cisplatinu a?pro zinek. Schopnost migrace buněk byla detekována in vitro scratch testem. Fluorescen?ní detekcí byly stanoveny volné thiolové skupiny zodpovědné za vazbu kov? a zine?naté ionty.P?ínosem této práce je poodhalení metabolick?ch změn v?akumulaci zinku související s?karcinomem prostaty v?kontextu dlouhodobého p?sobení zine?nat?ch iont? na prostatickou nádorovou buně?nou linii. 2 OBECN? ?VOD DO PROBLEMATIKY2.1 Anatomie, fyziologie a histologie prostatické ?lázy Prostata, párové semenné vá?ky a?gl.?bulbourethralis pat?í mezi p?ídatné pohlavní ?lázy mu?e. Prostata je svalově ?láznat? orgán, definitivní velikosti dosahuje v pubertě. Je ulo?ena pod mo?ov?m měch??em. St?edem ?lázy prochází prostatická ?ást mo?ové trubice (?ihák, 2002; Hork? a ?ech, 2003). Anatomicky na prostatě rozli?ujeme bázi, hrot a dvě plochy (viz obrázek 1). V?urologické praxi se pou?ívá McNealovo schéma zonální anatomie prostaty (viz p?íloha 1), které rozděluje prostatickou ?lázu na několik zón. Toto rozdělení je d?le?ité v?souvislosti s?v?skytem patologií prostaty (v?skyt benigní hyperplasie prostaty a?karcinomu prostaty) a v?souvislosti s?odli?n?mi molekulárními mechanismy v?buňkách r?zn?ch zón (viz dále, kap. 3.1.1). ?lázov? epitel prostaty vytvá?í sekret, kter? tvo?í 15–30 % tekutiny ejakulátu. Prostatick? sekret je bezbarv?, tekut?, o pH?6,4. Obsahuje kyselinu citronovou, zinek, prostaglandiny, polyamidy, protilátky, kyselou fosfatasu a proteasy (Petrovick?, 2002). Povrch prostatické ?lázy je kryt vazivov?m pouzdrem. Vazivová p?epá?ka procházející st?edem rozděluje ?lázu na dva laloky. Prostata je tvo?ena?prostatick?mi ?lázkami a vazivově-svalov?m stromatem (Petrovick?, 2002; Hork? a ?ech, 2003). semenné vá?kyapex prostatyprostatická ?ást uretrybáze prostatychámovodyObrázek 1: Anatomie p?ídatn?ch pohlavních ?láz mu?e. Dle ? prostate/anatomy/, 11.3.2014).Stěna ?lázek je tvo?ena jednovrstevn?m kubick?m a? dvou?ad?m cylindrick?m epitelem (viz p?íloha 2). Tyto buňky jsou hormonálně citlivé na testosteron (Martínek a?Vacek, 2009). Vazivově svalové stroma se skládá ze svazk? kolagenních vláken a?snope?k? hladk?ch svalov?ch buněk (Hork? a ?ech, 2003).V?voj, diferenciace a r?st prostaty je hormonálně regulován androgeny. Testosteron je konvertován ve stromatu prostaty enzymem 5-α-reduktasou na dihydrotestosteron. Ten má vliv na ?lázové buňky i stroma a udr?uje prostatu funk?ní (?ihák, 2002; Hork? a ?ech, 2003).2.2 Patologie prostatyV?této kapitole jsou uvedeny informace o onemocněních prostatické ?lázy. Jedná se o?záněty prostaty, benigní hyperplasii prostaty (BHP) a karcinom prostaty (CaP).2.2.1 Záněty prostaty (prostatitis)Obtí?e spojené s prostatitidou se vyskytují p?ibli?ně u 10 % mu??. Záněty prostaty mohou b?t p?vodu bakteriálního (akutní nebo chronické) nebo mohou mít jiné, nebakteriální p?í?iny. Informace o zánětliv?ch onemocněních prostaty shrnuje tabulka?1.2.2.2 Benigní hyperplasie prostaty Benigní hyperplasie prostaty (BHP) pat?í k?nej?astěj?ím onemocněním prostaty. V?znamnou měrou ke vzniku BHP p?ispívají hormony (androgeny a estrogeny). Jejich role v?ak z?stává neobjasněna. Hyperplasie je charakterizována zvět?ením orgánu, které je zp?sobeno zmno?ením jednotliv?ch buněk (viz p?íloha 2). Tabulka 1: Záněty prostatické ?lázy. Zpracováno dle (Ma?ák a Ma?áková, 2004; Morgan a?McCance, 2010).typ zánětuklinické p?íznakyp?vodce onemocněnílé?baakutní bakteriální zánětakutní nástup problém?, bolest v?oblasti hráze, malé pánve, spodiny mo?ového měch??e, bederní ?ásti zad, vysoká teplota (a? 40°C)E .coli, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Neisseria gonorrhoeaedlouhodobá terapie ATB (fluorochinolony)chronick? bakteriální zánětdlouhotrvající v??e uvedené symptomyG? bakterieATB chinolonynebakteriální zánětshodné symptomynegativní mikrobiologick? nálezanalgetika, zavodněníIncidence BHP se zvy?uje s?věkem (Ma?ák a Ma?áková, 2004; Morgan a McCance, 2010). BHP b?vá nej?astěji lokalizována v?centrální zóně prostaty (viz. McNealovo schéma zonální anatomie prostaty, p?íloha 1). Z?tohoto d?vodu dochází ?asto k?útlaku mo?ovodu a?následn?m problém?m s?mikcí. Komplikacemi p?i progresi m??e b?t hematurie, infekce mo?ového měch??e nebo ledvin, hydronefrosis, ledvinová nedostate?nost aj. Diagnostika benigní hyperplasie je zalo?ena na vy?et?ení kone?níkem (DRE, digital rectal examination). Screeningové vy?et?ení je doporu?ováno 1x ro?ně u mu?? star?ích 40 let. Dal?í pou?ívanou vy?et?ovací metodou je sonografické vy?et?ení TRUS (transrectal ultrasonography). K?odli?ení BHP a karcinomu prostaty se detekuje PSA denzita (denzita prostatického specifického antigenu).K?lé?bě BHP se vyu?ívají látky, které?uvolňují hladkou svalovinu?prostaty (α1- adrenergní blokátory). Také se pou?ívají selektivní blokátory androgen? (finasterid), které zp?sobují zmen?ení prostatické ?lázy ( /medication/ detail.php?code=0118762&tab=texts, 12.3.2014). Invazivní metodou je transuretrální resekce. Standardním p?ístupem k?lé?bě BHP je v?ak sní?ení hladiny androgen?, která vede k involuci prostaty (Ma?ák a Ma?áková, 2004; Morgan a McCance, 2010).2.2.3 Karcinom prostaty 2.2.3.1 Epidemiologie, patogeneze a etiologieKarcinom prostaty (CaP) je jedno z nej?astěj?ích zhoubn?ch nádorov?ch onemocnění u?mu?? v??R. V?celosvětovém mě?ítku je incidence velmi variabilní. Se zvy?ujícím se věkem incidence stoupá. Více ne? 75?% z?celku je diagnostikováno u mu?? star?ích 65 let. CaP je po rakovině plic druhá nej?astěj?í p?í?ina smrti na nádorová onemocnění u?mu?? star?ích padesáti let. V??eské republice bylo v?roce 2010 hlá?eno 6771 nov?ch p?ípad? v?skytu nádor? prostaty (incidence 131 na 100 tis. mu??) a?1467 úmrtí na tento typ rakoviny (mortalita 28 na 100 tis. mu??), (viz p?íloha 3) (Mare?, 2003; Morgan a?McCance, 2010).Více jak 95 % novotvar? prostaty jsou adenokarcinomy s?r?zn?m stupněm diferenciace. Prostatická intraepiteliální neoplasie (PIN) je pova?ována za prekancerosu. Méně ?asto se m??e vyskytovat karcinom z?p?echodn?ch buněk (duktální) a?malobuně?n? karcinom. Adenokarcinomy vycházejí vět?inou z?acin? ?láz a ?asto vznikají vícelo?iskově. CaP b?vá a? s 80% pravděpodobností lokalizován v?periferní zóně prostatické ?lázy (Mare?, 2003; Du?ek, 2010). Buňky?periferní zóny zdravé prostatické ?lázy mají schopnost akumulovat zinek a produkovat citrát. P?evá?ná lokalizace CaP v?této zóně je zajímavá zvlá?tě v?souvislosti se ztrátou těchto schopností (viz kap 3.4.2) (Costello et al., 2004).P?í?iny vzniku CaP jsou multifaktoriální. Podílí se na nich: androgenní vliv (testosteron, dihydrotestosteron), aktivace onkogen?, změna stimulace nebo inhibice r?stu, p?sobení jin?ch environmentálních karcinogen? (Mare?, 2003; Morgan a?McCance, 2010). D?le?itou roli v?této souvislosti hraje změna v homeostasi zinku (Franklin et al., 2005b). Sekundární nádory (metastasy) vznikají ?í?ením lymfatickou a?hematogenní cestou. ?í?ení lymfou postihuje zpravidla pánevní a?periaortální uzliny. Hematogenní metastasy jsou lokalizovány v?kostech (pánev, ?ebra, páte?), v plicích, játrech a v nadledvinách (Mare?, 2003; Ma?ák a Ma?áková, 2004; Morgan a McCance, 2010).2.2.3.2 Klinick? obrazCaP, lokalizovan? ?asto v?periferní zóně, nezp?sobuje v?ran?ch stádiích karcinomu zú?ení mo?ové trubice (na rozdíl od BHP). ?asná stádia rakoviny jsou vět?inou bez symptom?. V?pokro?il?ch stádiích se vyskytují následující symptomy: problémy p?i mo?ení (dysurie, nykturie, akutní retence, pomal? proud mo?i, neúplné vyprázdnění mo?ového měch??e, aj.), hematurie nebo renální insuficience p?i hydronefrose. P?i progresi onemocnění se vyskytuje: bolest kostí vycházející z?p?ítomnosti metastas, otoky dolních kon?etin (DK), úbytek hybnosti DK, zvět?ení jater a?lymfatick?ch uzlin, patologické zlomeniny kostí, zmatenost (metastasy do mozku). Dal?ími p?íznaky m??e b?t hubnutí, nechutenství a celková slabost (Mare?, 2003; Ma?ák a Ma?áková, 2004; Morgan a McCance, 2010).2.2.3.3 Screening, diagnostika, klasifikaceVy?et?ení, která jsou prováděna u pacient? s?CaP je mo?no rozdělit na screeningová (ta, která mohou odhalit karcinom prostaty), diagnostická (vy?et?ení potvrzující diagnózu) a?vy?et?ení slou?ící ke klasifikaci onemocnění (ur?ení stádia onemocnění).? screening: stanovení hladiny PSA, vy?et?ení per rektum? diagnostika: biopsie prostaty, transrektální sonografie? klasifikace: histopatologické vy?et?ení (Gleason score), po?íta?ová tomografie (CT), scintigrafie, TNM klasifikace (Mare?, 2003).Stanovení sérové hladiny prostatického specifického antigenu (PSA) slou?í spole?ně s?vy?et?ením DRE (digital rectal examination) ke screeningu CaP. V??R je toto vy?et?ení doporu?ováno u?asymptomatick?ch mu?? star?ích padesáti let (?oupek et al., 2002; Du?ek, 2010).Ke stanovení definitivní diagnosy je nezbytné histologické vy?et?ení prostatické tkáně (punk?ní biopsie, intrakapsulární prostatektomie, transuretrální resekce, radikální prostatektomie) (Dvo?ák et al., 2008).Systém hodnocení TNM (viz p?íloha 4) je pou?íván ke klasifikaci CaP. Toto hodnocení vyu?ívá celou ?adu kritérií: anatomickou lokalizaci, histopatologick? typ nádoru, stupeň diferenciace, klinick? a patologicko-anatomick? rozsah onemocnění, symptomy, věk a?pohlaví pacienta aj. (Sobin a Wittekind, 1997).Mezi dal?í vyu?ívané metody ?adíme transrektální ultrasonografii, rentgen plic, ultrasonografii ledvin, scintigrafii kostí, CT, nukleární magnetickou rezonanci (NMR) b?icha a malé pánve, transrektální monografii a cystoskopii (Luke?, 2005).D?le?it?m hodnotícím znakem je histopatologick? stupeň diferenciace nádoru (viz p?íloha 5). Ten je d?le?it? nejen ke klasifikaci, ale i k prognose. Dob?e diferencované karcinomy progredují pozvolna a?méně, málo diferencované karcinomy rychleji a mají vět?í schopnost zakládat sekundární nádory. Jejich prognóza b?vá hor?í (Luke?, 2005).2.2.3.4 Lé?baLé?ba CaP se odvíjí od jeho stádia, od histologické klasifikace, p?edpokládaného efektu lé?by, věku a celkového zdravotního stavu pacienta.Primárním cílem lé?by je odstranění nádorového lo?iska, v?pokro?il?ch stádiích jde o?redukci velikosti nádoru, p?edcházení nebo odleh?ení bolesti a také prodlou?ení ?ivota. V?terminálních stádiích CaP se vyu?ívá lé?ba paliativní?(Morgan a McCance, 2010).? Lé?ba chirurgickáInvazivně se provádí ?áste?ná nebo úplná prostatektomie (odstranění prostatické ?lázy v?etně pouzdra a?semenn?ch vá?k?) (Mare?, 2003; Morgan a McCance, 2010). Alternativní mo?ností je kryoterapie, p?i ní? je nádor vystaven velmi nízk?m teplotám a dojde tak k?apoptose buněk (Du?ek, 2010).? Lé?ba radiologickáKarcinom prostaty je radiosenzitivní nádor. Toho m??e b?t vyu?ito p?i lé?bě zá?ením. Tou je bu? teleradioterapie (radioterapie zevními svazky), nebo brachyterapie (intersticiální aplikaci radioizotopu do tkáně). V pokro?il?ch stádiích onemocnění b?vá indikována paliativní radioterapie. Dal?í mo?ností je ozá?ení v?hypoxii (?oupek et al., 2002; Du?ek, 2010). Tyto metody mohou doprovázet komplikace, mezi které pat?í urologické a?gastrointestinální problémy, celková toxicita, otoky dolních kon?etin a erektilní dysfunkce (?oupek et al., 2002).? Lé?ba hormonálníPrincipem hormonální lé?by je potla?ení a? eliminace cirkulujících androgen?. Mo?nosti hormonální lé?by jsou: orchitektomie (ablace zdroje androgen?), nep?ímá gonadální suprese nebo podávání antiandrogen? (antagonisté androgen? na úrovni prostaty). Hormonální lé?ba je základní systémovou lé?bou u generalizovaného karcinomu.? Chemoterapie má místo p?i lé?bě pokro?il?ch stádií onemocnění (?oupek et al., 2002; Du?ek, 2010).3 SOU?ASN? STAV ?E?EN? PROBLEMATIKY3.1 Zinek a prostataNásledující kapitola pojednává o vztahu zinku a prostatické tkáně. Shrnuje poznatky o?molekulárních a biochemick?ch pochodech za fyziologick?ch a patologick?ch stav? (CaP).3.1.1 Prostata fyziologickyProstatická tkáň disponuje schopností akumulovat zine?naté ionty a to a? v?desetinásobně vy??ích koncentracích ne? jiné měkké tkáně (Costello et al., 2004; Desouki et al., 2007; Costello a Franklin, 2011). Tuto schopnost mají zejména epiteliální buňky periferní zóny prostatické ?lázy (viz p?íloha 1). Buňky centrální zóny prostatické ?lázy tuto schopnost akumulace zine?nat?ch iont? nemají.Jak je z?ejmé z?tabulky ?íslo dvě, buňky periferní zóny akumulují zinek a? v?10x vy??ím mno?ství ne? ostatní tkáně. Schopnost tvo?it a produkovat citrát je v?těchto buňkách vy??í 30–50x. Tyto buňky byly proto ozna?eny jako ?zinek akumulující, citrát produkující? buňky (Franklin et al., 2005b).3.1.1.1 Produkce citrátuD?le?itou fyziologickou funkcí prostatické ?lázy je schopnost vytvá?et a produkovat velké mno?ství citrátu, kter? je v?znamnou sou?ástí prostatického sekretu. Zinek, kter? je akumulován ve zv??eném mno?ství v?prostatick?ch buňkách, má inhibi?ní efekt na mitochondriální enzym m-akonitasu. To je zásadní reakce, nebo? tak témě? nedochází k?oxidaci citrátu v?Krebsově cyklu. (Citrát je d?le?it?m meziproduktem Krebsova cyklu (KC)), d?le?it? pro syntézu ATP a zdrojem pro acetylkoenzym A, kter? je nezbytn? pro lipogenezi a?syntézu cholesterolu). Nedokonalá oxidace v?KC vede ke vzniku 14 ATPTabulka 2: Koncentrace zine?nat?ch iont? a citrátu v r?zn?ch typech tkání a?tekutin. Dle (Desouki et al., 2007; Costello et al., 2011b; Costello a Franklin, 2011).Typ tkáněkoncentrace Zn2+(nmol/gram mokré váhy)koncentrace citrátu(nmol/gram mokré váhy)periferní zóna zdravé prostatické tkáně3000–450013000periferní zóna maligní prostatické tkáně400–800200–2000ostatní měkké tkáně200–400250–450prostatická tekutina zdravé tkáně8?000–1000040?000–150000prostatická tekutina CaP800–2000500–3000krevní plasma15100–200na molekulu glukosy (namísto 38 molekul ATP). Tento proces je energeticky neefektivní, dochází tak ke ztrátě a? 65 % ATP (Franklin et al., 2005b; Costello a?Franklin, 2011). Zajímav? je v?této souvislosti fakt, ?e vysoká koncentrace zinku p?sobí v?jin?ch buňkách toxicky a?také, ?e inhibice m-akonitasy je letální pro ?adu sav?ích buněk (Franklin et al., 2005b). 3.1.1.2 Terminální oxidaceProstatická tkáň je charakterizována nízkou úrovní respirace. Ve zdravé prostatické tkáni je inhibován komplex III d?chacího ?etězce a??áste?ně i komplex I a II, nedochází k?inhibici komplexu IV (Franklin a Costello, 2007). Celková úroveň aktivity komplex? I–IV d?chacího ?etězce je v?prostatick?ch buňkách v?razně sní?ena, a to a? o 50–80 % ve srovnání s?jaterními mitochondriemi (MTC) (Franklin a Costello, 2007). Zinek byl uveden jako inhibitor terminální oxidace v?MTC sav?ích buněk (Franklin et al., 2005b).3.1.1.3 Vliv zinku na apoptosuAkumulace zinku má inhibi?ní vliv také na proliferaci prostatick?ch buněk. To je vyvoláno p?ímou indukcí apoptosy. Zinek zp?sobuje uvolnění cytochromu c z?mitochondrií, co? má za následek aktivaci kaskády kaspas. P?edpokládá se, ?e zinek p?ímo interaguje s?mitochondriemi a usnadňuje tvorbu Bax pór?. Je pravděpodobné, ?e zinek zvy?uje expresi Bax a usnadňuje translokaci Bax na mitochondriální membránu (Franklin et al., 2005b).3.1.2 Metabolické změny v?akumulaci zinku související s CaPU karcinomu prostaty dochází ke ztrátě schopnosti buněk akumulovat zinek. Hladina zinku je v?maligní periferní zóně prostatické tkáně sní?ena o 70–85 % ve srovnání s?periferní zónou normální prostatické tkáně (viz tab. 2). To koresponduje s?hladinou citrátu, která je také sní?ena. Klinické i experimentální studie dokazují zásadní změnu v?maligních prostatick?ch buňkách ve srovnání se zdravou prostatickou tkání. K?proměně normálních (?zinek akumulujících, citrát produkujících?) buněk na buňky nádorové (oxidující citrát a?neschopné akumulovat zinek) jsou nezbytné dvě transformace, genetická a?metabolická. Procesy p?edcházející vzniku CaP jsou znázorněny na obrázku 2, sou?asně se změnami v?metabolismu a?transportu zinku, (Franklin et al., 2005b;Obrázek 2: Role Zip1, zinku a metabolismu citrátu na patogenezi karcinomu prostaty. Normální buňka ?lázového epitelu prostaty exprimuje Zip1, kter? umo?ňuje akumulaci zinku. Zinek inhibuje oxidaci citrátu a terminální oxidaci. Dochází tak ke hromadění citrátu a sní?ení produkce ATP. Genetická transformace vede k p?eměně buňky zdravé na buňku s?maligním potenciálem. Exprese ZIP1 je uml?ena pravděpodobně epigenetick?mi faktory, co? má za následek eliminaci importu zinku a?ztrátu schopnosti akumulovat zinek v?premaligní buňce. Hladina buně?ného zinku je sní?ena, dochází k?utlumení inhibice zinkem na oxidaci citrátu a na terminální oxidaci. Funk?ní Krebs?v cyklus vede ke zv??ené tvorbě ATP. Maligní buňka je metabolicky a?bioenergeticky schopna projevovat sv?j maligní potenciál. Také je odstraněn inhibi?ní efekt zinku na r?st, co? umo?ní r?st a?v?voj maligní buňky (Franklin et al., 2005a)(Franklin et al., 2005b; Desouki et al., 2007). Absence metabolické transformace u?neoplastick?ch buněk nevede k?maligní progresi, ani metabolická transformace samotná nevede k?rozvoji malignity v?nep?ítomnosti transformace genetické (Franklin a?Costello, 2007; Desouki et al., 2007).Metabolická transformace zahrnuje ztrátu schopnosti akumulovat zinek, co? má za?následek zru?ení inhibi?ního vlivu Zn2+ na m-akonitasu a následně tak dochází k?oxidaci citrátu. Dále dochází ke zmírnění inhibi?ního efektu zinku na terminální oxidaci a ke zmírnění efektu zinku na apoptosu. Maligní buňky tak mají více energie z?tvorby ATP k?metabolick?m a?bioenergetick?m změnám pro rozvoj malignity. Inhibice apoptosy vede k?umo?nění proliferace maligních buněk (Franklin et al., 2005b).S?metabolismem zinku úzce souvisí zinkové transportéry. Exprese transportér? Zip byla popsána u zdravé prostatické tkáně a u benigní hyperplasie prostaty (BHP). Zip transportéry byly identifikovány jako d?le?ité transportéry pro akumulaci zinku v?prostatick?ch buňkách. Ke sní?ení hladiny zinku a?ke sní?ení exprese Zip1 dochází u?prekanceros a v?po?áte?ních fázích rozvoje malignity. Sní?ené hladiny dále p?etrvávají v?progresi malignity (Costello et al., 2011b). D?le?itost transportéru Zip u?maligní transformace potvrdila studie, která dokládá, ?e exprese Zip1 je sní?ená u?Afroameri?an? ve srovnání s?Kavkazskou populací (Rishi et al., 2003). To koreluje se zv??enou incidencí karcinomu prostaty u??ernoch?. Zip1 byl v?nedávn?ch studiích ozna?en jako tumor supresorov? gen pro karcinom prostaty (Franklin et al., 2005a). Tumor supresorov? efekt zinku byl zaznamenán v?mnoha studiích (Franklin et al., 2005a; Johnson et al., 2010; Costello et al., 2011b; Gumulec et al., 2011a). U maligních buněk je vyvinut mechanismus downregulace Zip, kter? brání akumulaci zinku a jeho protinádorovému efektu na nádorovou buňku. Zinek inhibuje schopnost invazivity u?maligních buněk prostaty. Ishii s kolegy ukázal, ?e invazivita buněk LNCaP do?matrigelu je silně potla?ena v?p?ítomnosti Zn2+ (Ishii et al., 2001; Ishii et al., 2004). Dal?í studie poukazují na supresivní efekt zinku na angiogenezi a metastatick? potenciál nádorov?ch buněk prost?ednictvím specifick?ch drah, které regulují progresi karcinomu prostaty (Uzzo et al., 2006). Jiné studie v?ak tvrdí, ?e dlouhodobé p?sobení zinku u?karcinomu prostaty spí?e ?kodí (Leitzmann et al., 2003). Sní?ená schopnost prostatick?ch buněk akumulovat zinek m??e b?t zp?sobena také zv??en?m exportem zinku. Jedin?m zástupcem rodiny ZnT umístěn?m na plasmatické membráně buněk je ZnT-1 (ostatní jsou lokalizovány na membránách organel). Změna exprese ZnT-1 nebyla u?maligních buněk prostaty detekována (Franklin et al., 2005b; Gumulec et al., 2011b). V??e uvedená fakta nazna?ují, ?e změny ve schopnosti buněk akumulovat zinek p?edchází malignitě (Costello a Franklin, 2012). Z?d?vodu rozporupln?ch názor? na danou problematiku je t?eba dal?ího bádání a?hlub?ího pochopení mechanism? p?i krátkodobém i dlouhodobém p?sobení zinku na nádory prostaty. Na poodhalení této problematiky jsem se zamě?ila v?praktické ?ásti své práce, kde jsem se zaobírala anal?zou zinek rezistentních nádorov?ch buně?n?ch linií.3.2 Zinek Zinek je esenciální stopov? prvek pot?ebn? pro r?st a v?voj v?ech ?iv?ch organism?. Je podstatnou sou?ástí struktury ?ady protein?, mezi které pat?í také transkrip?ní faktory a?enzymy intracelulárních signálních drah. Zinek je nezbytn? pro aktivitu více ne? 300 enzym?. Podílí se tak na ?adě enzymatick?ch a metabolick?ch funkcí v?lidském těle. Více ne? 2000 transkrip?ních faktor? vy?aduje ke své funkci, k?udr?ení struktury proteinu a k?vazbě na DNA právě zine?naté ionty (Kambe et al., 2004; Murakami a?Hirano, 2008; Costello et al., 2011a).V?buňce je zinek uskladněn v endoplasmatickém retikulu (ER), Golgiho aparátu (GA) nebo zinkosomech (jednomembránové vezikuly od?těpené z?ER nebo GA). Zine?naté ionty v?znamně zasahují do celé ?ady buně?n?ch proces?. Zn2+ je signální molekula několika signálních a regula?ních kaskád. Zn2+ m??e kup?íkladu inhibovat funkci protein tyrozin fosfatas (PTP) a tím dále aktivovat ?adu kináz, zodpovědn?ch za buně?nou diferenciaci ?i za regulaci buně?ného cyklu. Těmito kinázami jsou zvlá?tě mitogen-aktivované proteinové kinasy (MAPK), které se ú?astní regulace mitózy, buně?né diferenciace, genové exprese, p?e?ívání buněk nebo apoptosy (Gumulec et al., 2011b). Metabolismus zinku je regulován zejména prost?ednictvím zinkem ?ízené transkripce, translace a intracelulární p?epravy zinkov?ch transportér? (Kambe et al., 2004). Zinek funguje podobně jako neurotransmitery (Murakami a Hirano, 2008). Murukami s kolegy (Murakami a Hirano, 2008) p?edpokládá, ?e se zinek chová také jako druh? posel. Zinek je nezbytn? v?jád?e pro normální funkci histon?, ostatních protein?, metaloenzym? (RNA a DNA polymerázy) a transkrip?ních faktor?. D?le?it?mi proteinov?mi doménami obsahující zinek jsou ?zink-finger“, které regulují aktivitu jednotliv?ch gen? (Vallee a Falchuk, 1993; Costello et al., 2011a). 3.2.1 Formy zinku v?buňce ? Zinek pevně vázan? na proteiny (metaloenzymy, metaloproteiny, nukleoproteiny) je ozna?ován jako imobilní. P?edstavuje nereaktivní pool zinku (více viz kapitola 3.3) ? Mobilní reaktivní zinek je vázan? volně na ligandy (na AMK, citrát) a p?edstavuje reaktivní pool zinku. Vyskytuje se ve formě Zn-ligand (více viz kap. Zinek vazebné struktury 3.3).? Voln? zinek jako Zn2+. P?edstavuje reaktivní pool zinku. Obecně je tedy intracelulární zinek vázán bu? na nemobilní makromolekuly (90 %), nebo na mobilní nízkomolekulární ligandy (10 %) (Costello et al., 2011a).Celková koncentrace zinku v?sav?ích buňkách je p?ibli?ně 0,2–1 mM. Cytosolická koncentrace zinku v?buňkách prostaty je p?ibli?ně 0,6–3 mM. Koncentrace zinku v?plasmě ?je p?ibli?ně 15?M. Z?toho je asi 85–90 % vázáno na proteiny. V?intersticiální tekutině (ISF), co? je p?ím? zdroj zinku pro buňky, je koncentrace Zn2+ p?ibli?ně 2 ?M. Pro p?ehlednost tyto údaje shrnuje tabulka 3 (Costello et al., 2011a).3.2.2 Zinek a nádorová transformaceZinek je d?kladně studován v?souvislosti s?celou ?adou nádorov?ch onemocnění. Jeho hladina je sní?ena u pacient? s?karcinomem jater, ?lu?níku, trávicího systému a prostaty. Nádorové buňky pot?ebují zinek k?p?e?ití a k?r?stu. Av?ak zv??ená hladina zinku p?sobí cytotoxicky. Zinek indukuje apoptosu u T i B lymfocyt? (Ibs a Rink, 2003)Tabulka 3: Koncentrace zinku v?tělních tekutinách. Dle (Costello et al., 2011a).koncentrace Zn2+plasma15 ?Mintersticiální tekutina (ISF)2 ?Mcytosol sav?ích buněkp?ibli?ně 0,2–1 mMcytosol prostatick?ch buněkp?ibli?ně 0,6–3 mMa?pravděpodobně i u nádorov?ch buněk (Murakami a Hirano, 2008). Hladina zinku je ovlivněna okolním mikroprost?edím nádorové tkáně. ?ada cytokin? a r?stov?ch faktor? (IL-6, HGF, EGF, TNF-α) ovlivňují p?ímo ?i nep?ímo expresní profil r?zn?ch zinkov?ch transportér?. ?írné buňky jsou d?le?it?m typem buněk v?nádorovém mikroprost?edí. Obsahují granula se zinkem, kter? mohou uvolňovat do okolního prost?edí. Intracelulární koncentraci volného zinku ovlivňují oxida?ně-reduk?ní reakce v?mikroprost?edí nádoru (Murakami a Hirano, 2008).3.3 Zinkové transportéryVoln? zinek (ve formě Zn2+) není propustn? jednoduchou difúzí p?es plasmatickou membránu (Costello et al., 2011a). Pro p?íjem zinku z?intersticiální tekutiny (ISF) jsou tedy nezbytné transportní mechanismy. Intracelulární koncentrace zinku je p?ísně kontrolována díky zinkov?m transportér?m, molekulám vázajících zinek a zinkov?m senzor?m. Import zine?nat?ch iont? ?ídí rodina transportér? Zip (SLC39), export je ?ízen ZnT p?ena?e?i (SLC30). V?znamn? intracelulární protein vázající zinek je metalothionein (MT). Expresi někter?ch protein?, které se podílejí na metabolismu zinku, p?ímo ovlivňuje metal regula?ní transkrip?ní faktor (MTF), protein detekující hladinu zine?nat?ch iont? (Murakami a Hirano, 2008). Transportéry Zip jsou a? na několik v?jimek lokalizovány na plasmatické membráně. Zvy?ují intracelulární koncentraci zinku. Jejich funkcí je import zinku z?ISF do buňky a?také transport zinku z?buně?n?ch organel do cytoplasmy (Eide, 2004). Transportéry ZnT jsou zodpovědné za import zinku do buně?n?ch organel a také export zinku z?buňky do ISF. Sni?ují tak intracelulární koncentraci zinku. Obrázek 3 znázorňuje lokalizaci jednotliv?ch zinkov?ch transportér?. Funkce, kinetika a?mechanismus transportu ve specifick?ch buňkách (kup?íkladu nádorov?ch) z?stávají prozatím, i p?es d?le?itost těchto transportér?, p?evá?ně neznámé (Costello et al., 2011a). Obecn? mechanismus transportu zinku z?krevní plasmy p?es ISF do buňky a dále do?buně?n?ch organel znázorňuje obrázek (viz obr. 4). Obrázek 3: Buně?ná lokalizace zinkov?ch transportér?: subcelulární lokalizace a?potencionální funkce ?len? rodiny transportér? Zip a ZnT. Směry transportu zinku jsou uvedeny ?ipkami. ER= endoplasmatické retikulum, GA=Golgiho aparát, MTs= metalothionein. Upraveno dle (Murakami a Hirano, 2008).Obrázek 4: Znázornění p?ímého transportu zinku vázaného na ligandy. (A) Transportéry pro import zinku lokalizované na plasmatické membráně (nap?. rodina transportér? Zip) a?(B) intracelulární transportéry na organelách (nap?. rodina transportér? ZnT). Jedná se o v?měnu zinku bezprost?edně mezi Zn-ligandem a Zn-transportérem. Nedochází k?tvorbě volného Zn2+ (Costello et al., 2011).3.3.1 ZipU ?lověka bylo charakterizováno 14 ?len? rodiny Zip. Poprvé byly tyto proteiny detekovány u?Saccharomyces cerevisie (Zrt proteiny) a u Arabidopsis thaliana (Irt proteiny). Jsou kódovány geny SLC39 (solute-linked carrier). Transportují nejen zinek, ale také ?elezo a ho??ík (Eide, 2004; Kambe et al., 2004).3.3.1.1 StrukturaZip transportéry vykazují nap?í? druhy vysok? stupeň homologie. Obecně obsahují 8 transmembránov?ch domén (TM) s?velkou hydrofilní intracelulární smy?kou mezi TM3 a?TM4 bohatou na histidin. Tyto smy?ky u protein? Zip jsou vysoce konzervované a je mo?né, ?e se ú?astní formace vazebného místa pro zinek (Costello et al., 2011a). Tuto domněnku potvrzuje muta?ní anal?za, která dokládá, ?e v?měna histidinu v?pozici 158 a?160 za alanin sni?uje schopnost buňky akumulovat zinek (viz p?íloha 6) (Milon et al., 2006). Ukazuje tedy, ?e tyto histidiny jsou nezbytné pro normální funkci tohoto transportéru. Vazebná doména pro zinek byla popsána na základě trojrozměrné struktury znám?ch protein? vázajících zinek. 3.3.1.2 P?ehled transportér? Zip Proteiny rodiny Zip jsou rozděleny do ?ty? podrodin: I, II, LIV-1 a gufA. Regulace exprese Zip u savc? není prozatím dob?e pochopena. Vět?ina z?nich je regulována samotn?m zinkem (Kambe et al., 2004). V?následujícím textu jsou popsány transportéry rodiny Zip, kter?mi jsem se zab?vala ve své práci a ty, u kter?ch byla detekována souvislost s?metabolismem zine?nat?ch iont? v?prostatické tkáni. V?echny transportéry rodiny Zip jsou shrnuty v?tabulce na?konci kapitoly 3.3.2 (viz tab. 4).hZip1 je d?le?it? transportér pro import zinku v?sav?ích buňkách. Pro svou aktivitu (stejně jako hZIP2) nevy?aduje ATP (Eide, 2004). Aktivitu tohoto transportéru mohou inhibovat některé p?echodné kovy (Ni, Cu, Fe, Cd). Subcelulární lokalizace je r?zná v?závislosti na typu buněk. Gen tohoto proteinu (hZIP1) je exprimován ve v?ech buňkách. To nazna?uje, ?e hZip1 protein má zásadní funkci v?mnoha typech buněk (Kambe et al., 2004). Tento transportér hraje v?znamnou roli v?akumulaci Zn2+ v?prostatick?ch buňkách (Gaither a Eide, 2001; Kambe et al., 2004). V?prostatické tkáni je transportér Zip1 lokalizován na bazolaterální straně membrán buněk normálního ?lázového epitelu. Co? odpovídá funkci těchto transportér? pro import zinku z?intersticiální tekutiny (pota?mo séra) (Desouki et al., 2007).hZip2 byl první charakterizovan? ?len rodiny Zip u savc? a to na základě podobnosti s?tímto proteinem u kvasinek a rostlin. Studie (Gaither a Eide, 2000) dokládají expresi hZip2 v?tkáni prostaty a dělohy. Dal?í studie potvrzují expresi také v?mononukleárních leukocytech a v?monocytech (Cao et al., 2001). hZip3 je exprimován zejména v?kostní d?eni a ve slezině, méně pak v?tenkém st?evě a?v?jaterní tkáni. Jeho exprese byla také detekována v?prostatické tkáni. P?ena?e?e Zip2 a Zip3 jsou p?evá?ně lokalizovány na apikální straně buněk. P?edpokládá se proto, ?e jejich funkcí není akumulovat zinek z?cirkulace, ale reabsorbovat zinek z?prostatické tekutiny (Desouki et al., 2007).hZip6 (ozna?ován také jako LIV1) byl identifikován jako gen regulovan? estrogenem. Jeho zv??ená exprese je asociována s??í?ením karcinomu prsu do?lymfatick?ch uzlin (Taylor et al., 2007). LIV1 mRNA byla detekována u karcinomu prostaty a u BHP (Manning et al., 1994; Manning et al., 1995) a také v?placentě a?v?buňkách HeLa (Taylor et al., 2003). 3.3.2 ZNTZnT proteinová rodina (ozna?ována také jako CDF) je kódována geny SLC30. Tyto transportéry jsou zodpovědné za import zinku do buně?n?ch organel. Tato rodina byla rozdělena do t?í podrodin (I–III). U ?lověka je popsáno 9 typ? těchto transportér?, které jsou ozna?ovány jako ZnT-1–ZnT-9 (Liuzzi a Cousins, 2004). Tyto proteiny jsou transkrip?ně a posttransla?ně regulovány zinkem. Exprese ZnT-1 a?ZnT-2 je indukována vysokou koncentrací zinku (Langmade et al., 2000). To odpovídá mo?né roli ZnT p?i detoxikaci zinku.V?následujícím textu popisuji ty transportéry ZnT, které mají souvislost s?metabolismem zinku v?prostatické tkáni a ty, kter?mi jsem se zab?vala ve své práci. Souhrnné informace o transportérech rodiny ZnT jsou uvedeny v tabulce na konci kapitoly (viz tab. 4).3.3.2.1 Struktura Proteinová struktura ZnT transportér? obsahuje obvykle 6 transmembránov?ch domén s?velkou smy?kou mezi doménou 4 a 5. ZnT tvo?í homo a?heterodimery, které jsou pravděpodobně nutné pro jejich funkci transportér? zinku. Rentgenová krystalografie struktury homologu ZnT u E. coli ukazuje, ?e transmembránové domény homodimeru formují prázdn? prostor v?membráně. Tento prostor obsahuje intracelulární a?extracelulární dutinu, která vá?e zinek a je pravděpodobné, ?e se podílí na transportu zine?nat?ch iont? p?es membránu (Costello et al., 2011a).3.3.2.2 P?ehled transportér? ZNTZnT-1 je exprimován ve v?ech tkáních, více pak v?tenkém st?evě, ledvinách a?placentě. Exprese je v?razně zv??ena v buně?n?ch kulturách po o?et?ení zinkem (Kambe et al., 2004; Devergnas et al., 2004). Tento transportér byl také identifikován u?prostatick?ch buněk (Franklin et al., 2005b). Transkripce je ?ízena MTF. Promotor ZnT-1 obsahuje dvě sekvence pro MRE (metal response element). MTF se vá?e na obě vazebná místa a?tím aktivuje transkripci (Kambe et al., 2004).Funkcí zinkového transportéru ZnT-2 je zadr?ovat zinek v?endosomech (Kambe et?al., 2004). Exprese ZnT-2 byla detekována v?tenkém st?evě, ledvinách, varlatech, placentě, v?prsní ?láze a?v?prostatě. Zv??ená exprese tohoto proteinu byla také detekována?v?periferní zóně prostatické ?lázy v?místech, kde dochází k?exkreci zinku do?seminální tekutiny (Iguchi et al., 2002). ZnT-5 byl identifikován na základě homologie se?ZnT-1. ZnT-5 mRNA byla detekována ve v?ech tkáních, zejména v?ak v?pankreatu (v?insulin produkujících β?buňkách), v prostatě, ve vaje?nících a ve?varlatech (Kambe et al., 2004). Na rozdíl od?ZnT-1 není exprese ZnT-5 (ani ZnT-7) ovlivněna p?ídavkem zinku do?extracelulárního prost?edí (Devergnas et al., 2004). Obecn? mechanismus transportu zinku z?krevní plasmy p?es ISF do buňky a dále do?buně?n?ch organel znázorňuje obrázek 4. Tabulka 4: Souhrnné informace o zinkov?ch transportérech t?ídy ZnT a Zip u ?lověka. Upraveno dle (Hogstrand et al., 2009).ozna?ení proteinuozna?ení genu (dle HUGO)za?azení do podrodinyexpreseasociace s?patologick?m stavem buně?ná lokalizacemolekulární funkceZnT-1SLC30A1-rozsáhláAlzheimerova choroba,karcinom plicplasmatická membránaexport zinku z cytoplasmyZnT-2SLC30A2-tenké st?evo, ledviny, pankreas, varlata, semenné vá?ky, prsní ?láza, prostatakarcinom prostaty(sní?ená zinková tolerance)lysozomy,vezikulytransport zinku do lysozom? a plasmatick?ch vezikul?ZnT-3SLC30A3-mozek, varlataAlzheimerova choroba,odpovědnost za ZEN u CA1synaptické vezikulytransport zinku do synaptick?ch vezikul?ZnT-4SLC30A4-prsní ?láza, mozek, tenké st?evo, placenta, krevní buňky, ?írné buňky, buňky epiteluAlzheimerova chorobakarcinom plic endosomy, GAtransport zinku do vezikul? v?buňkách mlé?n?ch ?láz a??írn?ch buňkáchZnT-5SLC30A5-β buňky pankreatu, st?evo, srdce, mozek, játra, ledviny, krevní buňky, epiteliální buňkysrde?ní selhání a kostní abnormality u?my?íGA, insulinová granula, varianta b na plasmatické membráně v?komplexu s?ZnT-6transport zinku do GAa vezikul?ZnT-6SLC30A6-tenké st?evo, mozek, játra, krevní buňky, tuková tkáňAlzheimerova nemocGA, plasmatická membrána (v?komplexu s?ZnT-5)transport zinku do GAa vezikul?ZnT-7SLC30A7-tenké st?evo, játra, sítnice, slezina, krevní buňky-GAtransport zinku do GAZnT-8SLC30A8-β buňky pankreatuDiabetes mellitusinsulinová granula, cytoplasma, jádrotransport zinkuTabulka 4: Souhrnné informace o zinkov?ch transportérech t?ídy ZnT a Zip u ?lověka (pokra?ování). Upraveno dle (Hogstrand et al., 2009).ozna?ení proteinuozna?ení genu (dle HUGO)za?azení do podrodinyexpreseasociace s?patologick?m stavem buně?ná lokalizacemolekulární funkceZnT-9SLC30A9-rozsáhle-plasmatická membránaneznámáZIP1SLC39A1IIrozsáhlekarcinom prostatyplasmatická membránaimport zinkuZIP2SLC39A2IIprostata, děloha, epitel cervixu, optick? nerv, monocytykarcinom prostatyplasmatická membránaimport zinkuZIP3SLC39A3IIrozsáhlekarcinom prostatyplasmatická membránaimport zinkuZIP4SLC39A4LIV-1Atenké a tlusté st?evo, slepé st?evo, ledvinyAcrodermatitis enteropathicaapikální strana plasmatické membrányimport zinkuZIP5SLC39A5LIV-1Aledviny, játra, slezina, st?evo, ?aludek, pankreas-bazolaterální strana u?polarizovan?ch buněkimport zinkuZIP6SLC39A6LIV-1rozsáhlekarcinom prsuplasmatická membránaimport zinkuZIP7SLC39A7KE4/LIV-1rozsáhletamoxifen rezistentní karcinom prsuER, GAimport zinkuZIP8SLC39A8LIV-1rozsáhletestikulární citlivost na kadmiumvezikuly, plasmatická membrána, mitochondrieimport Zn, Cd, MgZIP9SLC39A9Irozsáhle-neznámáneznámáZIP10SLC39A10LIV-1rozsáhlekarcinom prsuplasmatická membránaimport zinkuZIP11SLC39A11GufArozsáhle-neznámáneznámáTabulka 4: Souhrnné informace o zinkov?ch transportérech t?ídy ZnT a Zip u ?lověka (pokra?ování). Upraveno dle (Hogstrand et al., 2009).ozna?ení proteinuozna?ení genu (dle HUGO)za?azení do podrodinyexpreseasociace s?patologick?m stavem buně?ná lokalizacemolekulární funkceZIP12SLC39A12LIV-1mozek, plíce, varlata, sítniceastma, na SNP vázaná schizofrenieplasmatická membránaimport zinkuZIP13SLC39A13KE4/LIV-1rozsáhleEhlers?v-Danlos?v syndrom (EDS)GAimport zinkuZIP14SLC39A14LIV-1rozsáhleastma, zánět zprost?edkovan? IL-6plasmatická membránap?íjem zinku a ?eleza nevázaného na transferinGA- Golgiho aparát, ER- endoplasmatické retikulum, SNP-jednonukleotidov? polymorfismus, ZEN- zinc-enriched neurons, na zinek bohaté neurony, CA1 -cornu ammonis 1 (malá oblast vlastního hyppocampu).3.4 Zinek vazebné struktury Mezi d?le?ité cytosolické ligandy, které mají schopnost vázat a následně odevzdávat zinek, pat?í nízkomolekulární organické kyseliny a metalothionein. D?le?it?m transkrip?ním faktorem, kter? reguluje metabolismus a homeostasu zinku je metal regula?ní transkrip?ní faktor (MTF). Dále jsou do?této kapitoly za?azeny matrixové metaloproteinasy, nebo? mají schopnost vázat zinek a jsou studovány v?souvislosti s?nádorov?m onemocněním. Také jsou popsány jejich tkáňové inhibitory (TIMP). 3.4.1 Nízkomolekulární organické kyselinyDo této skupiny pat?í zejména citrát, aspartát, histidin a cystein. Dále pak jiné organické ligandy dle typu buněk. Epiteliální buňky zdravé prostatické tkáně produkují velmi vysoké koncentrace aspartátu a citrátu. Z?tohoto d?vodu je pravděpodobné, ?e zvlá?tě Zn-citrát a Zn-aspartát jsou d?le?it?mi ligandy pro vazbu zinku, jeho distribuci a?dostupnost. Nízkomolekulární organické ligandy v?ak nejsou homeostatickou slo?kou regulace zinku, nebo? jejich koncentrace není regulována v?závislosti na intracelulární koncentraci Zn2+ (Costello et al., 2011a).3.4.2 MetalothioneinMetalothioneiny (MT) jsou malé (6–7 kDa) proteiny bez enzymatické aktivity. Ve své struktu?e obsahují 20 cystein? a díky -SH skupinám vá?í do své struktury a? sedm dvojmocn?ch iont? kov? (viz obr. 5). Vazba s?ionty kov? stabilizuje trojrozměrnou strukturu metalothionienu. MT hrají klí?ovou roli v?transportu tě?k?ch kov? (také zinku), p?i jejich detoxikaci a?v?ochraně buněk p?ed oxida?ním stresem (Sztalmachova, 2013).3.4.2.1 StrukturaMT je slo?en ze dvou domén, které tvo?í termodynamicky stabilní a kineticky labilní komplexy s?ionty kov?. Cysteinové zbytky jsou umístěny na povrchu proteinu a tak umo?ňují rychl? a?p?ím? transport kov? na malé molekuly a jiné proteiny. Je pravděpodobné, ?e dochází k?p?ím?m v?měnám zinku mezi nízkomolekulárními organick?mi ligandy a?metalothioneinem.Obrázek 5: Proteinová struktura metalothioneinu. Skládá se z α a β domény. Díky cysteinov?m -SH skupinám (?lutě) m??e vázat MT 4–7 iont? zinku (zeleně). Dle (, 12.3.2014).3.4.2.2 FunkceD?le?itou funkcí metalothioneinu je detoxikace kov? a udr?ování jejich hladiny v?buňkách. Dal?í d?le?itou funkcí MT je ochrana p?ed buně?n?m stresem. Metalothionein interaguje s?reaktivními kyslíkov?mi radikály (ROS) a má také silné antioxida?ní vlastnosti. Funkce tohoto proteinu zasahuje také do regulace apoptosy, zv??ené hladiny MT p?sobí antiapoptoticky (Sztalmachova, 2013). MT reguluje hladinu, buně?nou lokalizaci a aktivitu transkrip?ního faktoru NF-κB. Ten zprost?edkovává ochranu buněk p?ed apoptosou díky aktivaci antiapoptotick?ch gen? a protoonkogen? Bcl-2, c-myc a?TRAF-1 (Gumulec et al., 2011b). MT se podílí na transportu zinku do mitochondrií a do jádra (Sztalmachova, 2013).3.4.2.3 ExpreseMT je d?le?it?m vazebn?m proteinem pro zinek. Pokud intracelulární koncentrace Zn2+ dosáhne prahové hodnoty, je aktivován metal regula?ní transkrip?ní faktor (MTF-1). Ten indukuje mj. expresi MT, je? na sebe zinek vá?e. Molekuly MT jsou mobilní ligandy, doru?ují zinek organelám k?jejich aktivním míst?m. Bylo detekováno, ?e Zn-MT proniká vněj?í mitochondriální membránou a vstupuje do mezimembránového prostoru (Ye et al., 2001). Pak je dále transportován do matrix mitochondrií cestou p?ímé v?měny prost?ednictvím transportních protein? (Costello et al., 2011a).?ada nedávn?ch studií poukazuje na souvislosti mezi MT a?patologick?mi stavy organismu, zejména malignitami. Zv??ené sérové hladiny MT byly detekovány u?karcinom? prsu, plic, trávicího a?urogenitálního traktu. U CaP jsou hladiny MT v?sérech pacient? zv??eny 3x ve srovnání se zdravou populací. Mechanismus a p?í?ina zv??ené sérové hladiny nejsou zcela ujasněny. I?p?es to je mo?né, ?e zv??ená hladina MT je zodpovědná za ochranu nádorov?ch buněk p?ed apoptosou, za zv??enou proliferaci a za schopnost nádoru metastazovat (Gumulec et al., 2011b).3.4.3 Metal regula?ní transkrip?ní faktorMetal regula?ní transkrip?ní faktor (MTF-1; MRE binding transcription factor) je klí?ov?m regulátorem hladiny zinku i jin?ch kov? v?buňce (Gumulec et al., 2011b). MTF hraje d?le?itou roli v?buně?né odpovědi na expozici tě?k?mi kovy. Je také zapojen do buně?n?ch pochod? reagujících na oxida?ní stres a hypoxii. Má vliv na expresi MT a?někter?ch zinkov?ch transportér?. MTF protein obsahuje 6 zinkov?ch prst?, díky nim? se vá?e na MRE (metal response element). Tento DNA motiv obsahuje sekvenci nukleotid? TGCRCNC (R=A nebo G, N=jak?koli nukleotid), která je p?ítomna v?několika kopiích v?promotoru v?ech gen? pro MT a v?promotorech jin?ch gen? regulovan?ch MTF (zinkové transportéry ZnT-1, ZnT-2, Zip10). Za fyziologick?ch podmínek je MTF-1 v?buňce inaktivován vazbou s?MTI. Ten inhibuje vazbu MTF-1 na MRE. MTF je aktivován vazbou iontu kovu, fosforylací nebo oxida?ním stresem. MTF-1 je uvolněn, je transportován do jádra a?m??e aktivovat transkripci metalothioneinu nebo jin?ch MTF ?ízen?ch gen?. K??ízení exprese cílového genu interaguje MTF-1 s?jin?mi transkrip?ními faktory a koaktivátory (Wang et al., 2004; Gumulec et al., 2011b; Gunther et al., 2012; Sztalmachova, 2013).MTF-1 hraje d?le?itou roli p?i homeostase a detoxikaci tě?k?ch kov?. Napomáhá ochraně organismu proti hypoxii a oxida?nímu stresu. 3.4.4 Matrixové metaloproteinasy Matrixové metaloproteinasy (MMP) jsou d?le?itou skupinou zinek vázajících protein? s?celou ?adou d?le?it?ch fyziologick?ch funkcí. Byly charakterizovány jako mo?né markery r?zn?ch patologick?ch stav?, v?etně malignit (Zitka et al., 2010). Na d?le?itost těchto protein? poukazuje schopnost MMP ?těpit extracelulární matrix i?povrchové proteiny buněk a tak podporovat metastasování a?angiogenezi (van Zijl et al., 2011).O MMP a souvislostech s?nádorov?m bujením jsem pojednávala ve své bakalá?ské práci (Axmanová, 2012). Souhrnné informace o struktu?e MMP, jejich funkcích jsou uvedeny v p?ílohách (viz p?íloha 7) (Zitka et al., 2010).3.4.5 Tkáňové inhibitory matrixov?ch metaloproteinas Tkáňové inhibitory matrixov?ch metaloproteinas (TIMP) jsou hlavními endogenními regulátory MMP ve tkáni. Do této proteinové rodiny nále?í ?ty?i homology ozna?ované jako TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 a TIMP-4. Tyto proteiny se vá?ou reverzibilně k?MMP v?poměru 1:1. Li?í se od sebe tkáňovou specifitou exprese a schopností inhibovat r?zné MMP (viz tab. 5). Exprese TIMP-1 a TIMP-2 je regulována cytokiny (nap?. tumor necrosis factor-α, TNF- α). TNF- α m??e modifikovat expresi TIMP-1 indukcí NF-κB. TIMP-1 a TIPM-2 vykazují mitogenní aktivitu u r?zn?ch typ? buněk. TIMP-3 byl detekován v?myokardu my?ích embryí. Je tedy mo?né zapojení tohoto proteinu do embryonální remodelace extracelulární matrix a do v?voje srdce (Apte et al., 1994). TIMP-3 ú?inněji moduluje aktivitu MMP ne? ostatní TIMP (AnandApte et al., 1996). Vysoká exprese TIMP-4 byla detekována v?srde?ní tkáni. Tento protein byl stanoven rovně? v?ledvinách a ve st?evě (Tummalapalli et al., 2001). Zv??ená produkce TIMP inhibuje r?st r?zn?ch typ? nádorov?ch buněk. Sní?ená koncentrace TIMP v?pr?běhu remodelace po?kozené tkáně zvy?uje kolagenasovou aktivitu a umo?ňuje nádorov?m buňkám naru?it extracelulární okolí a migrovat tak do?okolních tkání (Ponton et al., 1991; Zitka et al., 2010). Klasifikace a charakteristika TIMP je uvedena v?následující tabulce (viz tab. 5). Tabulka 5: Klasifikace tkáňov?ch inhibitor? martixov?ch metaloproteinas. Dle (Zitka et al., 2010).inhibované MMPexpreselokalizacetkáňová specifitaTIMP-1v?echny a? na MMP-14indukovanádifúzníkosti, vaje?níkyTIMP-2v?echnykonstitutivnídifúzníplacentaTIMP-3MMP-1, -2, -3, -9, -13indukovanáasociována s ECMledviny, mozekTIMP-4MMP-1, -2, -3, -7, -9nedetekovánodifúznísrdce4 C?LE Vytvo?ení zinek rezistentní buně?né linie odvozené a vyselektované z?wild type (wt) linie agresivní formy nádoru prostaty (PC3 linie). Anal?za exprese vybran?ch gen? korespondujících s?metabolismem a transportem zine?nat?ch iont? (zinkové transportéry ZnT a Zip, metalothionein, matrixové metaloproteinasy, tkáňové inhibitory matrixov?ch metaloproteinas). Test schopnosti migrace zinek rezistentní a wild type linie s?vyu?itím scratch assay (Geback et al., 2009). Optimalizace a kalibrace metody imunocytochemie. Aplikace této metody na tkáňové kultury. Imunocytochemická anal?za vybran?ch protein? souvisejících s?metabolismem a transportem zine?nat?ch iont? (Zip, ZnT, MT, MTF). Porovnání citlivosti wt a zinek rezistentních linií k?vybranému cytostatiku (cisPt) pomocí MTT testu. Fluorescen?ní detekce intracelulárního zinku a voln?ch thiol?.5 EXPERIMENT?LN? ??ST5.1 Materiál a metodika5.1.1 Práce s buně?n?mi kulturamiPro kultivaci a následnou anal?zu byla vyu?ita buně?ná linie wt PC3. Tato buně?ná linie je odvozená ze 4. stupně adenokarcinomu prostaty z?metastas z?kostí a je androgen nezávislá (HPA Culture Collections, Salisbury, UK). Materiál a pou?ité p?ístrojeKultiva?ní média Ham?s F-12 (PAA Laboratorie GmbH, Rakousko), EDTA (kys. ethylendiamintetraoctová) (PAA, Rakousko), PBS (SIGMA Aldrich, Německo), Trypsin (PAA, Rakousko), ATB (PAA, ?v?carsko), FBS (PAA, Rakousko), ZnSO4 (Sigma-Aldrich, Německo), kultiva?ní plastové nádobky, plastové zkumavky, pipety, nástavec, mikrozkumavky, mikroskop NICON ECLIPSE TS100 (Nicon, Japonsko), centrifuga 5810 R (Eppendorf, Německo), CO2 termobox (Sanyo, Schoeller), p?ístroj na po?ítání buněk Casy Model TT System (Roche, ?v?carsko), laminární box Clean Air (Sanyo, Scholeller).MetodikaP?i postupech pracujeme ve sterilním prost?edí, pou?íváme jednorázov? plastov? ?i?sterilní materiál. Buňky dodávané od v?robce se uchovávají zmra?ené.Postup? Buňky byly rozmra?eny a p?epipetovány spolu se 3 ml kultiva?ního média do?centrifuga?ní zkumavky? Po centrifugaci 7?min. p?i 2700 g byl supernatant odsát a sediment rozsuspenzován v?1?ml p?íslu?ného média. ? Tato suspenze byla napipetována do kultiva?ních lahvi?ek s?6 ml nále?itého média. Buňky byly kultivovány v?termostatu p?i 37 °C a 5 % CO2.? Na lahvi?ce bylo uvedeno datum po?átku kultivace, o kolikátou pasá? se jedná a na?e iniciály, abychom p?ede?li záměně.? Buně?né linie byly během kultivace pozorovány pod mikroskopem p?i zvět?ení 100x.? P?ibli?ně jednou za t?i dny je t?eba vyměnit médium. Staré médium bylo odsáto, buňky promyty 2 ml PBS a p?idáno 6 ml ?erstvého média. P?i 80% konfluenci buněk byly tkáňové kultury pasá?ovány nebo jinak zpracovávány. Pasá?ování? Bylo odsáto staré médium, buňky byly promyty 2 ml EDTA a dále promyty 2 ml ?eděného trypsinu (1:9) po dobu 30 s.? Trypsin byl odsán, kultiva?ní lahvi?ka nechána 3 min. v?termostatu. ? Buňky byly spláchnuty 2 ml p?íslu?ného média, suspenze byla p?epipetována do?centrifuga?ních zkumavek a proběhla centrifugace 7?min. p?i 2700 g.? Po centrifugaci byl odsát supernatant, buňky byly rozsuspendovány ve 2 ml média. ? Do nov?ch, p?edem ozna?en?ch kultiva?ních lahvi?ek bylo napipetováno 6?ml p?íslu?ného média a?100 μl p?ipravené suspenze buněk. Nádobky s?buňkami byly kultivovány v termostatu p?i 37 °C a 5 % CO2.5.1.2 Vytvá?ení zinek rezistentních buně?n?ch liniíMateriál2 M ZnSO4, voda pro tkáňové kultury, kultiva?ní média, pipety, ?pi?ky, kultiva?ní plast. MetodikaVytvo?ení zinek rezistentní linie bylo dosa?eno postupn?m zvy?ováním mno?ství zine?nat?ch iont? (ZnSO4) v kultiva?ním médiu tak, aby v?sledná koncentrace zine?nat?ch iont? v?kultiva?ním médiu pro linii PC3 byla postupně 25 ?M, 50 ?M, 75??M a vy??í. Ochota buněk stávat se rezistentní v??i zinku je dána typem buně?né linie, aktuálním nár?stem koncentrace Zn2+, dobou kultivace. Principem je pozitivní selekce buněk rezistentních k?zinku. Doba pot?ebná ke vzniku linie PC3 rezistentní na?zinek byla minimálně t?i měsíce. Následující experimenty byly prováděny s?buně?n?mi liniemi rezistentními na zinek v?koncentraci 50, 100 a 150 ?M, co? je p?ibli?ně 1, 2 a 3 násobek hodnoty IC50 pro wt PC3 buně?nou linii k?zinku (na základě anal?zy MTT).Postup? P?i pasá?ování buněk byla do kultiva?ního média p?idána odpovídající koncentrace zine?nat?ch iont?.? Buňky byly kultivovány za standardních podmínek (37 °C, 5 % CO2).? P?i ka?dé v?měně média bylo nutno opět dodat pot?ebné mno?ství Zn2+.? Buňky byly pozorovány pod mikroskopem a pr?bě?ně byla hodnocena jejich viabilita a?mitotick? potenciál, proliferace.5.1.3 Izolace mRNAK?izolaci RNA byl pou?it kit dodávan? firmou Roche (High Pure RNA Isolation Kit, Německo). Jednotlivé roztoky pot?ebné k?izolaci mRNA jsou sou?ástí tohoto kitu (lyza?ní pufr, DNasa, inkuba?ní pufr, prom?vací pufr I a II, elu?ní pufr), PBS.Materiál a pou?ité p?ístrojeJednorázov? plastov? ?i sterilní materiál, pipety, ?krabky na buňky, centrifuga?ní zkumavky, mikrozkumavky, filtra?ní mikrozkumavky, NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, USA). Postup? Buňky byly sklizeny mechanicky pomocí ?krabky na buňky do stávajícího média. Médium s?buňkami bylo p?eneseno do centrifuga?ní zkumavky.? Po centrifugaci p?i 2700 g po 7 min. bylo médium odsáto, pelet buněk byl rozsuspendován v?2 ml PBS. ? Po centrifugaci p?i stejn?ch parametrech (2700 g po 7 min.) byl PBS odsát.? Pelet buněk byl rozsuspendován v?200 μl PBS.? Dále bylo pokra?ováno dle instrukcí v?robce izola?ního kitu (High Pure RNA Isolation Kit, Německo).? Získaná buně?ná mRNA byla dále zpracována nebo zamrazena na - 70 °C k?dal?í anal?ze. Mě?ení ?istoty a koncentrace vyizolované mRNA? Izolovaná mRNA byla mě?ena na Nanodropu k?detekci koncentrace nukleov?ch keselin a ?istoty vzorku.?istá RNA je charakteristická parametry:A260/280 > 2 (poměr charakterizuje kontaminaci bílkovinami) A260/230 > 1,8 (kontaminace chalotropními solemi a fenolem)5.1.4 Reverzní transkripceK?p?episu izolované mRNA do cDNA byl pou?it Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Německo).Materiál a pou?ité p?ístrojePipety, mikrozkumavky, mrazící desti?ka, mikrocentrifuga (Eppendorf, Germany), sterilní box, termocykler (Labcycler, Schoeller). Postup? Vzorek mRNA na?edíme PCR ?istou vodou do objemu 11 μl (na mno?ství RNA 500?ng), p?ipipetujeme 2 μl random hexamer?, vzorky vlo?íme do termocycleru a?nastavíme program na 10 min. p?i 65 °C.? P?ipipetujeme 7 μl mastermixu (viz tab. 6), vlo?íme do termocycleru. P?epis probíhá p?i těchto paremetrech: 10 min., 25 °C; 60 min., 50 °C; 5 min., 85 °C.Takto získaná cDNA je ihned pou?ita k?anal?ze qRT-PCR, nebo uchována k?pozděj?ímu zpracování p?i – 20 °C.Tabulka 6 : Slo?ení mastermixu pro reverzní transkripci.0,5 μl inhibitoru (Protector RNase inhibitor, 40 U/μl)0,5 μl transkriptasy (Transcriptor Reverse Transcriptase, 20 U/μl))4 μl pufru (Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5x konc.)2 μl dTP (Deoxynucleotide Mix, 10 mM ka?d?)5.1.5 Kvantitativní PCR v?reálném ?ase (qRT-PCR)Anal?za byla provedena s?vyu?itím chemismu TaqMan sond. Ve?keré roztoky jsou dodávané firmou Applied Biosystems, USA (pou?ité sondy viz tab. 7).Materiál a pou?ité p?ístrojePipety, mikrozkumavky, mrazící desti?ka, mikrocentrifuga, sterilní box, analyzátor Real-Time PCR (ABI Prism 7000 Sequence Detection Systems; Applied Biosystems, USA).Anal?za byla provedena s?vyu?itím chemismu TaqMan sond, které se vá?ou na?cílové struktury a po ?těpení DNA-polymerasou fluoreskují. Fluorescence je zaznamenána p?ístrojem.Postup? 5x na?eděnéného vzorku cDNA bylo pipetováno 5 μl do ka?dé jamky mikrotitra?ní desti?ky. Seznam detekovan?ch gen? a jejich assay ID je uveden v?tabulce sedm.? Do ka?dé jamky bylo pipetováno 15 μl reak?ní směsi na PCR (viz tab. 8).? Jako referen?ní gen byl pou?it β-aktin.? Reakce probíhala v p?ístroji ABI PRISM 7000 dle programu: 94 °C, 10 min.; 94 °C, 10 s; 60 °C, 1 min. Bylo provedeno 40 cykl? PCR.? Získaná data z p?ístroje byla vyhodnocena s?pou?itím metody ?delta delta Ct“ podle metodiky navr?ené Applied Biosystems. Exprese β-aktinu se pou?ívá pro normalizování hodnot exprese cílového genu. Tabulka 7: Pou?ité sondy.detekovan? genassay IDMT1AHs00831826_mlMT2AHs02379661_mlZip1Hs00205358_mlZnT-1Hs00253602_mlMMP2Hs01518727_mlMMP9Hs00234579_mlTIMP1Hs00171558_mlTIMP2Hs00234278_mlβ-aktinHs99999903_mlTabulka 8: Reak?ní směs na PCR (uvedené hodnoty jsou na jeden vzorek).1 μl roztoku sonda + primer (pro ka?d? gen zvlá??)10 μl Master Mix (dodáno v?robcem) 4 μl vody 5.1.6 ImunocytochemieChemikáliePrimární protilátky: MT, rabbit polyclonal Ab (sc-11377); ZIP-1, goat polyclonal Ab (sc-103945); MTF-1 goat polyclonal Ab (sc-26844); Zn-t-1, goat polyclonal Ab (sc-27501). V?echny protilátky jsou od Santa Cruz Biotechnology.Sekundární protilátky: peroxidase goat anti-rabbit IgG antibody (Vector laboratories), bovine anti-goat IgG-HRP (sc- 2352 Santa Cruz Biotechnology).Kultiva?ní média Ham?s F-12 (PAA Laboratorie GmbH, Rakousko), peroxid vodíku (Lach-Ner), PBS (Invitrogen, USA), Normal Horse Serum (Vector Laboratories), DAB (Liquid DAB+ Substrate Chromogen System, DAKO), Hematoxylin Mayer?v (?erstvě p?ipraven?, na 100 ml destilované vody: 0,1 g hematoxylin, 0,02 g jodi?nan sodn?, 5 g síran hlinito-draseln?, 0,1 g kys. citronová, 5 g chlorhydrát), kanadsk? balzám (Intraco Micro), xylen (Chemopol, Praha), metanol (Penta, Chrudim) etanol (Penta, Chrudim), aceton (ML chemica, Troubsko), voda destilovaná, voda vodovodní, Tween (Sigma-Aldrich).Ostatní materiál a pou?ité p?ístrojeBuně?ná suspenze, box s?laminárním prouděním vzduchu (Merci, ?R), centrifuga 5810R (Eppendorf, Německo), magnetické míchadlo (Laboratorní p?ístroje, Praha), termostat (Robbins Scientific Corporation, USA), mikroskop (Nikon, Optiphot 2, Japan), podlo?ní skla, Petriho misky, barvící kyvety, vlhká kom?rka, hydrofobní fix, pipety, nástavec na pipety, ?pi?ky, kádinka, mikrozkumavky, filtra?ní papír, laboratorní sklo, buni?ina.MetodikaImunocytochemická anal?za se vyu?ívá k?detekci protein? v?buně?n?ch preparátech. Metoda vyu?ívá vazby primární protilátky na studovan? protein (antigenní determinantu). Na primární protilátku se následně vá?e protilátka sekundární, která je zna?ená k?enovou peroxidasou (HRP). HRP p?eměňuje substrát DAB (3, 3?diaminobenzidin) na hnědě zbarven? produkt. Jádra dobarvená hematoxylinem jsou modrá. K?zavedení a optimalizaci metody pro místní podmínky jsem vyu?ila následujících zdroj?: - Postupy pou?ívané pro rutinní imunohistochemickou diagnostiku v?laborato?ích na??stavu patologie FN Brno.- Postupy pou?ívané na ?stavu histologie a embryologie LF UPOL pro v?zkumné ú?ely.- Pr?vodce pro zna?ení antigen? od firmy Vector Laboratories (, 12.3.2014).- Informace k systému pro imunoperoxidasové zna?ení (, 12.3.2014).- Metodiku popsanou v publikaci Knoeppa a koleg? (Knoepp et al., 2013).Postup? Buně?ná suspenze byla p?i pasá?ování rozseta na sterilní podlo?ní sklo v?Petriho misce.? Buňky adherovaly na podlo?ní sklo p?ibli?ně 4 h v?termostatu, pak byla Petriho miska doplněna p?íslu?n?m kultiva?ním médiem.? Po nár?stu buněk do 80% konfluence byly buňky po oplachu PBS fixovány 10 min. ledovou směsí metanol/aceton v?poměru 1:1. (Po tomto kroku lze buňky uchovat pro pozděj?í anal?zu p?i - 20 °C.)? Podlo?ní skla byla opláchnuta 3x v?PBS po dobu 5 min. Posledních 5 min. byl do PBS p?idáno 10 ?l detergentu TWEEN-20.? 3% peroxidem vodíku (?eděn?m v?destilované vodě) byla 20 min. blokována endogenní peroxidasa.? Preparáty byly opláchnuty 3x po 5 min. v?PBS.? Okolí preparátu bylo ozna?eno hydrofobním fixem.? Nespecifické vazebné pozadí bylo blokováno normálním koňsk?m sérem (NHS) po dobu 10 min (, 12.3.2014).? Následně byla aplikována p?íslu?ná primární protilátka na?eděná v poměru 1:50 v?PBS. Inkubace probíhala p?es noc (16 h) p?i 4 °C ve vlhké kom?rce.? Po inkubaci byly preparáty 3x pláchnuty v?PBS po 5 min.? Byla aplikována p?íslu?ná sekundární protilátka zna?ená HRP, ?eděná 1:250 v?PBS. Inkubace probíhala ve vlhké kom?rce p?i laboratorní teplotě po dobu 45 min.? Preparáty byly propláchnuty 3x po 5 min. v?PBS.? Na preparáty byl aplikován ?erstvě p?ipraven? substrát DAB (na 1 ml substrátového pufru 20 ?l DAB chromogenu) po dobu 5 min. ? Preparáty byly opláchnuty po dobu 5 min. destilovanou vodou. ? Jádra buněk byla kontrastně dobarvena Mayerov?m hematoxylinem po dobu 3 min.? 10 min. byly preparáty ponechány v?kyvetě s?vodovodní vodou (modrání jader).? Preparáty byly odvodněny vzestupnou ?adou alkoholu (1x5 min. 70% alkohol, 1x5 min. 80% alkohol, 1x5 min. 96% alkohol), p?evedeny do xylenu (1x5 min. směs aceton-xylen 2:1) a projasněny (1x5 min. xylen).? Vzorky byly montovány kanadsk?m balzámem a uzavírány pod krycí sklí?ko.? Preparáty byly hodnoceny pod světeln?m mikroskopem. Hodnocení je semikvantitativní ve srovnání s?kontrolními vzorky. Je detekována lokalizace protein?.Míra fale?né pozitivity je minimalizována následujícími metodick?mi kroky:- Zpracováním negativních kontrol (odhalení nespecifick?ch vazeb sekundárních protilátek).- Blokací vazebného pozadí normálním koňsk?m sérem. Sérum vyvá?e volné Fc receptory imunoglobulin? p?ítomn?ch na membránách buněk, které by mohly nespecificky reagovat s?primární nebo sekundární protilátkou.- Z?d?vodu pou?ití sekundárních protilátek zna?en?ch k?enovou peroxidasou (HRP) je t?eba blokovat endogenní aktivitu tohoto enzymu. Peroxidem vodíku dojde k?vysycení enzymové aktivity.5.1.7 MTTChemikálie EDTA, trypsin (PAA, Rakousko), kultiva?ní média, prom?vací médium, testovaná látka (cytostatikum CisPlatina 0,5 mg. ml -1, Medac, Německo); ZnSO4, (BioReagent, Francie, vhodn? pro buně?né kultury); MTT reagencie (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromide), DMSO (dimetylsulfoxid), glycinov? pufr.Materiál a pou?ité p?ístrojeCentrifuga 5810R (Eppendorf, Německo), ?krabka na buňky, mikrotitra?ní desti?ka, pipety, ?pi?ky, vertikální spektrofotometr (Versa Max tunable microplate reader, Molecular Devices, USA), alobal. MetodikaBuňky byly inkubovány v?96 jamkov?ch desti?kách s?testovan?mi látkami (cytostatika) po dobu 24 h v?termostatu p?i 37 °C. Metoda je zalo?ena na redukci ?lutého MTT reagentu mitochondriálními enzymy ?iv?ch buněk na nerozpustn? formazan. Ten je následně rozpu?těn p?idáním silného detergentu. Zbarvení je hodnoceno spektrofotometricky p?i vlnové délce 540 nm. Hodnota absorbance roztoku odpovídá mno?ství ?iv?ch buněk. Na základě v?sledn?ch hodnot absorbance je p?epo?ítána hodnota IC50 pro testovanou látku k?dané buně?né linii. Hodnota IC50 je polovina maximální inhibi?ní koncentrace, tj. taková koncentrace stanovované látky, která usmrtí 50 % buněk. Postup? Z?kultiva?ní nádoby bylo odsáto pou?ité médium a buňky byly propláchnuty EDTA.? Buňky byly propláchnuty trypsinem po dobu 30 s, trypsin byl odsát a kultiva?ní nádobka byla vlo?ena na 5 min. do termostatu.? Buňky byly spláchnuty p?íslu?n?m médiem a buně?ná suspenze byla p?enesena do?centrifuga?ní zkumavky.? Po centrifugaci p?i 2700 g po 7 min. p?i 4 °C byl odsát supernatant a buňky byly rozsuspendovány v?médiu.? Mno?ství buněk bylo po?ítáno (viz po?ítání buněk, kapitola 5.1.8)? Buňky byly na?eděny kultiva?ním médiem na mno?ství p?ibli?ně 10?000 buněk na?200??l.? Do jamek v?prvním a posledním sloupci bylo pipetováno ?isté médium, do jamek v?ostatních sloupcích bylo pipetováno po 200 ?l buně?né suspenze.? Buňky byly kultivovány v?termoboxu do nár?stu do optimální konfluence (asi 70 %).? Médium bylo odsáto a byla p?idána testovaná látka o vzr?stající koncentraci do jamek ve sloupcích 2–11. Do jamek prvního a posledního sloupce bylo p?idáno jen kultiva?ní médium.? Testovaná látka p?sobila na buňky 24 h v?termostatu.? Médium v?jamkách 1–11 sloupce bylo odsáto. Bylo p?idáno 200?l kultiva?ního média a 50?l MTT (5 mg·ml-1). Desti?ka byla zabalena do alobalu a byla na 4 h ulo?ena do?termostatu.? Obsah jamek 1–11 sloupce byl odsát a bylo p?idáno 200 ?l DMSO a 25 ?l glycinového pufru.? Po promíchání byla mě?ena absorbance p?i 570 nm na vertikálním spektrofotometru.? V?sledná hodnota absorbance byla p?epo?ítána na hodnotu IC50 pro testovanou látku.5.1.8 Po?ítání buněkChemikálie Casy tone, pipety, 10 ml zkumavky k?po?ítání buněk. Materiál a pou?ité p?ístrojeP?ístroj na po?ítání buněk CASY? Cell Counter (Roche, ?v?carsko), plastové zkumavky, pipety, ?pi?ky.Postup? Do 10 ml CASY TONE bylo napipetováno 100 ?l buně?né suspenze. Vzorek byl promíchán.? Analyzátor byl 3x pro?i?těn, byly nastaveny parametry pro po?adovanou buně?nou linii.? Byla mě?ena buně?ná viabilita a po?et buněk. Pokud je koncentrace buně?né suspenze p?íli? vysoká, p?ístroj není schopen detekovat po?et buněk. Je t?eba suspenzi buněk na?edit a mě?ení opakovat.5.1.9 Detekce zinku a voln?ch thiol?MateriálPodlo?ní skla, Petriho misky, Fluorescen?ní mikroskop (Axioskop 40, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany), PBS, 5-(bromomethyl)fluorescein (5-BMF, Sigma-Aldrich), DMSO, digitální fotoaparát (Olympus Camedia 750, Olympus, Tokyo, Japan), sonda N(6-metoxy-8-quinolyl)-p-toluen sulfonamid (TSQ, Invitrogen), pracovní TSQ roztok, PBS (pH 7,6).PostupZinek a volné thiolové skupiny byly barveny s?pou?itím speciálních detek?ních technik a obraz byl snímán pomocí fluorescen?ního mikroskopu. Buňky byly k?anal?ze zpracovány v?na?í laborato?i, následná detekce probíhala v?laborato?ích na VFU Brno.? Buně?ná suspenze byla p?i pasá?ování rozseta na sterilní podlo?ní sklo v?Petriho misce.? Buňky adherovaly na podlo?ní sklo p?ibli?ně 4 h v?termostatu, pak byla Petriho miska doplněna p?íslu?n?m kultiva?ním médiem.? Buňky byly kultivovány v?termostatu p?i 37 °C a p?i 5 % CO2 do po?adované konfluence.? Mikroskopická skla byla nejprve opláchnuta médiem bez Zn2+ a následně PBS. ? Volné -SH skupiny byly detekovány pomocí 5-(bromomethyl)fluoresceinu (5-BMF), ten byl bezprost?edně p?ed pou?itím p?ipraven ?erstv? ze zásobního roztoku (na?eděn PBS na koncentraci 20 μM). Preparáty byly inkubovány 1 h p?i 37 °C ve tmě.? Preparáty byly 3 x propláchnuty PBS, pozorovány ve fluorescen?ním mikroskopu a?fotografovány. ? Pro detekci volného zinku v?buňkách byla pou?ita sonda TSQ (N-(6-methoxy-8-quinolyl)-p-toluene sulfonamide). Detek?ní roztok TSQ byl p?ipraven bezprost?edně p?ed pou?itím na?eděním zásobního roztoku (PBS na cílovou koncentraci 10 μM). Preparáty byly inkubovány 30 min. p?i 37 °C ve tmě. ? Preparáty byly 3 x promyty v?PBS, pozorovány ve fluorescen?ním mikroskopu a?fotografovány. 5.1.10 Scratch assayMateriálVe?keré materiály pot?ebné ke kultivaci buně?n?ch kultur (viz kap. 5.1.1), mikroskop NIKON ECLIPSE TS100 (Nicon, Japonsko), fotoaparát Nikon (digital camera D80, Thailand), ?lutá ?pi?ka (200 ?l).MetodikaScratch assay je jednuduchá a dob?e proveditelná metoda pro mě?ení migrace buněk in?vitro. Buňky jsou kultivovány v?mal?ch Petriho miskách. Po nár?stu buněk do 100% konfluence je provedena r?ha (scratch) ?lutou ?pi?kou. Detekujeme zacelení r?hy v?pravideln?ch ?asov?ch intervalech. Fotografie jsou programově hodnoceny. Byla analyzována schopnost migrace nádorov?ch zinek rezistentních buněk (PC3, dlouhodobě kultivovaná v?koncentraci zinku 50 ?M) ve srovnání s?migra?ní schopností buněk linie wt PC3. Postup? Buňky byly p?i pasá?ování rozsety do mal?ch Petriho misek, byly kultivovány za?standardních podmínek (37°C, 5 % CO2).? Po nár?stu buněk do monovrstvy (100% konfluence) byla provedena r?ha ?lutou (200?l) ?pi?kou. Pro zaji?tění stejného místa fotografování byla vytvo?ena referen?ní r?ha. ? Bylo vyměněno médium a p?idán zinek dle koncentrace.? Buňky jsme fotografovali v?p?edem stanoven?ch ?asov?ch intervalech v?mikroskopu s?fázov?m kontrastem. ?as, kdy byla provedena r?ha a zdokumentována první fotografie ozna?íme jako ?as nula. Dal?í snímky byly provcedeny v? intervalech 2, 4, 6, 8 a?24?h. ? Fotografie byly hodnoceny s?vyu?itím programu TScratch (CSElab) (Geback et al., 2009).? Fotografie byly hodnoceny na základě procentuálního pokryvu buňkami. Namě?ené hodnoty odpovídají procentuálnímu zastoupení volné plochy na snímku. ? Vypo?ítali jsme podíl těchto hodnot za 24 hod ve srovnání s??asem nula.? S?vyu?itím T-testu byla vyhodnocena statistická v?znamnost. Hladina v?znamnosti, na?které byla statistická anal?za provedena je p=0,05. 6 V?SLEDKY6.1 Zinek rezistentní linieDle popsané metodiky (viz 5.1.2) byla vytvo?ena nádorová prostatická linie odvozená z?linie wt PC3, trvale ?ivotaschopná ve vysok?ch koncentracích zinku (dále v textu ozna?ovaná jako zinek rezistentní). V p?edchozích experimentech byla stanovena hodnota IC50 pro zinek u nádorové prostatické buně?né linie PC3 na 55,5 ?M (Sztalmachova et al., 2012; Masarik et al., 2012a). Pozitivní selekcí buněk rezistentních k zinku byly vytvo?eny zinek rezistentní buně?né linie rostoucí v?koncentracích zinku několikrát p?evy?ující jejich p?vodní wt IC50. Pro dlouhodobou kultivaci byly vyu?ity následující koncentrace zinku: 50 ?M, 100 ?M a?150 ?M, co? odpovídá 1-, 2-, 3- násobku hodnoty IC50. Rezistentní buňky byly schopné dělení a?r?stu v?koncentracích zinku vy??ích ne? trojnásobek standardní hodnoty IC50. Doba pot?ebná k?vytvo?ení buně?n?ch linií rezistentních na zinek (trojnásobek IC50) byla minimálně t?i měsíce. 6.2 Anal?za exprese vybran?ch gen?K?anal?ze expresního profilu vybran?ch gen? korespondujících s?metabolismem a?transportem zine?nat?ch iont? byly vyu?ity zinek rezistentní buně?né linie PC3 (dlouhodobě kultivované v?médiu s?koncentrací zinku odpovídajících 1-, 2-, 3- násobek hodnoty IC50 pro zinek) a buně?ná linie PC3 (wt) vystavená krátkodobému p?sobení zinku (24 h) v?koncentracích 50 ?M, 100 ?M a?150 ?M.Exprese v?ech studovan?ch gen? byla porovnána s?nulovou koncentrací Zn2+ v?kultiva?ním médiu u buně?né linie wt PC3. Jako referen?ní gen byl pou?it β-aktin (ACTB). K?anal?ze byly vybrány následující geny: Zip1, ZnT-1 (zinkové transportéry); MT1A, MT2A (kov vázající proteiny, metalothioneiny); MMP-2 a MMP-9 (zinek vázající proteiny); TIMP-1 a?TIMP-2 (tkáňové inhibitory MMP). Grafy ní?e zobrazují míru exprese pro jednotlivé geny a vizualizují rozdíly mezi krátkodob?m (24 h) a dlouhodob?m (zinek rezistentní buně?ná linie) p?sobením zine?nat?ch iont?. Koncentrace Zn2+ odpovídá násobk?m hodnoty IC50 pro linii wt PC3 (0 ?M, 50 ?M, 100??M a?150 ?M Zn2+) (viz grafy 1–7). Graf 1: Exprese genu MT1A. Graf zobrazuje vliv zine?nat?ch iont? na expresi genu MT1A. Srovnání krátkodobého p?sobení Zn2+ (24 h) a zinek rezistentní buně?né linie (rezist.). Graf 2: Exprese genu MT2A. Graf zobrazuje vliv zine?nat?ch iont? na expresi genu MT2A. Srovnání krátkodobého p?sobení Zn2+ (24 h) a zinek rezistentní buně?né linie (rezist.). Graf 3: Exprese genu Zip1A. Graf zobrazuje vliv zine?nat?ch iont? na expresi genu Zip1A. Srovnání krátkodobého p?sobení Zn2+ (24 h) a zinek rezistentní buně?né linie (rezist.). Graf 4: Exprese genu ZnT-1. Graf zobrazuje vliv zine?nat?ch iont? na expresi genu ZnT-1. Srovnání krátkodobého p?sobení Zn2+ (24 h) a zinek rezistentní buně?né linie (rezist.). Graf 5: Exprese genu MMP-9. Graf zobrazuje vliv zine?nat?ch iont? na expresi genu MMP-9. Srovnání krátkodobého p?sobení Zn2+ (24 h) a zinek rezistentní buně?né linie (rezist.).Graf 6: Exprese genu TIMP-1. Graf zobrazuje vliv zine?nat?ch iont? na expresi genu TIMP-1. Srovnání krátkodobého p?sobení Zn2+ (24 h) a zinek rezistentní buně?né linie (rezist.).Graf 7: Exprese genu TIMP-2. Graf zobrazuje vliv zine?nat?ch iont? na expresi genu TIMP-2. Srovnání krátkodobého p?sobení Zn2+ (24 h) a zinek rezistentní buně?né linie (rezist.).Exprese gen? MT1A, MT2A a ZnT-1 v?razně koreluje s?p?idan?m zinkem u obou typ? linií. Míra exprese těchto gen? byla zv??ena u zinek rezistentní buně?né linie, zejména u koncentrací zinku odpovídající trojnásobku hodnoty IC50 . Exprese genu MT1A (viz graf 1) byla zv??ena a? desetinásobně u zinek rezistentní linie (ve srovnání s?linií wt), exprese genu MT2A (viz graf 2) byla zv??ena a? trojnásobně a?exprese genu ZnT-1 (viz graf 4) byla zv??ena sedminásobně u zinek rezistentní linie ve srovnání s?linií wt. Hladina v?znamnosti, na které byla provedena statistická anal?za, odpovídá p=0,05. S?vyu?itím Pearsonovy anal?zy byla prokázána signifikantní pozitivní korelace mezi koncentrací zine?nat?ch iont? v?médiu a expresí gen? MT1A (r=0,9126, p=0,004), MT2A (r=0,9337, p=0,002) a ZnT-1 (r=0,8918, p=0,007). U ostatních gen? nebyla potvrzena signifikantní korelace (p>0,05). U genu MMP-2 nebyl ve?vět?ině vzork? detekován p?i qRT-PCR ?ádn? signál, proto v?sledky nebyly dále zpracovávány. Dále byla detekována koexprese vybran?ch gen?. Tyto údaje shrnuje následující tabulka (viz tab. 9). Lze pozorovat, ?e statisticky v?znamnou koexpresi vykazují následující dvojice gen?: MT1A a MT2A, ZnT-1 a MT2A, ZnT-1 a MT1A, TIMP-1 a?Zip1, TIMP-2 a Zip1.Tabulka 9: Hodnocení koexprese detekovan?ch gen?. ?erveně zv?razněné jsou hodnoty statisticky v?znamné, r=korela?ní koeficient, p= hladina v?znamnosti. MT2AMT1AZIP1ZnT-1MMP-9TIMP-1TIMP-2MT2Ar=1,0000r=0,8455r=0,4114r=0,9725r=0,4073r=0,3175r=-0,0063p= ---p=0,008p=0,311p=0,000p=0,317p=0,444p=0,988MT1Ar=0,8455r=1,0000r=0,3912r=0,7515r=0,2346r=0,2741r=-0,0660p=0,008p= ---p=0,338p=0,032p=0,576p=0,511p=0,877ZIP1r=0,4114r=0,3912r=1,0000r=0,4587r=0,3077r=0,9070r=0,7284p=0,311p=0,338p= ---p=0,253p=0,458p=0,002p=0,040ZnT-1r=0,9725r=0,7515r=0,4587r=1,0000r=0,4886r=0,4185r=0,1224p=0,000p=0,032p=0,253p= ---p=0,219p=0,302p=0,773MMP-9r=0,4073r=0,2346r=0,3077r=0,4886r=1,0000r=0,5222r=0,4846p=0,317p=0,576p=0,458p=0,219p= ---p=0,184p=0,224TIMP-1r=0,3175r=0,2741r=0,9070r=0,4185r=0,5222r=1,0000r=0,9239p=0,444p=0,511p=0,002p=0,302p=0,184p= ---p=0,001TIMP-2r=-0,0063r=-0,0660r=0,7284r=0,1224r=0,4846r=0,9239r=1,0000p=0,988p=0,877p=0,040p=0,773p=0,224p=0,001p= ---Dále bylo detekováno, zda má koncentrace Zn2+ ?i získaná rezistence vliv na?expresní profil. S?vyu?itím ANOVA testu (faktorová anal?za rozptylu) bylo ur?eno, ?e vliv na expresní profil detekovan?ch gen? má koncentrace zine?nat?ch iont? v?kultiva?ním médiu (p=0,024), nikoli v?ak získaná rezistence buněk k?zinku (p=0,609). Pomocí Fischerova post-hoc testu byl prokázán signifikantní vliv rozdíln?ch koncentrací zine?nat?ch iont? na expresi gen? ZnT-1, MT1A a?MT2A u obou typ? (wt i?rezistentních) sledovan?ch linií. 6.3 Anal?za viability buněk (MTT)K?detekci ?ivotnosti buněk byl vyu?it MTT test. P?edchozími studiemi byla stanovena hodnota IC50 pro wt PC3 buně?nou linii k?zinku (Sztalmachova et al., 2012). Byla detekována viabilita zinek rezistentní buně?né linie (koncentrace zinku 1x hodnota IC50) po 24 h p?sobení Zn2+ ve vzr?stajících koncentracích (?kála 0–2000 ?M Zn2+). Hodnota IC50 (viz 5.1.7) pro zinek rezistentní linii byla 1,4 násobně vy??í, ve srovnáním s?wt PC3 buně?nou linií (viz tab. 10). Dále byla stanovena hodnota IC50 k cytostatiku cisplatině (?kála 0–250 ?M cisPt) a?to pro buně?nou linii zinek rezistentní ve srovnání s?linií wt PC3. U rezistentních buněk byla hodnota IC50 pro cisPt zv??ena 1,6 krát. V?sledky anal?zy MTT shrnuje tabulka 10. Dlouhodobá kultivace se zinkem tedy zvy?uje rezistenci buněk nejen k?zinku, ale také k?cisplatině. 6.4 Imunocytochemická anal?zaK?potvrzení expresní anal?zy byla vyu?ita metoda imunocytochemie na buně?n?ch kulturách. K?detekci byly vybrány následující proteiny, které bezprost?edně ovlivňují metabolismus zinku: Zip1, ZnT-1 (zinkové transportéry), MT (metalothionein), MTF-1 (kov regula?ní transkrip?ní faktor). Soubě?ně byly zpracovány negativní kontroly (viz 5.1.6) k?odhalení nespecifick?ch vazeb sekundární protilátky (obr. 6). Kontroly byly zpracovány ke ka?dé ze?sekundárních protilátek. Tyto preparáty vykazovaly negativní reakci (nep?ítomnost hnědého zbarvení). M??eme tedy vylou?it p?ípadnou fale?nou pozitivitu zp?sobenou nespecifick?mi vazbami sekundárních protilátek. K?vylou?ení jin?ch mo?ností fale?ně pozitivních v?sledk? je sou?ástí metodického postupu blokace endogenní peroxidasy a?blokace vazebného pozadí normálním koňsk?m sérem (NHS), (viz kap. 5.1.6).Tabulka 10: Anal?za hodnot IC50 pro zinek a cisplatinu: srovnání zinek rezistentní buně?né linie a wt linie PC3.Zn2+ ?Mcisplatina ?Mwild type PC355, 574,9zinek rezistentní PC383±4,7116,7±702466975390525II.I.Obrázek 6: Imunocytochemická detekce vzork? negativních kontrol. (I.) buně?ná linie wt PC3 (II.) zinek rezistentní linie PC3. Kontroly nevykazují jakoukoli pozitivitu. Velikost úse?ky 50?m. Detekce vybran?ch protein? (viz v??e) byla provedena na zinek rezistentní linii PC3 (kultivované v?koncentraci zinku odpovídající 1 x IC50, tj. 50?M Zn2+). V?sledky této detekce byly srovnávány s preparáty linie wt PC3 (bez p?idaného zinku). Fotografie v?levém sloupci zachycují detekci vybran?ch protein? v?linii wt PC3, fotografie vpravo pak linii zinek rezistentní (viz obr. 7). První dvojice fotografií dokumentuje protein Zip1. Ten je lokalizován nejen na membráně ale i intracelulárně (viz kap. 7). Lze pozorovat mírné zv??ení míry pozitivity zbarvení u preparátu se zinek rezistentními buňkami ve srovnání s?buňkami linie wt. Dal?í dvojice preparát? detekuje protein ZnT-1. Míra pozitivity je v?preparátu zinek rezistentní linie mírně vy??í ne? u linie wt PC3. Fotografie E a F zobrazují metal regula?ní faktor (MTF). Intenzita zbarvení je v?preparátu s?buňkami zinek rezistentní linie v?razně zv??ená ve srovnání s?linií wt. Poslední dvojice fotografií (G a H) dokumentují protein metalothionein. Lze pozorovat v?razné zv??ení míry pozitivity reakce v?preparátech zinek rezistentních buněk ve?srovnání s?wt buňkami. To je v?souladu anal?zou exprese genu pro MT a také s?faktem, ?e zv??ená koncentrace zinku v?razně indukuje expresi MT.EABHGFDCObrázek 7: Imunocytochemická detekce vybran?ch protein?. P?ítomnost hnědého zbarvení zna?í pozitivitu, jádra jsou dobarveny hematoxylinem mod?e. Srovnání linie wt PC3 (lev? sloupec) a?linie zinek rezistentní PC3 (sloupec vpravo). (A) Detekce Zip, linie wt (B) detekce Zip, linie zinek rezistentní (C) detekce ZnT-1, linie wt (D) detekce ZnT-1, linie zinek rezistentní (E) detekce MTF, linie wt (F) detekce MTF, linie zinek rezistentní (G) detekce MT, linie wt (H) detekce MT, linie zinek rezistentní. Velikost úse?ky 50?m.6.5 Fluorescen?ní zna?eníPro potvrzení, ?e zinek rezistentní buně?né linie jsou ovlivněny vysokou koncentrací zinku, bylo provedeno fluorescen?ní zna?ení.Detekce voln?ch thiolov?ch skupin a volného zinku (Zn2+) byla provedena na zinek rezistentní linii PC3 (kultivované v?koncentraci zinku odpovídající 1 x IC50, tj. 50?M Zn2+). V?sledky této detekce byly srovnávány s preparáty linie wt PC3 (bez p?idaného zinku).6.5.1 Detekce voln?ch thiol?Za intracelulární vazbu iont? kov? jsou zodpovědné slou?eniny bohaté na volné -SH skupiny. Thioly byly detekovány fluorescen?ně vazbou sondy 5-BMF (viz kap. 5.1.9). Semikvantitativně byla hodnocena míra pozitivity fluorescence a buně?ná lokalizace. Bylo detekováno v?razné zv??ení fluorescence u buně?né linie zinek rezistentní ve?srovnání s?linií wt (viz obrázek 8, snímek A a B). Pozitivita je pozorovatelná zejména v?jadérku a?také kolem jádra a v?cytoplasmě. 6.5.2 Detekce zinkuIntracelulární voln? zinek (Zn2+) je detekován specifickou sondou (TSQ, viz 5.1.9). U?buněk PC3 je rozdíl mezi wt a zinek rezistentní linií méně viditeln? (viz obrázek 8), i?kdy? je z?ostatních experiment? z?ejmé, ?e tato buně?ná linie byla schopna akumulovat zinek. Pozitivita je detekována na?obou snímcích (C i D). Zinek je lokalizován difúzně, jak v?jád?e, tak i?v?cytoplasmě. DCBAObrázek 8: Detekce voln?ch thiol? (A+B) a intracelulárního zinku (C+D). P?ítomnost fluorescence zna?í pozitivitu. Srovnání linie wt PC3 (snímky vlevo) a linie zinek rezistentní (vpravo) PC3. (A) detekce voln?ch thiolov?ch skupin, wt (B) detekce voln?ch thiolov?ch skupin, linie zinek rezistentní (C) detekce volného zinku (Zn2+), linie wt (D) detekce volného zinku (Zn2+), linie zinek rezistentní. Zobrazená úse?ka odpovídá 50?m.6.6 Scratch assaySchopnost migrace nádorov?ch buněk byla detekována in vitro s?vyu?itím metody scratch assay. K?hodnocení byl pou?it program TScratch (CSElab) (Geback et al., 2009). Namě?ené hodnoty odpovídají procentuálnímu zastoupení volné plochy na snímku. Dle v?po?tu (viz kap. 5.1.10) získáme hodnoty po 24 hodinách (v porovnání s??asem nula) (viz tab. 11). T-testem byla vyhodnocena statistická v?znamnost. Hladina v?znamnosti, na ni? byla statistická anal?za provedena, odpovídá p=0,05. Tabulka 11: Hodnocení migra?ní schopnosti nádorov?ch buněk za 24 hodin. Srovnání buně?né linie wt PC3 s?linií zinek rezistentní. Hodnocena jsou data získaná z?fotografií na za?átku experimentu (?as nula) a po 24 hodinách. poměr 24:0směrodatná odchylkawild type PC30,3977890870,335zinek rezistentní PC30,7986743830,056V?sledná data byla graficky zpracována, pro p?ehlednost byla p?epo?ítána na?kontrolní buně?nou linii (wt PC3). Anal?za má za cíl detekovat rozdílnost v?migra?ní schopnosti buněk zinek rezistentní linie. Graf zobrazuje schopnost migrace nádorov?ch buněk za 24 h (viz graf 8). K?porovnání byla detekována migrace buněk linie wt PC3 a?linie zinek rezistentní PC3. Statisticky se jedná o hrani?ně v?znamn? jev. Z?v?sledk? je z?ejmé, ?e zinek rezistentní buňky migrovaly pomaleji ne? buňky linie wt.rezist.wtGraf 8: Migra?ní schopnosti nádorov?ch buněk. Srovnání zinek rezistentní buně?né linie (rezist.) a wt linie PC3. Hladina v?znamnosti odpovídá p=0,0542.Fotografie pro ukázku dokumentují migra?ní schopnost nádorov?ch buněk linie wt PC3 a?zinek rezistentní buně?né linie p?i za?átku experimentu a po 24 hodinách (viz obrázek 9). Migrace buněk byla dokumentována v??asov?ch intervalech 0, 2, 4, 6, 8 a?24 hodin. Demonstrativně jsou zobrazeny vybrané fotografie, které zastupující komplexní hodnocení (t?i soubě?ně zpracované anal?zy). Fotografie vlevo zobrazují stav na za?átku experimentu (?as nula) těsně po vytvo?ení r?hy. Fotografie umístěné vpravo ukazují stav po 24 hodinách inkubace. V závislosti na migra?ních schopnostech mají buňky tendenci vytvo?enou r?hu zacelit. Horní dvě fotografie zachycují buně?nou linii wt PC3, spodní dvě pak linii zinek rezistentní. -304802149475274828021494752748280203835CADB-15875204470?as 0 h?as 24 hObrázek 9: Migra?ní schopnost nádorov?ch buněk linie PC3 po vytvo?ení r?hy. Fotografie vlevo (A+C) dokumentují stav na za?átku experimentu (?as nula), vpravo (B+D) jsou fotografie ze stejné oblasti po 24 hodinách. (A+B) srovnání migra?ní schopnosti buněk nádorové linie wt PC3 a?(C+D) zinek rezistentní buně?né linie PC3. Zvět?ení 100x.7 DISKUSE Vliv zine?nat?ch iont? na buně?né linie odvozené od karcinomu prostaty byly do?nyněj?ka studovány p?i krátkodobém p?sobení (Liang et al., 1999; Hasumi et al., 2003; Banudevi et al., 2010). K?detekci dlouhodobého p?sobení zinku na prostatickou buně?nou linii byla vytvo?ena (pozitivní selekcí buněk rezistentních k?zinku) zinek rezistentní buně?né linie. Rezistentní buňky jsou viabilní a mají schopnost se dělit v?koncentracích zinku, které p?esahují trojnásobek standardní hodnoty IC50. V?této práci jsem se zamě?ila na anal?zu zinek rezistentní buně?ná linie odvozené a?vyselektované z?wt PC3 prostatické buně?né linie (androgen necitlivá buně?ná linie metastatického karcinomu prostaty).7.1 Expresní profil Byl stanoven expresní profil gen? souvisejících s?metabolismem a transportem zine?nat?ch iont?. D?le?it?mi transportéry pro import zinku jsou transmembránové p?ena?e?e rodiny Zip (Eide, 2004; Kambe et al., 2004). Transportéry rodiny Zip jsou d?le?ité pro akumulaci zinku v?prostatick?ch buňkách (Gaither a Eide, 2001; Kambe et?al., 2004). U maligních buněk karcinomu prostaty je expresní hladina tohoto transportéru sní?ená, co? je pravděpodobně p?í?inou neschopnosti nádorov?ch prostatick?ch buněk akumulovat zinek (Desouki et al., 2007). Z?tohoto d?vodu jsou transportéry Zip i ostatní transportéry související s?maligní transformací ?iroce studovány a diskutovány. Zjistili jsme, ?e úroveň exprese transportéru Zip1 nekorelovala se vzr?stající koncentrací zine?nat?ch iont?. Statisticky v?znamn? rozdíl v?expresi Zip1 nebyl pozorován ani p?i srovnání dlouhodobého a krátkodobého p?sobení zine?nat?ch iont? na prostatickou buně?nou linii. Je pravděpodobné, ?e regulace exprese Zip je nezávislá na zinku. U my?ího modelu TRAMP (transgenní adenokarcinom prostaty) byly detekovány v?znamné podobnosti s?lidsk?m karcinomem prostaty. Jednalo se o srovnání exprese Zip1, hladiny zinku a?koncentrace citrátu. Studie Costella a koleg? poukazuje na nep?ítomnost transportéru Zip1 u modelu TRAMP. Podobně tak byla sní?ena koncentrace cirátu a zine?nat?ch iont? (Costello et al., 2011b). My jsme v?ak expresi Zip1 u PC3 buněk odvozen?ch od karcinomu prostaty detekovali. ?ada studií navrhuje ozna?it zinek jako tumorov? supresor a Zip1, Zip2 i?Zip3 jako tumor supresorové geny karcinomu prostaty (Franklin et al., 2005a; Franklin a Costello, 2007; Desouki et al., 2007).V?znam transportér? rodiny Zip je studován ve?spojení s?celou ?adou patologií, v?etně malignit. Intracelulární koncentraci zine?nat?ch iont? sni?ují transportéry rodiny ZnT, které jsou zodpovědné jednak za import zinku do buně?n?ch organel a také za export Zn2+ z?buňky. Jedin? transportér lokalizovan? na plasmatické membráně je transmembránov? p?ena?e? ZnT-1. Proteiny rodiny ZnT jsou transkrip?ně a?posttransla?ně regulovány zinkem. Exprese ZnT-1 i?ZnT-2 je indukována vysokou koncentrací zinku (Langmade et?al., 2000). To potvrzují i na?e v?sledky, které dokládají expresní hladinu ZnT-1 po krátkodobém i dlouhodobém p?sobení zine?nat?ch iont? několikanásobně vy??í, ne? bez ovlivnění zinkem. To odpovídá mo?né roli ZnT p?i detoxikaci zinku (Langmade et?al., 2000). Jiná studie ukazuje, ?e zv??ená exprese ZnT-1 a ZnT-2 uděluje buňkám BHK (baby hamster kidney) rezistenci k?zinku (Liuzzi a Cousins, 2004). Tyto v?sledky korespondují s?na?í studií, nebo?, jak je uvedeno, u zinek rezistentních buněk jsme pozorovali v?znamně zv??enou expresi ZnT-1 se zvy?ující se koncentrací zine?nat?ch iont? v kultiva?ním médiu.Hladina metalothioneinu je?v?buňce ovlivněna metal regula?ním transkrip?ním faktorem (MTF-1). Ten reaguje p?ímo na koncentraci zine?nat?ch iont? v?buňce a?indukuje expresi MT. P?edchozí studie dokazují několikanásobně zv??enou expresi MT po kultivaci buněk se zinkem (Masarik et al., 2011; Masarik et al., 2012b; Hlavna et?al., 2012). To je v?souladu s?na?imi v?sledky, které vykazují vzr?stající expresi MT se?zvy?ující se koncentrací zine?nat?ch iont? v médiu. Tento trend m??eme pozorovat u?obou typ? detekovan?ch metalothionein? (MT1A, MT2A). Oba vykazují statisticky v?znamnou korelaci se zvy?ující se koncentrací Zn2+ v?kultiva?ním médiu. Také byla detekována jejich koexprese s?ZnT-1. To m??e poukazovat na propojenou roli těchto protein? p?i detoxikaci zinku a také na to, ?e exprese ZnT-1 je ?ízena, shodně jako exprese metalothionein?, transkrip?ním faktorem MTF. V?sledky expresní anal?zy jsou v?souladu s imunocytochemickou detekcí MT a také s fluorescen?ní detekcí voln?ch thiolov?ch skupin. Matrixové metaloproteinasy jsou studované jako mo?né markery r?zn?ch patologick?ch stav? v?etně nádorov?ch onemocnění (Zitka et al., 2010). P?vodně byly MMP pova?ovány za zodpovědné jen p?i nádorové invazi a metastasování. Jiné studie v?ak poukazují na zapojení MMP v?několika krocích v?voje rakoviny (Egeblad a Werb, 2002; Uzzo et al., 2006). D?le?ité je, ?e matrixové metaloproteinasy mají p?i nádorové progresi funkci jak podporující, tak supresivní (Egeblad a Werb, 2002; Trudel et al., 2008). V?znam matrixov?ch metaloproteinas byl potvrzen také?souvislosti s?regulací apoptosy, s?angiogenezí, s tvorbou metastas a v?souvislosti s?imunitním dohledem (Egeblad a Werb, 2002; Zitka et al., 2010; van Zijl et al., 2011). Expresní anal?zu MMP-2 nebylo mo?no komplexně zhodnotit, nebo? ani po 40 cyklech PCR nebyl povět?inou detekován produkt reakce. Domníváme se v?ak, ?e se nejednalo o selhání sondy nebo o fale?ně negativní v?sledek reakce, ale ?e expresní hladina MMP-2 je velmi nízká (viz dále). V?sledky exprese MMP-9 nevykazují ?ádnou statisticky v?znamnou korelaci s?koncentrací zine?nat?ch iont?. U karcinom? nejsou v?lu?n?m producentem MMP jen nádorové buňky. Kup?íkladu právě MMP-2 a MMP-9 jsou tvo?eny p?evá?ně stromálními buňkami v nádorovém lo?isku. Nádorové buňky mohou in vivo stimulovat buňky nádorového stromatu parakrinně (prost?ednictvím interleukin?, interferon? a r?stov?ch faktor?) k?syntéze MMP. Toho ale nem??e b?t v?monokultu?e nádorov?ch buněk dosa?eno. Z?nev?razné exprese vybran?ch MMP m??eme tedy usuzovat, ?e samotné nádorové buňky matrixové metaloproteinasy (konkrétně MMP-2 a?MMP-9) produkují minimálně, co? potvrdily i studie Egeblada a Zitky (Egeblad a?Werb, 2002; Zitka et al., 2010). Zv??ená tvorba TIMP inhibuje r?st r?zn?ch typ? nádorov?ch buněk. Naopak sní?ená koncentrace TIMP v?pr?běhu remodelace po?kozené tkáně zvy?uje kolagenasovou aktivitu a umo?ňuje nádorov?m buňkám naru?it extracelulární okolí a migrovat tak do okolních tkání (Ponton et al., 1991; Zitka et al., 2010). TIMP-1 inhibuje (a? na MMP-14) v?echny typy matrixov?ch metaloproteinas, TIMP-2 inhibuje v?echny typy MMP. Expresní anal?za neodhalila ?ádnou korelaci mezi koncentrací zinku a expresí TIMP. Oba typy studovan?ch TIMP v?ak vykazují pozitivní koexpresi s?zinkovém transportérem Zip1. 7.2 Buně?ná viabilitaTestem MTT byla detekována buně?ná viabilita po 24 h p?sobení Zn2+ a?protinádorového lé?iva cisplatiny. Hodnota IC50 pro zinek byla 1,4 násobně vy??í, ve?srovnáním s?wt PC3 buně?nou linií. Pro cisplatinu byla hodnota IC50 zv??ena 1,6?krát ve srovnání s?wt PC3. Tyto v?sledky potvrzují, ?e zinek rezistentní linie byla podstatně méně citlivá na lé?bu cisplatinou. To je v?souladu se studií, která udává, ?e zv??ené mno?ství zinku zvy?uje odolnost v??i vlivu jin?ch toxin? (Truong-Tran et al., 2000). Tyto v?sledky jsou naopak v?rozporu s hypotézami, které se domnívají, ?e navrácení zv??eného mno?ství zine?nat?ch iont? do nádorov?ch buněk bude mít pozitivní vliv na lé?bu (Costello et al., 2004). V?sledky také nejsou v souladu s?hypotézou, ?e obnovení vysok?ch hladin zinku v?buňkách karcinomu povede k?obnovení metabolismu typického pro zdravou prostatu, ?eho? by mohlo b?t vyu?ito k?zástavě progrese, nebo k?p?eru?ení pr?běhu karcinomu (Gumulec et al., 2011b).7.3 Imunocytochemická detekceVybrané proteiny byly v?buně?n?ch kulturách detekovány imunocytochemicky. Hodnoceny byly preparáty buně?n?ch linií zinek rezistentních ve srovnání s?linií wt PC3. Tato metoda hodnotí lokalizaci a semikvantitativně míru pozitivního zbarvení daného proteinu. Zip 1 byl lokalizován nejen na buně?né membráně, ale i intracelulárně. Co? je v?souladu se studií Milona et al., kte?í detekovali nativní hZip1 protein u PC3 buněk i?na intracelulárních vezikulech (Milon et al., 2001). V?prostatické tkáni je transportér Zip1 lokalizován na bazolaterální straně membrán buněk normálního ?lázového epitelu, co? odpovídá funkci těchto transportér? pro import zinku z?intersticiální tekutiny (pota?mo séra) (Desouki et al., 2007).Imunocytochemická detekce transpotréru ZnT vykazuje mírně vy??í pozitivitu zbarvení u?zinek rezistentní buně?né linie. To potvrzuje expresní anal?zu, která detekovala zv??ení tohoto transportéru u buně?né linie dlouhodobě ovlivněné zinkem.Metal regula?ní transkrip?ní faktor byl ve zv??ené mí?e detekován u?preparát? zinek rezistentních buněk, co? odpovídá jeho funkci v?homeostase zine?nat?ch iont? (Gumulec et al., 2011b; Gunther et al., 2012). Byl detekován jak v?jád?e, tak cytoplasmě. To je v?souladu s?faktem, ?e je MTF lokalizován v?cytoplasmě a a? po?aktivaci zinkem (?i jinak, kup?íkladu oxida?ním stresem) je transportován do jádra (Gunther et al., 2012). Imunocytochemická detekce metalothioneinu jasně potvrzuje expresní anal?zu. Bylo detekováno v?razné zv??ení míry pozitivity reakce v?preparátech zinek rezistentních buněk ve srovnání s?wt buňkami. To je v?souladu s?tvrzením, ?e zv??ená koncentrace zinku v?razně indukuje expresi MT (Vasak a Hasler, 2000).7.4 Detekce voln?ch thiol? a zinkuFluorescen?ní detekcí bylo potvrzeno, ?e zinek rezistentní buně?né linie jsou ovlivněny vysokou koncentrací zinku. Buně?né linie byly schopny akumulovat zine?naté ionty, co? je v?souladu se studií Costella a koleg? (Costello et al., 2004)Volné -SH skupiny protein? jsou zodpovědné za intracelulární vazbu iont? kov?. Na?snímcích lze pozorovat v?razné zv??ení voln?ch - SH skupin u buně?né linie rezistentní na zinek. To s?největ?í pravděpodobností odpovídá vazebn?m míst?m ve?struktu?e metalothioneinu. 7.5 Migrace buněk in vitroMigra?ní schopnost nádorov?ch buněk in vitro byla detekována scratch testem. Zinek rezistentní buňky migrovaly pomaleji, ne? buňky linie wt. Ishii s kolegy rovně? ukázali, ?e invazivita prostatick?ch nádorov?ch buněk (LNCaP) do matrigelu je silně potla?ena v?p?ítomnosti Zn2+ (Ishii et al., 2001; Ishii et al., 2004). V?sledek lze pova?ovat za?statisticky hrani?ně v?znamn?. PC3 buně?ná linie je odvozená od agresivního karcinomu prostaty (z metastas z?kostí), lze tedy p?edpokládat, ?e jejich migra?ní potenciál je vět?í ve srovnání s?buně?n?mi liniemi odvozen?mi od primárního karcinomu. Je v?ak pot?eba dal?ích studií, které ově?í migra?ní potenciál nádorov?ch prostatick?ch buněk odvozen?ch od primárního tumoru ve srovnání s?nenádorovou prostatickou buně?nou linií. 7.6. Srovnání anal?zy zinek rezistentní buně?né linie PC3 s?linií wt PC3Cílem práce bylo detekovat odli?nosti u wt linie PC3 krátkodobě o?et?ené zine?nat?mi ionty (24 h) ve srovnání s?linií zinek rezistentní (dlouhodobě kultivované s?Zn2+). Anal?za exprese vybran?ch gen? ukazuje, ?e získaná rezistence buněk k?zinku nemá statisticky signifikantní vliv na expresní profil studovan?ch gen? (p=0,609). S?vyu?itím ANOVA testu bylo v?ak ur?eno, ?e vliv na expresní profil detekovan?ch gen? má koncentrace zine?nat?ch iont? v?kultiva?ním médiu (p=0,024). Za krátkodobé p?izp?sobení se buněk vysok?m koncentracím zine?nat?ch iont? je pravděpodobně odpovědn? zinkov? transportér ZnT-1 a metalothioneiny. A?koli se nám nepoda?ilo potvrdit statisticky v?znamn? vliv sledovan?ch gen? na vznik dlouhodobé rezistence, z?v?sledk? test? cytotoxicity vypl?vá, ?e buňky zinek rezistentní jsou na lé?bu zinkem i?cisplatinou citlivé méně. Získaná rezistence je tedy spojena s?odolněj?ím fenotypem. Nicméně test migrace nádorov?ch buněk in vitro detekoval pomalej?í pohyblivost buněk rezistentních na zinek, z??eho? m??eme usuzovat, ?e PC3 buňky vystavené dlouhodobému p?sobení zine?an?ch iont? mají ni??í schopnost migrace do okolních tkání.8 Z?V?RV teoretické ?ásti této práce jsem se zamě?ila na sumarizaci poznatk? o patofyziologii p?edstojné ?lázy. Dále pojednávám o změnách, které souvisejí s?karcinomem prostaty v?kontextu zine?nat?ch iont?, jejich metabolismu a transportu. Prakticky jsem se zamě?ila na vytvo?ení zinek rezistentní nádorové buně?né linie PC3 (k detekci dlouhodobého p?sobení zine?nat?ch iont? na nádorovou buně?nou linii). Zinek rezistentní buně?né linie byly trvale ?itotaschopné v?koncentracích zinku a? trojnásobně vy??í ne? IC50 pro p?vodní wt linii (50?M Zn2+). Dále jsem se zab?vala anal?zami zinek rezistentních buně?n?ch linii PC3 ve srovnání s?linií wt PC3. Porovnala jsem expresní profil gen? ZnT-1 (transporér zodpověn? za export zine?nyt?ch iont?), Zip1 (zodovědn? za import Zn2+), MT (metalothionein), MMP-2 a?MMP-9 (matrixové metaloproteinasy) a jejich tkáňov?ch inhibitor? TIMP-1 a?TIMP-2 po krátkodobém (24 h) p?sobení Zn2+ (koncentrace 1, 2, a?3 násobek hodnoty IC50) ve srovnání se zinek rezistentními buně?n?mi liniemi.?Cílem bylo detekovat změny související se vznikem zinkové rezistence. V?sledky expresní anal?zy vykazují pozitivní statistickou korelaci metalothionein? (MT1A a MT2A) a zinkového transportéru ZnT-1 s?koncentrací zine?nat?ch iont?. Pokud v?ak posuzujeme efekt samotné rezistence, nebyly nalezeny ?ádné signifikantní rozdíly v expresi studovan?ch gen?.Dal?í v?sledky ukazují, ?e získaná zinková rezistence je spojena s?odolněj?ím fenotypem, kter? se vyzna?uje sní?enou citlivostí na cytostatikum cisplatinu a na Zn2+. Migra?ní schopnost buněk rezistentních na zinek byla v?ak detekována jako ni??í. Byla optimalizována metoda imunocytochemie a?u?vybran?ch protein? byla detekována jejich p?ítomnost a lokalizace. Fluorescen?ní mikroskopií bylo potvrzeno, ?e zinek rezistentní buňky jsou schopny zinek akumulovat. Tyto v?sledky poukazují na ?adu zajímav?ch odli?ností v?kontextu krátkodobého i?dlouhodobého p?sobení zine?nat?ch iont? na karcinom prostaty, kter?ch m??e b?t vyu?ito p?i dal?ím bádání, nebo p?i experimentech na zví?ecích modelech. I p?es některé studie, které dokumentují pozitivní vliv zine?nat?ch iont? p?i prevenci nebo lé?bě karcinomu prostaty, z?stává mo?nost vyu?ití dlouhodobé suplementace zinkem p?i nádorovém onemocnění prostaty prozatím problematická. Je tedy zapot?ebí dal?ího bádání, které objasní molekulární mechanismy p?i lé?bě zinkem.9 LITERATURA Anandapte B., Bao L., Smith R., Iwata K., Olsen B. R., Zetter B., Apte S. S. (1996): A review of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP-3) and experimental analysis of its effect on primary tumor growth. Biochemistry and Cell Biology-Biochimie Et Biologie Cellulaire, 74, 853-862.Apte S. S., Hayashi K., Seldin M. F., Mattei M. G., Hayashi M., Olsen B. R. (1994): Gene encoding a novel murine tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP), TIMP-3, is expressed in developing mouse epithelia, cartilage, and muscle, and is located on mouse chromosome-10. Developmental Dynamics, 200, 177-197.Axmanová M. (2012): Stanovení vybran?ch matrix metaloproteináz v prostatick?ch nádorov?ch liniích a v sérech pacient? s karcinomem prostaty, Bakalá?ská práce, LF MU, Brno.Banudevi S., Senthilkumar K., Sharmila G., Arunkumar R., Viiayababu M. R., Arunakaran J. (2010): Effect of zinc on regulation of insulin-like growth factor signaling in human androgen-independent prostate cancer cells. Clinica Chimica Acta, 411, 172-178.Cao J., Bobo J. A., Liuzzi J. P., Cousins R. J. (2001): Effects of intracellular zinc depletion on?metallothionein and ZIP2 transporter expression and apoptosis. Journal of Leukocyte Biology, 70, 559-566.Costello L. C., Feng P., Milon B., Tan M., Franklin R. B. (2004): Role of zinc in the?pathogenesis and treatment of prostate cancer: critical issues to resolve. Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 7, 111-117.Costello L. C., Fenselau C. C., Franklin R. B. (2011a): Evidence for operation of the direct zinc ligand exchange mechanism for trafficking, transport, and reactivity of zinc in mammalian cells. Journal of Inorganic Biochemistry, 105, 589-599.Costello L. C., Franklin R. B. (2011): Zinc is decreased in prostate cancer: an established relationship of prostate cancer! Journal of Biological Inorganic Chemistry, 16, 3-8.Costello L. C., Franklin R. B. (2012): Cytotoxic/tumor suppressor role of zinc for the treatment of cancer: an enigma and an opportunity. Expert Review of Anticancer Therapy, 12, 121-128.Costello L. C., Franklin R. B., Zou J., Feng P., Bok R., Swanson M. G., Kurhanewicz J. (2011b): Human prostate cancer ZIP1/zinc/citrate genetic/metabolic relationship in?the?TRAMP prostate cancer animal model. Cancer Biology & Therapy, 12, 1078-1084.?ihák R. (2002): Anatomie 2. Grada, Praha, 673 stran.?oupek P., ?ápek I., Kocák I. (2002): Karcinom prostaty. In: Speciální onkologie (Z. Adam, J. Vorlí?ek eds.), Masarykova univerzita, Léka?ská fakulta, Brno, 150-166.Desouki M. M., Geradts J., Milon B., Franklin R. B., Costello L. C. (2007): hZip2 and hZip3 zinc transporters are down regulated in human prostate adenocarcinomatous glands. Molecular Cancer, 6, 37-44.Devergnas S., Chimienti F., Naud N., Pennequin A., Coquerel Y., Chantegrel J., Favier A., Seve M. (2004): Differential regulation of zinc efflux transporters ZnT-1, ZnT-5 and ZnT-7 gene expression by zinc levels: a real-time RT-PCR study. Biochemical Pharmacology, 68, 699-709.Du?ek P. (2010): Farmakologická lé?ba karcinomu prostaty. Maxford, Praha, 156 stran.Dvo?ák K., Dvo?áková Z., Feit J., Luká? Z., ?mardová J. (2008): Základy histopatologick?ch vy?etrovacích metod. LF MU, Brno, 119 stran.Egeblad M., Werb Z. (2002): New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev Cancer, 2, 161-74.Eide D. J. (2004): The SLC39 family of metal ion transporters. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology, 447, 796-800.Franklin R. B., Costello L. C. (2007): Zinc as an anti-tumor agent in prostate cancer and in other cancers. Archives of Biochemistry and Biophysics, 463, 211-217.Franklin R. B., Feng P., Milon B., Desouki M. M., Singh K. K., Kajdacsy-Balla A., Bagasra O., Costello L. C. (2005a): hZIP1 zinc uptake transporter down regulation and zinc depletion in?prostate cancer. Molecular Cancer, 4, 432-445.Franklin R. B., Milon B., Feng P., Costello L. C. (2005b): Zinc and zinc transporters in normal prostate function and the pathogenesis of prostate cancer. Frontiers in Bioscience, 10, 2230-2239.Gaither L. A., Eide D. J. (2001): The human ZIP1 transporter mediates zinc uptake in human K562 erythroleukemia cells. Journal of Biological Chemistry, 276, 22258-22264.Gaither L. A., Eide D. J. (2000): Functional expression of the human hZIP2 zinc transporter. Journal of Biological Chemistry, 275, 5560-5564.Geback T., Schulz M. M. P., Koumoutsakos P., Detmar M. (2009): TScratch: a novel and simple software tool for automated analysis of monolayer wound healing assays. Biotechniques, 46, 265-278.Gumulec J., Masarik M., Krizkova S., Adam V., Hubalek J., Hrabeta J., Eckschlager T., Stiborova M., Kizek R. (2011a): Insight to Physiology and Pathology of Zinc(II) Ions and?Their Actions in Breast and Prostate Carcinoma. Current Medicinal Chemistry, 18, 5041-5051.Gumulec J., Masarik M., Krizkova S., Babula P., Hrabec R., Rovny A., Masarikova M., Kizek R. (2011b): Molecular mechanisms of zinc in prostate cancer. Klinicka onkologie : casopis Ceske a Slovenske onkologicke spolecnosti, 24, 249-55.Gunther V., Lindert U., Schaffner W. (2012): The taste of heavy metals: Gene regulation by?MTF-1. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research, 1823, 1416-1425.Hasumi M., Suzuki K., Matsui H., Koike H., Ito K., Yamanaka H. (2003): Regulation of?metallothionein and zinc transporter expression in human prostate cancer cells and tissues. Cancer Letters, 200, 187-195.Hlavna M., Raudenska M., Hudcova K., Gumulec J., Sztalmachova M., Tanhauserova V., Babula P., Adam V., Eckschlager T., Kizek R., Masarik M. (2012): MicroRNAs and zinc metabolism-related gene expression in prostate cancer cell lines treated with zinc(II) ions. Int J Oncol, 41, 2237-44.Hogstrand C., Kille P., Nicholson R. I., Taylor K. M. (2009): Zinc transporters and cancer: a?potential role for ZIP7 as a hub for tyrosine kinase activation. Trends in Molecular Medicine, 15, 101-111.Hork? D., ?ech S. (2003): Mikroskopická anatomie. Masarykova univerzita, Léka?ská fakulta, Brno, 139 stran.Ibs K. H., Rink L. (2003): Zinc-altered immune function. Journal of Nutrition, 133, 1452-1456.Iguchi K., Usui S., Inoue T., Sugimura Y., Tatematsu M., Hirano K. (2002): High-level expression of zinc transporter-2 in the rat lateral and dorsal prostate. Journal of Andrology, 23, 819-824.Ishii K., Otsuka T., Iguchi K., Usui S., Yamamoto H., Sugimura Y., Yoshikawa K., Hayward S. W., Hirano K. (2004): Evidence that the prostate-specific antigen (PSA)/Zn2+ axis may play a role in human prostate cancer cell invasion. Cancer Letters, 207, 79-87.Ishii K., Usui S., Sugimura Y., Yoshida S., Hioki T., Tatematsu M., Yamamoto H., Hirano K. (2001): Aminopeptidase N regulated by zinc in human prostate participates in tumor cell invasion. International Journal of Cancer, 92, 49-54.Johnson L. A., Kanak M. A., Kajdacsy-Balla A., Pestaner J. P., Bagasra O. (2010): Differential zinc accumulation and expression of human zinc transporter 1 (hZIP1) in prostate glands. Methods, 52, 316-321.Kambe T., Yamaguchi-Iwai Y., Sasaki R., Nagao M. (2004): Overview of mammalian zinc transporters. Cellular and Molecular Life Sciences, 61, 49-68.Knoepp Stewart M., Hookim Kim, Placido Jeremiah, Fields Kristina L., Roh Michael H. (2013): The application of immunocytochemistry to cytologic direct smears of metastatic merkel cell carcinoma. Diagnostic Cytopathology, 41, 729-733.Langmade S. J., Ravindra R., Daniels P. J., Andrews G. K. (2000): The transcription factor MTF-1 mediates metal regulation of the mouse ZnT1 gene. Journal of Biological Chemistry, 275, 34803-34809.Leitzmann M. F., Stampfer M. J., Wu K. N., Colditz G. A., Willett W. C., Giovannucci E. L. (2003): Zinc supplement use and risk of prostate cancer. Journal of the National Cancer Institute, 95, 1004-1007.Liang J. Y., Liu Y. Y., Zou J., Franklin R. B., Costello L. C., Feng P. (1999): Inhibitory effect of zinc on human prostatic carcinoma cell growth. Prostate, 40, 200-207.Liuzzi J. P., Cousins R. J. (2004): Mammalian zinc transporters. Annual Review of Nutrition, 24, 151-172.Ma?ák J., Ma?áková J. (2004): Patologie. Grada, Praha, 347 stran.Manning D. L., Mcclelland R. A., Knowlden J. M., Bryant S., Gee J. M. W., Green C. D., Robertson J. F., Blamey R. W., Sutherland R. L., Ormandy C. J., Nicholson R. I. (1995): Differential expression of estrogen-regulated genes in breast-cancer. Acta Oncologica, 34, 641-646.Manning D. L., Robertson J. F. R., Ellis I. O., Elston C. W., Mcclelland R. A., Gee J. M. W., Jones R. J., Green C. D., Cannon P., Blamey R. W., Nicholson R. I. (1994): Estrogen-regulated genes in breast-cancer - association of pliv1 with lymph-node involvement. European Journal of Cancer, 30A, 675-678.Mare? P. (2003): Karcinom prostaty. In: Klinická onkologie. (L. Petru?elka, B. Konopásek eds.), Karolinum, Praha, 164-169.Martínek J., Vacek Z. (2009): Histologick? atlas. Grada, Praha, 134 stran.Masarik M., Gumulec J., Hlavna M., Sztalmachova M., Babula P., Adam V., Krizkova S., Hrabec R., Rovny A., Kizek R. (2011): Analysis of tumor markers in prostate carcinoma at?RNA and protein level. International Journal of Molecular Medicine, 28, 45-45.Masarik M., Gumulec J., Hlavna M., Sztalmachova M., Babula P., Raudenska M., Pavkova-Goldbergova M., Cernei N., Sochor J., Zitka O., Ruttkay-Nedecky B., Krizkova S., Adam V., Kizek R. (2012a): Monitoring of the prostate tumour cells redox state and real-time proliferation by novel biophysical techniques and fluorescent staining. Integrative Biology, 4, 672-684.Masarik M., Gumulec J., Hlavna M., Sztalmachova M., Sochor J., Zitka O., Krizkova S., Cernei N., Ruttkay-Nedecky B., Babula P., Adam V., Kizek R. (2012b): Analysis of metallothionein and glutathione in prostate cells as markers of oxidative stress. International Journal of?Molecular Medicine, 30, 46-46.Milon B., Dhermy D., Pountney D., Bourgeois M., Beaumont C. (2001): Differential subcellular localization of hZip1 in adherent and non-adherent cells. Febs Letters, 507, 241-246.Milon B., Wu Q., Zou J., Costello L. C., Franklin R. B. (2006): Histidine residues in the region between transmembrane domains III and IV of hZip1 are required for zinc transport across the plasma membrane in PC-3 cells. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 1758, 1696-1701.Morgan K., Mccance K.L. (2010): Disordes of the Prostate Gland. In: Pathophysiology The Biologic Basis for Disease in Adults and Childern. (K.L. McCance, S.E. Huether eds.), Elsiever Mosby, Missoury, 813-823.Murakami M., Hirano T. (2008): Intracellular zinc homeostasis and zinc signaling. Cancer Science, 99, 1515-1522.Petrovick? P. (2002): Anatomie s topografií a klinik?mi aplikacemi. Osveta, Martin, 560 stran.Ponton A., Coulombe B., Skup D. (1991): Decreased expression of tissue inhibitor of?metalloproteinases in metastatic tumor-cells leading to increased levels of collagenase activity. Cancer Research, 51, 2138-2143.Rishi I., Baidouri H., Abbasi J. A., Bullard-Dillard R., Kajdacsy-Balla A., Pestaner J. P., Skacel M., Tubbs R., Bagasra O. (2003): Prostate cancer in African American men is associated with downregulation of zinc transporters. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology, 11, 253-260.Sobin L. H., Wittekind Ch. (1997): TNM classification of malignant tumours. 5rd ed., John Wiley & Sons, New York, 227 stran.Sztalmachova M. (2013): V?znam metalothioneinu v maligním potenciálu nádorov?ch buněk, Diplomová práce, Mendlova univerzita, Brno.Sztalmachova M., Hlavna M., Gumulec J., Holubova M., Babula P., Balvan J., Sochor J., Tanhauserova V., Raudenska M., Krizkova S., Adam V., Eckschlager T., Kizek R., Masarik M. (2012): Effect of zinc(II) ions on the expression of pro- and anti-apoptotic factors in?high-grade prostate carcinoma cells. Oncol Rep, 28, 806-14.Taylor K. M., Morgan H. E., Johnson A., Hadley L. J., Nicholson R. I. (2003): Structure-function analysis of LIV-1, the breast cancer-associated protein that belongs to a new subfamily of zinc transporters. Biochemical Journal, 375, 51-59.Taylor K. M., Morgan H. E., Smart K., Zahari N. M., Pumford S., Ellis I. O., Robertson J. F. R., Nicholson R. I. (2007): The emerging role of the LIV-1 subfamily of zinc transporters in?breast cancer. Molecular Medicine, 13, 396-406.Trudel D., Fradet Y., Meyer F., Harel F., Tetu B. (2008): Membrane-type-1 matrix metalloproteinase, matrix metalloproteinase 2, and tissue inhibitor of matrix proteinase 2 in?prostate cancer: identification of patients with poor prognosis by immunohistochemistry. Human Pathology, 39, 731-739.Truong-Tran A. Q., Ho L. H., Chai F., Zalewski P. D. (2000): Cellular zinc fluxes and the regulation of apoptosis/gene-directed cell death. Journal of Nutrition, 130, 1459S-1466S.Tummalapalli C. M., Heath B. J., Tyagi S. C. (2001): Tissue inhibitor of metalloproteinase-4 instigates apoptosis in transformed cardiac fibroblasts. Journal of Cellular Biochemistry, 80, 512-521.Uzzo R. G., Crispen P. L., Golovine K., Makhov P., Horwitz E. M., Kolenko V. M. (2006): Diverse effects of zinc on NF-kappa B and AP-1 transcription factors: implications for prostate cancer progression. Carcinogenesis, 27, 1980-1990.Vallee B. L., Falchuk K. H. (1993): The biochemical basis of zinc physiology. Physiological Reviews, 73, 79-118.Van Zijl F., Krupitza G., Mikulits W. (2011): Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res, 728, 23-34.Vasak M., Hasler D. W. (2000): Metallothioneins: new functional and structural insights. Current Opinion in Chemical Biology, 4, 177-183.Wang Y., Wimmer U., Lichtlen P., Inderbitzin D., Stieger B., Meier P. J., Hunziker L., Stallmach T., Forrer R., Rulicke T., Georgiev O., Schaffner W. (2004): Metal-responsive transcription factor-1 (MTF-1) is essential for embryonic liver development and heavy metal detoxification in the adult liver. Faseb Journal, 18, 1071-1079.Ye B., Maret W., Vallee B. L. (2001): Zinc metallothionein imported into liver mitochondria modulates respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98, 2317-2322.Zitka O., Kukacka J., Krizkova S., Huska D., Adam V., Masarik M., Prusa R., Kizek R. (2010): Matrix Metalloproteinases. Current Medicinal Chemistry, 17, 3751-3768.Internetové zdroje:Incidence a mortalita, karcinom prostaty: ? modul=incmor# (24.3.2014).Luke? M. (2005): Karcinom prostaty, Urologická klinika, 3. léka?ská fakulta Univerzity Karlovy v Praze a Fakultní nemocnice Královské Vinohrady, (13.1.2014).McNealovo schéma zonální anatomie prostaty: (10.3.2014).Novel prostate cancer tumour markers in a cell line model, mendelnet2011/articles/30_sztalmachova_437.pdf (24.3. 2014).Proteinová struktura metallothioneinu: of_zinc_homeostasis (12.3.2014).Souhrn údaj? o p?ípravku, Finasterid Orion 5 mg potahované tablety: (12.3. 2014).Vector Laboratories (2005): A Guide to Multiple Antigen Labeling: (12.3.2014).Vector Laboratories (2014): R.T.U. VECTASTAIN, Universal Elite, ABC Kit: (12.3.2014).10 SEZNAM POU?IT?CH ZKRATEKAFS: fibromuskulární stromaATB: antibiotikaBHP: benigní hyperplasie prostaty, nezhoubné zvět?ení prostatyCA1: cornu ammonis 1, malá oblast vlastního hyppocampuCaP: karcinom prostatyCDF: cation diffusion facilitatorCisPt: cisplatinaCT: computed tomography, po?íta?ová tomografieCZ: centrální zónaDAB: 3, 3?diaminobenzidinDK: dolní kon?etinaDMSO: dimethylsulfoxidDRE: digital rectal examination, palpa?ní vy?et?ení kone?níkemECM: extracelulární matrixEDTA: ethylendiamintetraoctová kyselinaEGF: epidermal growt factor, epidermální r?stov? faktorEJD: ductus ejaculatoriiER: endoplasmatické retikulumGA: Golgiho aparátGS: Gleasonovo skóre HGF: hepatocyte growt factor, jaterní r?stov? faktorHRP: horseradish peroxidase, k?enová peroxidasaICC: imunocytochemieIL: interleukinISF: interstitial fluid, intersticiální tekutinaKC: Krebs?v cyklusKm: Michaelisova konstantaMAPK: mitogen-aktivované proteinové kinasy MHC: major histokompatibility komplex, hlavní histokompatibilní komplexMMP: matrixové metaloproteinasyMRE: metal response elementMT: metalothioneinMTC: mitochondrieMTF: metal-responsive element-binding transcription factor, metal regula?ní transkrip?ní faktorMTT: 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidNHS: normal horse serum, normální koňské sérumNMR: nukleární magnetická rezonanceNVB: neurovaskulární svazekPIN: prostatická intraepiteliální neoplasie PSA: prostatick? specifick? antigenPSB: phosphate buffered saline, fosfátov? pufrPTP: protein tyrozin fosfatasy PZ: periferní zónaSLC: solute-linked carrierSNP: single nucleotide polymorfism, jednonukleotidov? polymorfismusS?KL: Státní ústav pro kontrolu lé?ivTIMP: tkáňové inhibitory matrixov?ch metaloproteinasTM: transmembránov?TNF: tumor nekrosis factor, faktor nekrotizující tumoryTNM klasifikace: (tumor nodus metastasis), staging nádorového onemocnění TRAMP: transgenic adenocarcinoma of the mouse prostateTRUS: transrektální ultrasonografieTSQ: N (6-metoxy-8-quinolyl)-p-toluen sulfonamidTZ: tranzicionální zónaU: uretrawt: wild type, divok? typZEN: zinc-enriched neurons, neurony bohaté na zinek11 P??LOHY11.1 Seznam p?ílohP?íloha 1: McNealovo schéma zonální anatomie prostatyP?íloha 2: Benigní hyperplasie prostatyP?íloha 3: Incidence a mortalita, karcinom prostaty, ?RP?íloha 4: TNM klasifikace nádorov?ch onemocněníP?íloha 5: Histopatologick? stupeň diferenciace karcinom?, Gleason scoreP?íloha 6: Struktura transmembránového p?ena?e?e ZipP?íloha 7: Klasifikace matrixov?ch metaloproteinasP?íloha 8: Aktivní ú?ast na odborn?ch akcích, publikaceP?íloha 1: McNealovo schéma zonální anatomie prostatyMcNealovo schéma zonální anatomie prostaty. (A) sagitální ?ez (B) transverzální ?ez. AFS-fibromuskulární stroma, CZ- centrální zóna, EJD- ductus ejaculatorii, NVB- neurovaskulární svazek, PZ- periferní zóna, TZ- tranzicionální zóna, U- uretra. Dle (, 10.3.2014).Velkou oblast prostatické ?lázy zaujímá periferní zóna (asi 70 %), centrální zóna zaujímá asi 25 % a zóna p?echodná asi 5 % (Costello a Franklin, 2011). Rozdělení prostatické ?lázy podle McNealova schématu je d?le?ité v?souvislosti patologiemi prostaty. BHP je ?asto lokalizována v?oblasti centrální zóny. Z tohoto d?vodu dochází ?asto ke stenose uterty a?z?toho plynoucí problémy s?mikcí. Karcinom prostaty b?vá p?evá?ně lokalizován v?periferní zóně. Proto se v?po?áte?ních fázích nevyskytují klinické problémy spojené s?mo?ením (Mare?, 2003; Du?ek, 2010). Periferní zóna je velmi zajímavá v?souvislosti s?molekulárním metabolismem, nebo? buňky v?této oblasti disponují schopností akumulovat zinek a?produkovat vysoké koncentrace citrátu (Costello et al., 2004).P?íloha 2: Benigní hyperplasie prostatyFotografie uvedené v?této ?ásti práce vznikly díky ochotě MUDr. Ji?ího Lenze z?patologicko-anatomického ústavu Fakultní?nemocnice u sv. Anny v?Brně. V?echny histologické preparáty byly standardně zpracovány a barveny p?ehlednou metodou hematoxylin-eozin. Zvět?ení 40x.Fotografie zachycuje benigní hyperplasii prostaty. ?lázky jsou vystlány dvou?ad?m epitelem s?vnit?ními cylindrick?mi a zevními oplo?těl?mi buňkami. Uvnit? ?lázek jsou p?ítomna hojná depozita kondenzovaného sekretu (tzv. Corpora amylacea). Snímek také zachycuje hyperplastickou fibromuskulární stromální komponentu. P?íloha 3: Incidence a mortalita, karcinom prostaty, ?R-140970737235Incidence a mortalita v??eské republice na karcinom prostaty, rok 2010. Dle ( svod.cz, 24.3.2014).P?íloha 4: TNM klasifikace nádorov?ch onemocněníPro klasifikaci nádor? se pou?ívá několik kritérií: anatomická lokalizace karcinomu, klinick? a?patologicko-anatomick? rozsah, symptomy, histologick? typ nádoru, stupeň diferenciace, pohlaví a věk pacienta, atd. (Sobin a Wittekind, 1997; Luke?, 2005). Pro za?azení karcinomu dle systému TNM je d?le?it? anatomick? rozsah nemoci. Systém hodnocení je zalo?en na hodnocení t?í slo?ek anatomického rozsahu: ? T (tumor): rozsah primárního nádoru (T1-T4).? N (nodus): nep?ítomnost ?i p?ítomnost a rozsah metastas v?regionálních lymfatick?ch uzlinách (N0-N3).? M (metastasis): p?ítomnost ?i nep?ítomnost vzdálen?ch metastas (M0-M1) (Sobin a?Wittekind, 1997).TNM klasifikaci karcinomu prostaty shrnuje tabulka v?této p?íloze.TNM klasifkace karcinomu prostaty. Dle (Luke?, 2005). T Primární tumorTXPrimární tumor nelze hodnotitT0?ádn? d?kaz primárního tumoruT1Klinicky něm?, nehmatn? nebo pomocí vy?et?ení nezobraziteln? tumorT1aHistologick? nález tumoru v < 5 % resekované tkáněT1bHistologick? nález tumoru v > 5 % resekované tkáněT1cTumor zji?těn? jehlovou biopsií (p?i zv??eném PSA)T2Tumor ohrani?en? na prostatuT2aTumor postihující polovinu jednoho laloku nebo méněT2bTumor postihující více ne? polovinu jednoho laloku, ale ne oba lalokyT2cTumor postihující oba lalokyT3Tumor p?esahující pouzdro prostatyT3aExtrakapsulární ?í?ení (jednostranné nebo oboustranné)T3bTumor pror?stá do jednoho nebo obou semenn?ch vá?k?T4Tumor je fixovan? nebo pror?stá do okolních struktur (kromě semenn?ch vá?k?): do?hrdla mo?ového měch??e, zevního svěra?e, zdviha?? dna pánevního, rekta, pánevní stěny.N Regionální lymfatické uzlinyNXRegionální lymfatické uzliny nelze hodnotitN0Metastasy v regionálních lymfatick?ch uzlinách nejsou p?ítomnyN1P?ítomnost metastas v regionálních lymfatick?ch uzlináchM Vzdálené metastasyMXP?ítomnost vzdálen?ch metastas nelze hodnotitM0Vzdálené metastasy nejsou p?ítomnyM1P?ítomnost vzdálen?ch metastázM1aMetastasy mimo regionální mízní uzlinu/yM1bKostní metastasyM1cMetastasy v jin?ch orgánechP?íloha 5: Histopatologick? stupeň diferenciace karcinom?, Gleason scoreK histopatologickému hodnocení primárního nádoru se vyu?ívá stupnice diferenciace ozna?ované jako grading (viz tab. 1). Tabulka 1: Obecné hodnocení stupně diferenciace karcinom?.GXstupeň diferenciace nelze hodnotitG1dob?e diferencovan?G2st?edně diferencovan?G3nízce diferencovan?G4nediferencovan?Pro grading karcinomu prostaty byl vypracován speciální hodnotící systém ozna?ován jako Gleasonovo skóre (GS, Gleason?v gradingov? systém) (viz tab.2). Ten hodnotí architektonické uspo?ádání nádorov?ch lo?isek. Vyjad?uje dvě nej?astěji zastoupené gradingové jednotky v?rozsahu 2 (1+1) a? 10 (5+5). Se zv??en?m GS klesá diferenciace ?lázek (Sobin a Wittekind, 1997; Luke?, 2005; Du?ek, 2010). Fotografie na?konci této p?ílohy dokumentuje mikroskopick? nález CaP.Tabulka 2: Grading karcinomu prostaty (GS). Dle (Mare?, 2003).GS 2-4dob?e diferencovan?GS 5-6st?edně diferencovan?GS 7st?edně ?patně diferencovan?GS 8-10?patně diferencovan?Fotografie zachycuje nádorovou tkáň adenokarcinomu prostaty. Dle GS odpovídá pravá ?ást fotografie GS 6: nádorová tkáň je st?edně diferencovaná, ?lázky jsou variabilní co do velikosti i?tvaru. Levá ?ást fotografie zachycuje ?patně diferencovan? karcinom (GS 10): pozorujeme kompletní ztrátu glandulární diferenciace, dominují solidní trámce, lo?iska ?i izolované disociované nádorové buňky. Zvět?ení 40x.P?íloha 6: Struktura transmembránového p?ena?e?e ZipZobrazení transmembránov?ch domén III, IV a V?transportéru Zip1. U rodiny Zip transportér? jsou histidiny (H) ve smy?ce vysoce konzervované. Mutace histidinu za?alanin na pozici 158 a?160 v?razně sni?uje schopnost transportovat zinku. Histidiny ve smy?ce a?v?transmembránov?ch doménách III a IV (pozice 190 a 217) se?potencionálně podílejí na formování koordina?ní vazby pro zinek, která je zapojena do transportního procesu (Milon et al., 2006; Costello et al., 2011), obrázek dle (Milon et al., 2006).P?íloha 7: Klasifikace matrixov?ch metaloproteinas. Upraveno dle (Zitka et al., 2010).MMPMetaloproteinasa kDaEC klasifikacelokussubstrátyMMP-1Kolagenasa43EC 3.4.24.711q22-q23některé typy kolagenu (I, II, III, VIII, X), gelatin, agrekan, L-selektin, IL-1? proteoglykan, enaktin, ovostatin, MMP-2, MMP-9MMP-2Gelatinasa AGelatinasa typu IVKolagenasa726666EC 3.4.24.2416q13některé typy kolagenu (I, IV, V, VII, X, XI, XIV), gelatin, elastin, agrecan, fibronektin, osteonektin, laminin, MMP-1, MMP-9, MMP-13MMP-3Stromelysin-1Proteoglykanasa46EC 3.4.24.1711q23kolagen typu III, IV, V a IX, gelatin, agrekan, perlekan, dekorin, laminin, entaktin, elastin, kasein, plazminogen, osteonektin, ovostatin, MMP-2, MMP-7, -8, -9,-13,TIMP-?2MMP-7Martrilysin20EC 3.4.24.2311q21-q22kolagen typu IV a X, gelatin, agrekan, dekorin, fibronektin, laminin, entaktin, elastin, kasein, tranferin, plasminogen, MMP-1, -2, -9, TIMP-1MMP-8Neutrofilová kolagenasa58EC 3.4.24.3411q21-q22kolagen typu I, II, III, V, VII, VIII a X, gelatin, akrekan, fibronektinMMP- 9Gelatinasa B92EC 3.4.24.3520q11.2-q13.1kolagen typu IV, V, VII, X a XIV, gelatin, antaktin, agrekan, elastin, fibronektin, osteonektin, plasminogen, IL-1bMMP- 10Stromelysin-246EC 3.4. 2. 2211q22.3- q23kolagen typu III, IV, V, gelatin, kasein, agrekan, elastin, MMP-1, -8MMP- 11Stromelysin- 344n.k.22q11.2Neznám?Klasifikace matrixov?ch metaloproteinas (pokra?ování). Upraveno dle (Zitka et al., 2010).MMPMetaloproteinasa kDaEC klasifikacelokussubstrátyMMP-12Makrofágová metaloelastasa45EC 3.4.24.6511q22.2-q22.3kolagen IV, gelatin, kasein, elastin, fibronektin, vintronektin, laminin, entaktin, fibrinogen, fibrin, plasminogenMMP-13Kolagenasa-355n.k.11q22.3kolagen I-IV, IX, X a XIV, gelatin, plasminogen, agrekan, perlekan, fibronektin, osteonektin, MMP-9MMP- 14MT1-MMP54n.k.14q11-q12kolagen I-III, gelatin, kasein, fibronektin, laminin, vintronektin, entaktin, proteoglykany, MMP-2, MMP-13MMP-15MT2-MMP61n.k.16q12.2-q21fibronektin, entaktin, laminin, perlekan, MMP-2MMP-16MT3- MMP55n.k.8q21kolagen typu III, gelatin, kasein, fibronektin, MMP-2MMP- 17MT4-MMP54n.k.12q24neznám?MMP- 18Kolagenasa-4n.k.neznám?kolagen typu I-III, VIII a X, gelatin, agrekanMMP- 19RASI- 1n.k.12q14gelatin, agrekan, fibronektinMMP- 20Enamelysinn.k.neznám?amelogrenein, agrekanMMP-21*n.k.1p36.3neznám?MMP-22*n.k.1p36.3neznám?MMP- 23*n.k.neznám?neznám?Klasifikace matrixov?ch metaloproteinas (pokra?ování). Upraveno dle (Zitka et al., 2010).MMPMetaloproteinasa kDaEC klasifikacelokussubstrátyMMP- 24MT5-MMPn.k.20q11.2neznám?MMP- 25MT6-MMPn.k.16p/3.3pro-gelatinasa A, fibrin, fibronektin, kolagen IV, gelatinMMP- 26Matrylysin-2n.k.neznám?gelatin Iα, fibrinogen, fibronektin, vintronektinMMP- 28Epilysinn.k.17q11.2kasein*Geny pro tyto MMP byly nalezeny na chromosomech, jejich funkce a struktura prozatím nebyla identifikována, n.k.- nebylo klasifikováno.P?íloha 8: ??ast na odborn?ch akcích, publikaceAxmanová Martina, Holubová Monika, Gumulec Jaromír, Sztalmachová Markéta, Polanská Hana, Hudcová Krist?na, Balvan Jan, Raudenská Martina, Kizek René, Masa?ík Michal (11/2013): Zinek rezistentní PC-3 linie: expresní a?imunocytochemická anal?za vybran?ch gen? korespondujících s metabolizmem a?transportem Zn2+ iont?. IX. Dny diagnostické, experimentální a prediktivní onkologie, Olomouc.Holubová Monika, Axmanová Martina, Sztalmachová Markéta, Gumulec Jaromír, Masa?ík Michal (11/2013): Charakteristika zinek-rezistentních linií ve vztahu k?apoptóze. IX. Dny diagnostické, experimentální a prediktivní onkologie, Olomouc.Holubová Monika, Axmanová Martina, Gumulec Jaromír, Balvan Jan, Sztalmachová Markéta, Raudenská Martina, Kizek René, Adam Vojtěch, Masa?ík Michal (2013): Anal?za gen? regulujících apoptózu u zinek rezistentních buně?n?ch linií. XXXVII. Brněnské onkologické dny a XXVII. Konference pro neléka?ské zdravotnické pracovníky.Holubová Monika, Axmanová Martina, Gumulec Jaromír, Balvan Jan, Sztalmachová Markéta, Raudenská Martina, Kizek René, Adam Vojtěch, Masa?ík Michal (2013): Anal?za exprese gen? regulujících apoptózu u nádorov?ch linií prostaty po p?sobení kapsaicinu. XXXVII. Brněnské onkologické dny a XXVII. Konference pro neléka?ské zdravotnické pracovníky.Axmanová Martina, Masa?ík Michal (2012): Stanovení vybran?ch matrix metaloproteináz v?nádorov?ch liniích a v?sérech pacient? s?karcinomem prostaty. Sborník studentského workshopu- Toxikománie, Brno. Holubova Monika, Axmanova Martina, Gumulec Jaromir, Raudenska Martina, Sztalmachova Marketa, Babula Petr, Adam Vojtech, Kizek Rene and Masarik Michal: KRAS-PI3K-NF-kB is involved in the development of zinc resistance and reduced curability in prostate cancer: movement along the axis of evil. Metallomics (in press). ................
................

In order to avoid copyright disputes, this page is only a partial summary.

Google Online Preview   Download