Lékařská fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci

ࡱ> -C8q`

bjbjqPqP::2YAbRtƴb]6Ƽ ^.h6

|4666666$h!Z k^dkkZ.uuuk4KR(^8.4uk4uu8: Mgr. Radek Vodi ka, Ph.D.

Olomouc 2013

Prehlsenie Prehlasujem, ~e dizerta n prca bola vypracovan samostatne pod vedenm Mgr. Radka Vodi ku, Ph.D. a v zozname literatry s uveden vaetky pou~it literrne a odborn zdroje.

V Olomouci dHa & & & & & & & & .

Poakovanie

Rd by som poakoval predovaetkm mjmu akolite>ovi Mgr. Radkovi Vodi kovi, Ph.D. za vedenie a cenn rady. Vrel vaka za odborn pomoc patr doc. RNDr. Radkovi Vrtlovi, Ph.D., prof. MUDr. Frantiakovi KopYivovi, Ph.D. a prof. MUDr. JiYmu `antavmu, CSc. Vaka za atatistick analzu patr doc. RNDr. L. Duakovi, Ph.D. ajeho kolektvu, hlavne RNDr. Michaele Cvanovej. alej sa chcem poakovae za podporu a pomoc celmu DNA laboratriu stavu LkaYsk genetiky a fetln medicny vo FN Olomouc. Prca bola podporen grantovou agentrou IGA MZ CZ, grantom

 . NR8383-3/2005 a grantom

. NR8954-3/2006 Obsah:  TOC \o "1-6" \h \z \u  HYPERLINK \l "_Toc353428945" Obsah:  PAGEREF _Toc353428945 \h 4  HYPERLINK \l "_Toc353428946" 1. vod  PAGEREF _Toc353428946 \h 8  HYPERLINK \l "_Toc353428947" 2. Charakteristika alergi  PAGEREF _Toc353428947 \h 11  HYPERLINK \l "_Toc353428948" 2.1 Imunopatologick reakcie  PAGEREF _Toc353428948 \h 11  HYPERLINK \l "_Toc353428949" 2.1.1 Humorlne imunopatologick reakcie  PAGEREF _Toc353428949 \h 11  HYPERLINK \l "_Toc353428950" 2.1.2 Imunopatologick reakcie mediovan bunkami  PAGEREF _Toc353428950 \h 13  HYPERLINK \l "_Toc353428951" 2.2 Atopia  PAGEREF _Toc353428951 \h 14  HYPERLINK \l "_Toc353428952" 2.3 Alergny  PAGEREF _Toc353428952 \h 15  HYPERLINK \l "_Toc353428953" 2.4 Mechanizmy vedce ktvorbe IgE protiltok  PAGEREF _Toc353428953 \h 16  HYPERLINK \l "_Toc353428954" 2.4.1 Senzibilizcia alergnom, tvorba Th2 lymfocytov  PAGEREF _Toc353428954 \h 16  HYPERLINK \l "_Toc353428955" 2.4.2 Signly vedce ktvorbe IgE  PAGEREF _Toc353428955 \h 18  HYPERLINK \l "_Toc353428956" 2.4.3 Mechanizmus tvorby IgE  PAGEREF _Toc353428956 \h 19  HYPERLINK \l "_Toc353428957" 2.4.3.1 Antignna apecifickose - preskupovanie gnov pre VH aVL domny imunoglobulnov  PAGEREF _Toc353428957 \h 20  HYPERLINK \l "_Toc353428958" 2.4.3.2 Isotypov prieamyk  terminlna diferencicia B lymfocytu  PAGEREF _Toc353428958 \h 23  HYPERLINK \l "_Toc353428959" 2.5 truktra IgE asignalizcia pomocou IgE  PAGEREF _Toc353428959 \h 25  HYPERLINK \l "_Toc353428960" 2.6 Fzy alergickej reakcie  PAGEREF _Toc353428960 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc353428961" 2.6.1 Fza senzibilizcie  PAGEREF _Toc353428961 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc353428962" 2.6.2 V asn aoneskor fza alergickej reakcie  PAGEREF _Toc353428962 \h 29  HYPERLINK \l "_Toc353428963" 2.7 Alergick choroby  PAGEREF _Toc353428963 \h 29  HYPERLINK \l "_Toc353428964" 2.7.1 Vskyt alergi  PAGEREF _Toc353428964 \h 30  HYPERLINK \l "_Toc353428965" 2.7.2 Asthma bronchiale  PAGEREF _Toc353428965 \h 33  HYPERLINK \l "_Toc353428966" 2.7.2.1 Vskyt  PAGEREF _Toc353428966 \h 33  HYPERLINK \l "_Toc353428967" 2.7.2.2 Etiopatogenza astmy  PAGEREF _Toc353428967 \h 33  HYPERLINK \l "_Toc353428968" 2.7.2.3 Symptmy astmy  PAGEREF _Toc353428968 \h 35  HYPERLINK \l "_Toc353428969" 2.7.2.4 Klasifikcia astmy  PAGEREF _Toc353428969 \h 37  HYPERLINK \l "_Toc353428970" 2.7.2.5 Lie ba astmy  PAGEREF _Toc353428970 \h 38  HYPERLINK \l "_Toc353428971" 2.7.3 Atopick ekzm  PAGEREF _Toc353428971 \h 40  HYPERLINK \l "_Toc353428972" 2.7.4 alaie alergick ochorenia  PAGEREF _Toc353428972 \h 41  HYPERLINK \l "_Toc353428973" 3. Genetika alergi  PAGEREF _Toc353428973 \h 42  HYPERLINK \l "_Toc353428974" 3.1 Dedi nose alergi  PAGEREF _Toc353428974 \h 42  HYPERLINK \l "_Toc353428975" 3.2 Preh>ad genetickch atdi zameranch na vskyt astmy aatopie.  PAGEREF _Toc353428975 \h 45  HYPERLINK \l "_Toc353428976" 3.2.1 Vskytastmy aatopie vo vzeahu kHLA systmu  PAGEREF _Toc353428976 \h 45  HYPERLINK \l "_Toc353428977" 3.2.2 Vzbov acelogenmov atdie h>adajce lokusy pre astmu aatopiu  PAGEREF _Toc353428977 \h 48  HYPERLINK \l "_Toc353428978" 3.2.3 Preh>ad vybranch lokusov / kandidtskych gnov  PAGEREF _Toc353428978 \h 57  HYPERLINK \l "_Toc353428979" 3.2.3.1 chromozm 4  PAGEREF _Toc353428979 \h 57  HYPERLINK \l "_Toc353428980" 3.2.3.2. chromozm 5  PAGEREF _Toc353428980 \h 57  HYPERLINK \l "_Toc353428981" 3.2.3.3 chromozm 6  PAGEREF _Toc353428981 \h 60  HYPERLINK \l "_Toc353428982" 3.2.3.4 chromozm 7p  PAGEREF _Toc353428982 \h 62  HYPERLINK \l "_Toc353428983" 3.2.3.5 chromozm 11q  PAGEREF _Toc353428983 \h 63  HYPERLINK \l "_Toc353428984" 3.2.3.6 chromozm 12q  PAGEREF _Toc353428984 \h 64  HYPERLINK \l "_Toc353428985" 3.2.3.7 chromozm 13q  PAGEREF _Toc353428985 \h 65  HYPERLINK \l "_Toc353428986" 3.2.3.8 chromozm 14q  PAGEREF _Toc353428986 \h 66  HYPERLINK \l "_Toc353428987" 3.2.3.9 chromozm 19  PAGEREF _Toc353428987 \h 66  HYPERLINK \l "_Toc353428988" 3.2.3.10 chromozm 20q  PAGEREF _Toc353428988 \h 67  HYPERLINK \l "_Toc353428989" 3.2.3.11 chromozm Xq  PAGEREF _Toc353428989 \h 68  HYPERLINK \l "_Toc353428990" 3.3 Charakteristika vybranch kandidtskych gnov  PAGEREF _Toc353428990 \h 68  HYPERLINK \l "_Toc353428991" 3.3.1 STAT6  PAGEREF _Toc353428991 \h 69  HYPERLINK \l "_Toc353428992" 3.3.1.1 truktra STAT6  PAGEREF _Toc353428992 \h 70  HYPERLINK \l "_Toc353428993" 3.3.1.2 truktra STAT6 protenu  PAGEREF _Toc353428993 \h 71  HYPERLINK \l "_Toc353428994" 3.3.1.3 Funkcia STAT6 protenu  PAGEREF _Toc353428994 \h 73  HYPERLINK \l "_Toc353428995" 3.3.1.4 Signlna drha STAT6  PAGEREF _Toc353428995 \h 74  HYPERLINK \l "_Toc353428996" 3.3.1.5 Aktivcia transkripcie zvislej na STAT6  PAGEREF _Toc353428996 \h 77  HYPERLINK \l "_Toc353428997" 3.3.1.6 Polymorfizmy v STAT6  PAGEREF _Toc353428997 \h 79  HYPERLINK \l "_Toc353428998" 3.3.2 ADAM33  PAGEREF _Toc353428998 \h 81  HYPERLINK \l "_Toc353428999" 3.3.2.1 truktra ADAM33  PAGEREF _Toc353428999 \h 81  HYPERLINK \l "_Toc353429000" 3.3.2.2 truktra ADAM33 protenu  PAGEREF _Toc353429000 \h 82  HYPERLINK \l "_Toc353429001" 3.3.2.3 Isoformy ADAM33 amo~n funkcie protenu ADAM33  PAGEREF _Toc353429001 \h 85  HYPERLINK \l "_Toc353429002" 3.3.2.4 Polymorfizmy v ADAM33  PAGEREF _Toc353429002 \h 91  HYPERLINK \l "_Toc353429003" 4. Ciele dizerta nej prce  PAGEREF _Toc353429003 \h 95  HYPERLINK \l "_Toc353429004" 5. Materil ametdy  PAGEREF _Toc353429004 \h 96  HYPERLINK \l "_Toc353429005" 5.1 Charakteristikasledovanch skupn  PAGEREF _Toc353429005 \h 96  HYPERLINK \l "_Toc353429006" 5.1.1 Posdenie atopie vsledovanch skupinch  PAGEREF _Toc353429006 \h 96  HYPERLINK \l "_Toc353429007" 5.1.2 Posdenie p>cnych funkci aBHR pomocou spirometrie  PAGEREF _Toc353429007 \h 97  HYPERLINK \l "_Toc353429008" 5.2 Genotypizcia  PAGEREF _Toc353429008 \h 100  HYPERLINK \l "_Toc353429009" 5.2.1 Izolcia DNA zleukocytov perifrnej krvi Millerovou metdou  PAGEREF _Toc353429009 \h 100  HYPERLINK \l "_Toc353429010" 5.2.2 Sekvencia  PAGEREF _Toc353429010 \h 101  HYPERLINK \l "_Toc353429011" 5.2.3 Genotypizcia sTaqMan sondami  PAGEREF _Toc353429011 \h 107  HYPERLINK \l "_Toc353429012" 5.3 Haplotypizcia  PAGEREF _Toc353429012 \h 110  HYPERLINK \l "_Toc353429013" 5.4 tatistika  PAGEREF _Toc353429013 \h 110  HYPERLINK \l "_Toc353429014" 6. Vsledky  PAGEREF _Toc353429014 \h 115  HYPERLINK \l "_Toc353429015" 6.1 Polymorfizmy STAT6 aADAM33 a ich vzeah k hladine celkovch IgE akvskytu astmy.  PAGEREF _Toc353429015 \h 115  HYPERLINK \l "_Toc353429016" 6.1.1 Charakteristika primrnych dt  PAGEREF _Toc353429016 \h 115  HYPERLINK \l "_Toc353429017" 6.1.2 Asocicia polymorfizmov shladinou IgE aastmatickm fenotypom  PAGEREF _Toc353429017 \h 115  HYPERLINK \l "_Toc353429018" 6.2 Asocicia haplotypov shladinou IgE  PAGEREF _Toc353429018 \h 126  HYPERLINK \l "_Toc353429019" 6.2.1 Distribcia haplotypov vskmanch skupinch  PAGEREF _Toc353429019 \h 126  HYPERLINK \l "_Toc353429020" 6.2.2 Haplotypy STAT6 ahladina celkovch IgE  PAGEREF _Toc353429020 \h 126  HYPERLINK \l "_Toc353429021" 6.2.2.1 Parentlny pvod haplotypu a hladina celkovch IgE  PAGEREF _Toc353429021 \h 130  HYPERLINK \l "_Toc353429022" 6.2.2.2 Pohlavie a hladina celkovch IgE  PAGEREF _Toc353429022 \h 131  HYPERLINK \l "_Toc353429023" 6.2.2.3 Haplotypy STAT6 aich vzba na kategorizovanou hladinu IgE  PAGEREF _Toc353429023 \h 131  HYPERLINK \l "_Toc353429024" 6.2.3 Haplotypy ADAM33 ahladina celkovch IgE  PAGEREF _Toc353429024 \h 134  HYPERLINK \l "_Toc353429025" 6.3 Asocicia haplotypov srovHou BHR  PAGEREF _Toc353429025 \h 134  HYPERLINK \l "_Toc353429026" 6.3.1 Haplotypy ADAM33 abronchoprovokcie shistamnom  PAGEREF _Toc353429026 \h 134  HYPERLINK \l "_Toc353429027" 6.3.2 Haplotypy ADAM33 abronchoprovokcie smetacholnom  PAGEREF _Toc353429027 \h 134  HYPERLINK \l "_Toc353429028" 6.3.3 Vzeah haplotypov STAT6 kBHR  PAGEREF _Toc353429028 \h 139  HYPERLINK \l "_Toc353429029" 7. Diskusia  PAGEREF _Toc353429029 \h 141  HYPERLINK \l "_Toc353429030" 8. Shrn  PAGEREF _Toc353429030 \h 157  HYPERLINK \l "_Toc353429031" 9. Summary  PAGEREF _Toc353429031 \h 159  HYPERLINK \l "_Toc353429032" 10. Pou~it zkratky, vysvetlivky  PAGEREF _Toc353429032 \h 161  HYPERLINK \l "_Toc353429033" 11. Zoznam publikci  PAGEREF _Toc353429033 \h 163  HYPERLINK \l "_Toc353429034" 12. Pou~it literatra  PAGEREF _Toc353429034 \h 166  1. vod

Alergick reakcia je charakterizovan neadekvtnou odpoveou inak zdravch jedincov na nekodn vonkajie antigny. Prejavom alergickej reakcie na klinickej rovni s alergick choroby (napr. astma, atopick ekzm apolinza), ktorch vskyt vposlednch dekdach vrazne stpol. Pri opakovanej expozcii organizmu tmito antignmi (alergnmi) dochdza krozvoju zpalovch zmien vtkanivch aorgnoch vedcich nasledovne kporuchm ich funkcie a integrity1. Vskyt alergickch chorb je znmy u~ pomerne dlh dobu. Prv popis choroby, ktorej symptmy by mohli odpovedae pochdza zo starovekej ny (rok 2600 pred n.l.). O astme vieme tie~ z Ebersovho staroegyptskho papyrusu, kde jeden recept popisuje prpravu zmesi kinhalcii (16 str. pred n.l.). Ako medicnsky termn bola astma pou~it a~ Hippokratesom vjeho diele Corpus Hippocraticum (pribli~ne v4. storo ie pred n.l.). Plnius st. (okolo roku 50 n.l.) si vaimol vzeah pe>ov svskytom dchacch ea~kost aako liek odpor al ltku na bze efedrnu rozpusten vo vne. Henry Hyde Salder2 u~ vroku 1860 vo svojom ve>kom diele pojednvajcom podrobne oastme napsal, ~e nem~e bye pochybnost otom, ~e astma je dedi nm ochorenm. Neskoraie atdie vskytu

astch alergickch ochoren u dvoj iat odhalili, ~e dedi n predispozcia m dle~it lohu pri ich vzniku aich heritabilita bola vyaaia umonozygotnch dvoji iek vporovnan sdizygotnmi3,4. `tdia dvoji iek zroku 2009 poukzala na to, ~e genetick faktory najsilnejaie ovplyvHuj hladinu IgE avek nstupu alergickho ochorenia5. Vrodinch svskytom alergickho ochorenia nebol preukzan jasn typ mendelovskho dedi nho prenosu anavyae vplyv vonkajaieho prostredia zohrva vetiopatogenze tchto onemocnen taktie~ dle~it lohu. Preto sa alergick choroby vdneanej dobe pova~uj za choroby skomplexnou dedi noseou aokolit prostredie m vplyv na variabilitu adobu prejavenia sa symptmov alergie6-9.

Nastavenie imunitnho systmu dieeaea m~e bye ovplyvnen u~ iprenatlne v dsledkuspsobu ~ivota matky. Pravideln expozcia matky prostrediu bohatmu na mikrobilne zlo~ky bola spojen sprotektvnym vplyvom proti atopickej senzibilizcii plodu vpostnatlnom obdob10. Suplementcia kyselinou listovou vpriebehu tehotenstva vo vzeahu katopii aastme je alaou diskutovanou tmou. Pod>a zverov atdie Whitrova aspol.11 prestavovalo u~vanie kyseliny listov v3. trimestri 1,25x vyaaie riziko pre vskyt detskej astmy (v 3,5 roku) a1,32x vyaaie riziko pre rozvoj perzistujcej astmy. Tieto vsledky boli vslade spozorovaniami umya a dvali sa do svislosti sepigenetickmi vplyvmi  mo~n zvaenie metylcie gnov zodpovednch za vznik astmy. Sharland aspol.12 zhodnotili vsledky atyroch predchdzajcich observa nch atdi, adoali ku kontroverznm vsledkom, nako>ko asocicia bola bu len mierna, alebo so suplementciou foltmi vskorej alebo pokro ilej fze gravidity. Bekkers aspol.13 naproti tomu, svnimkou mierneho zvaenia rizika pre skor pskanie na prieduakch vroku ~ivota, nenaali zvaen riziko vskytu respira nch alebo alergickch problmov vspojitosti sprenatlnou suplementciou kyselinou listovou. Faj enie vgravidite je alam faktorom, ktor bol spojen svskytom astmy udet14, pri om tento vplyv m~e bye vrazneja udcr ~ien faj iacich v tehotenstve15, alebo uosb nescich Arg16 alelu vgne preb2-adrenergn receptor16. Vroku 1989 bola po prv krt popsan vzba chromozmovej oblasti 11q13 svskytom atopie17. Tento objav bol momentom, ktor odatartoval revolciu vatdiu molekulovo genetickej podstaty alergickch chorb  zatia>

o vroku 1998 bolo znmych 6 lokusov spojench svskytom atopie, astmy alebo svisiacich fenotypov, tak vroku 2008 Vercelli18 u~ referuje oviac ne~ 200 kandidtskych gnoch pre astma asvisiace fenotypy identifikovan pomocou rznych prstupov. Vnasledujcich rokoch pribudli alaie poznatky omolekulrne  genetickej podstate alergickch chorb na zklade celogenmovch asocia nch atdi (GWAS).

2. Charakteristika alergi

2.1 Imunopatologick reakcie Ka~d imunologick reakcia prebiehajca vorganizme m~e za ur itch okolnost viese kmenaiemu alebo v aiemu poakodeniu organizmu. Vprpade tchto okolnost potom hovorme oimunopatologickej reakcii. Tto m~e bye do ur itej miery ived>ajam nsledkom vpriebehu be~nch obrannch reakci organizmu proti patognom

i vdsledku imunitnej reakcie proti antignom telu vlastnm (autoimunitn reakcie). Vprpade alergie dochdza kneadekvtnej reakcii na antigny, ktor s be~ne neakodn, tieto ozna ujeme ako alergny.

Imunologick reakcie delme pod>a prevldajcich mechanizmov na reakcie sprostredkovan humorlne abunkami. Pri rozvoji samotnej alergickej reakcie sa m~e uplatnie prakticky ktorko>vek zo zkladnch typov imunologickch reakci, ktor sa klasicky delia do 4 skupn pod>a Coombsa aGela. Toto klasick delenie vaak nezahrHuje vaetky imunopatologick mechanizmy, ktor vdneanej dobe poznme - bolo doplnen Roittom oreakcie antireceptorovch protiltok. S asne kvzniku alergickej reakcie m~e dochdzae aj kombinciou vyaaie uvedench reakci20.

2.1.1 Humorlne imunopatologick reakcie

Reakcia I. typu  reakcia s aseou IgE protiltok, atopia Tto reakcia je naj astejaou aje charakteristick tvorbou IgE proti niektorm alergnom vonkajaieho prostredia, ako napr. pe>ov zrnk

i potravinov alergie apod. Je ozna ovan tie~ ako precitlivenose bezprostrednho typu, nako>ko po styku salergnom dochdza kreakcii vpriebehu nieko>kch mint. Pre rozvoj samotnej reakcie je ale najprv potrebn senzibilizcia organizmu  pri prvom kontakte salergnom je alergn pohlten antign prezentujcimi bunkami (APC), nsledne je vnich rozlo~en na peptidov fragmenty, ktor s pomocou HLA vystaven na povrchu APC. Takto prezentovan fragmenty alergnu m~u bye rozpoznan receptormi naivnch CD4+ T lymfocytov, ktor sa vdsledku tejto interakcie diferencuj valergn apecifick Th2 bunky. Th2 bunky nsledne produkuj, mimo in, iIL-4, ktor podnecuje B lymfocyty ktvorbe apecifickch IgE (izotypov prieamyk / prepnutie). Vytvoren IgE sa svysokou afinitou via~u na mastocyty abazofily. Takto vyzbrojen bunky sa po optovnom stretnut so apecifickm alergnom aktivuj auvo>Huj histamn, heparn aalaie substancie podporujce zpal. Jedn sa oprv fzu alergickej reakcii, po ktorej nasleduje fza charakteristick tvorbu asekrciou metabolitov kyseliny arachidnovej. Samotn alergick reakcia potom prebieha vzvislosti na mieste vstupu bu loklne (napr. alergick ndcha) alebo celkovo (anafylaktick aok) 19,20.

Reakcia II. typu  reakcia mediovan pomocou IgG aIgM protiltok

1.cytotoxick protiltky IgM aIgG protiltky, ktor vznikaj pri tomto typu reakcie, maj schopnose aktivovae komplement alebo vyvolae reakciu typu ADCC (bunkov cytotoxicita zvisl od protiltok). Fagocyty aNK bunky pomocou svojich povrchovch Fc receptorov s schopn viazae

asti molekl IgM. Tmto mechanizmom s fagocyty aNK bunky schopn rozpoznae bunky ozna en protiltkami, dostae sa snimi do blzkeho kontaktu pomocou vlastnch mechanizmov cytotoxicity ich potom zni ie. Do tejto skupiny patria transfzne reakcie (hlavne pri inkompatibilite ABO systmu), alej Rh inkompatibilita areakcie pri orgnovo apecifickch autoimunitnch chorobch (cytopnie, Goodpastureovej syndrm) apod.

2. blokujce alebo stimulujce protiltky Tento typ protiltok stimuluje alebo blokuje funkciu cie>ovej atruktry. Vprpade membrnovch receptorov dochdza kstimulcii jeho funkcie (napr. anti TSH protiltky pri Graves Basedovej chorobe)

i kblokovan jeho funkcie vdsledku kompetcie sur itm ligandom (napr. myastenia gravis, vzcne formy diabetu). alej protiltky m~u inhibovae funkciu iur itho protenu (napr. pernicizna anmia, antifosfolipidov syndrm aniektor formy hemoflie).

Reakcia III. typu  imunopatologick reakcia stvorbou imunokomplexov Utchto reakci je mo~n njse ur it paralely satopiou, spsobuj ich ale IgG protiltky. Za fyziologickch podmienok dochdza po vytvoren komplexu protiltky salergnom kich elimincii prostrednctvom fagocytzy. Pri nefyziologickch pochodoch dochdza kich ukladaniu do tkanv aich vzbe na Fc receptory fagocytov,

i kspusteniu komplementu snslednou aktivciou poakodzujcich reakci. Ktvorbe ve>kho mno~stva imunokomplexov schopnch viese kpatologickmu stavu je ale potrebn tvorba ve>kho mno~stva protiltok. Vdsledku tohto faktu tieto reakcie vznikaj a~ po ur itej dobe, priemerne po 10-14 dHoch. Tento typ reakcie sa typicky vyskytuje napr. tzv. srovej nemoci, Arthusovej reakcii alebo pri poakoden p>c pri tzv. farmrskych p>cach. Pri autoimunitnch chorobch m~eme tto reakciu pozorovae napr. pri systmovom lupus erytematodes.

2.1.2 Imunopatologick reakcie mediovan bunkami

Reakcia IV. typu imunopatologick reakcia soddialenm nstupom (DTH) Tento typ loklnej zpalovej reakcie je zvisl na Th1 lymfocytoch amakrofgoch /monocytoch. Prv kontakt organizmu salergnom vedie ktvorbe pecifickch Th1 buniek. Po opakovanom stretnut sa santignom dochdza s24 72 hodinovm oneskorenm vmieste jeho vstupu kloklnej reakcii, preto~e do tohto miesta musia najprv migrovae Th1 bunky amakrofgy avzjomne sa zastimulovae (IFN-g produkovan Th1 lymfocytmi aktivuje makrofgy). Vdsledku infiltrcie tmito bunkami dochdza kvskytu charakteristickho tvrdho opuchu. Za fyziologickch podmienok vedie tto reakcia kodstrneniu intracelulrnych patognov, pri pretrvvajcom podnete vak dochdza kpokodzovaniu tkaniva. Tento typ reakcie je zodpovedn za pokodzovanie tkanv napr. pri mykobakterilnych infekcich alebo pri niektorch autoimunitnch ochoreniach (sarkoidza, granulomatzne vaskulitdy

i demyeliniza n autoimunitn choroby).

alaie typy bunkami sprostredkovanch imunopatologickch reakci. Zstupcom tejto skupiny je reakcia mediovan cytotoxickmi bunkami, ktor je podobn reakcii DTH, ale vjej patogenzii sa nadto aktivuj alaie efektory, hlavne CD8+ lymfocyty  likviduj bunky infikovan vrusmi alebo inak ozna en bunky. alej sa tu uplatHuj Th17 lymfocyty produkciou hlavne IL-17, IL-21 a IL-22. Tento typ reakcie sa uplatHuje pri vrusovch hepatitdach, niektorch formch autoimunitnch zpalov attnej ~>azy avpri aktnej rejekcii transplanttu. Dotejto skupiny reakci sa eate radia reakcie na cudzie teleso areakcie pri sepsy.

2.2 Atopia Ako u~ bolo vvode spomenut, alergick reakcia sa m~e rozvjae na podklade ktorhoko>vek typu imunopatologickej reakcie. Nako>ko vaak naj astejaou reakciou uplatHujcou sa u alergikov je precitlivenose 1. typu, charakterizovan tvorbou IgE protiltok, tak oalergii vu~aom slova zmysle hovorme prve vtakchto prpadoch. Atopiou potom ozna ujeme geneticky podmienen predispozciu reagovae na be~n alergny vonkajaieho prostredia zvaenou tvorbou apecifickch protiltok triedy IgE ato ipri ve>mi nzkej koncentrcii alergnu1. Osoba satopiou sa be~ne ozna uje ako atopik. Hladina IgE protiltok je za normlnych okolnost, ato iuatopikov, vrozmedz do 0,2 mg/dL. Cirkulujce IgE pretrvvaj relatvne krtko, ich pol as vskytu vkrvnom obehu je len pribli~ne 2 dni. Vprpade ich vzby na povrch tkanivovch mastocytov s pomerne stabiln amaj schopnose perzistovae vorganizme imesiace19. Samotn mastocyty nes na svojom povrchu vysoko afinitn receptor pre IgE (FceRI). Sliznice (respira n trakt, gastrointestinlny trakt

i sliznice o nch spojiviek) ako~a s miestami snajvyaam obsahom mastocytov apreto kvskytu IgE mediovanch alergickch chorb dochdza prve vtchto oblastiach organizmu. Klasicky uvdzanou fyziologickou funkciou IgE protiltok je ochrana organizmu proti parazitom. Vprpade alergickho ochorenia vaak dochdza kreakcii na neakodn alergn, ktor m~e viese a~ kpoakodeniu relevantnho orgnu alebo celho organizmu.

Atopia postihuje 30  40% osb vpopulcii vo vyspelch attoch, no nie v~dy mus mae ijednozna n klinick dopad, nako>ko

ase atopickch osb spreukzate>nou tvorbou apecifickch protiltok nem alergick ea~kosti. Opakovan expozcia organizmu ur itm alergnom ajeho interakcia so apecifickmi IgE nsledne vedie krozvoju zpalovej rekcie, ktor sa klinicky prejav ako niektor z alergickch ochoren. Zjednoduaene je potom mo~n prirovnae alergick ochorenie ako fenotypov prejavenie sa atopickho genotypu, pri om je ale nutn pamtae na to, ~e toto prirovnanie plat len pre reakcie sprostredkovan pomocou IgE1,19.

2.3 Alergny Alergnom m~e bye ozna en akko>vek cudzorod ltka majca vlastnose viese kalergickej reakcii. Vpraxi sa alergnom ozna uje jednak jeho zdroj (breza, rozto e apod.) ikonkrtna chemick atruktra simunochemicky alebo molekulrne charakterizovate>nm epitopom. V ainou sa jedn oproteny alebo glykoproteny, niektor znich maj ienzymatick aktivitu (jedn sa oprotezy). Medzi hlavn alergny patria tie, na ktor a~ 90% alergikov reaguje tvorbou apecifickch IgE protiltok. Niektor alergizujce bielkoviny m~u pochdzae zviacerch zdrojov, ich medzidruhov sekven n homolgia je asi 90% aozna ujeme ich ako panalergny. S pr inou skr~ench alergi. Vonkajaie prostredie m~e taktie~ ovplyvHovae vznik alergie, je znmym faktom, ~e napr. exhalty zautomobilovej dopravy zvyauj alergnny potencil pe>ovch antignov1.

2.4 Mechanizmy vedce ktvorbe IgE protiltok Vprocese tvorby IgE protiltok stoja vcentre diania, mimo samotn alergn vyvolvajci alergick reakciu, Th aB lymfocyty. Dle~it lohu maj aj alaie bunky, ktor sa stkaj santignom, spracovvaj ho ana zver predkladaj prve T lymfocytom  jedn sa otzv. antign prezentujce bunky (APC). Medzi ne patria hlavne dendritick bunky (DC) afolikulrne DC, alej aj monocyty,makrofgy, bazofily aza ur itch okolnost iB lymfocyty21. Antign je teda spracovan profesionlnou APC, tto ho prezentuje asociovan na HLA II na svojom povrchu apo rozpoznan fragmentu antignu prsluanou Th2 bunkou dochdza kjej aktivcii. Th2 lymfocyt nasledovne sekrtuje mno~stvo lymfoknov, zktorch niektor psobia aktiva ne na B lymfocyty, pri om Th2 zroveH ifyzicky kontaktuje B lymfocyt,

m dochdza kplnej aktivcii B lymfocytu atvorbe IgE.

2.4.1 Senzibilizcia alergnom, tvorba Th2 lymfocytov Pri prvom stretnut organizmu salergnom je tento pohlten APC  naj astejaie DC, popr. pomocou antign apecifickho IgM na povrchu B lymfocytu (Obr.1). Nsledne je antign vendozmoch spracovan ajeho fragmenty s vystaven na povrchu APC vkomplexe smolekulou HLA II. triedy. Idelnymi APC s prve DC, nako>ko nes na svojom povrchu obrovsk mno~stvo HLA II, potrebn adhzne molekuly akostimula n bielkoviny CD80 aCD86. Vprpade, ~e naivn CD4+ T lymfocyt (Th0) pomocou svojho receptoru (TCR) rozpozn antign na povrchu APC, tak dostane alaie signly ksvojej diferencicii ato prostrednctvom svojho kostimula nho receptoru CD28, ktor sa via~e na CD80 alebo CD86 exprimovanch na povrchu APC aalej prostrednctvom signalizcie cez receptory pre IL-4 aIL-2.

 Obr.1 Senzibilizcia organizmu alergnom Dendritick bunka (DC) funguje ako APC  po pohlten alergnu / antignu ( ierna bodka), dochdza kjeho atiepeniu vendozmoch. Po naatiepen (menaie

ierne bodky) s fragmenty alergnu prezentovan vo vzbe s HLA na povrchu DC  vtomto prpade na jednom jej zv aenom dendrite. Po rozpoznan fragmentu alergnu naivnou Th bunkou (pomocou apecifickho TCR) apo nslednej alaej kostimulcii (CD28-CD80/86, adhzne molekuly ICAM-LFA-1, IL-4) dochdza kstimulcii Th bunky, diferencicii na Th2 formu asekrcii pecifickej kombincie cytoknov. Nsledne, vprpade rozpoznania prezentovanho antignu na B bunke prostrednctvom TCR, dochdza k stimulcii B lymfocytu atvorbe IgE protiltok.

Dochdza tak kprolifercii adiferencicii na klon zrelch efektorovch Th22 buniek, tieto produkuj rzne lymfokny (hlavne IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 a IL-13) a s schopn poskytovae pomoc (apecificky ineapecificky) B bunkm aumo~nie im tak sekrciu IgE19,22,23. Pre tvorbu IgE je potrebn prve IL-4 ale iIL-13. IL-5 indukuje proliferciu eozinofilov, IL-6 tvorbu neutrofilov astimuluje T aB bunky, IL-9 zase indukuje proliferciu ~rnych buniek.

2.4.2 Signly vedce ktvorbe IgE B lymfocyty na svojom povrchu nes pre ne typick receptor B bunky (BCR), ktor je schopn rozoznae apecifick antign. Vprpade, ~e na B bunke je vkomplexe sHLA II naviazan apecifick antign atento je mo~n rozpoznae prostrednctvom TCR konkrtneho Th2 lymfocytu (jeho TCR m rovnak antignnu apecifikciu), tak TCR sa naH navia~e a T lymfocyt je schopn B lymfocytu poskytne apecifick pomoc (Obr.2). Po kontakte TCR sB bunkou posta uje kstimulcii produkcie IL-4 u~ len kontakt s adhznymi molekulami na B lymfocyte22. Signalizcia prostrednctvom IL-4 je prvm signlom pre tvorbu IgE  IL-4 sa via~e na svoj receptor na B bunke, aktivuje signlnu drhu vktorej m centrlne postavenie STAT6, ten prenaa signl do bunkovho jadra ajeho lohou je inicicia transkripcie Ce lokusu ea~kch reeazcov protiltok23. B bunka ale eate vskuto nosti netvor funk n ea~k reeazce. Aktivcia TCR zroveH vedie i kexpresii CD40L na povrchu T bunky (tto molekula sa vyskytuje na povrchu T buniek vpokojovom atdiu). Na B bunke je jeho receptor CD40, ktor je narozdiel od CD40L exprimovan konatitutvne. CD40L sa via~e na CD40 B bunky, indukuje jeho oligomerizciu predstavuje druh signl, ktor spaea dele n rekombina n prieamyk ktvorbe IgE.Aktivcia CD40 na B lymfocyte zroveH vedie kexpresii alach povrchovch molekl, ato hlavne molekl zrodiny B7 (CD80 apod.). Tieto sa via~u na svoj receptor CD28, konatitutvne exprimovanom na T bunke. CD28 je kostimula nou molekulou asl~i kalaej amplifikcii cytoknovho signlu19,22,23. Aktivcia CD40 vedie taktie~ kexpresii CD23,

o je receptor pro IgE snzkou afinitou.

 Obr. 2. Stimulcia B bunky Th2 lymfocytom Indukcia tvorby IgE vy~aduje prtomnose dvoch signlov. Vprvom kroku rozpozn TCR Th2 bunky antign na BCR. Vdsledku tohto dochdza jednak kindukcii tvorby IL-4 aalach cytoknov as asne sa za ne exprimovae CD40L  ten sa nsledne via~e na CD40 B bunky. Signl zCD40 aktivuje potom 2 deje. Jednak dochdza vspoluprci zo signlom zreceptoru pre IL-4 ktvorbe IgE ajednak vzbou ligandov kostimula nej skupiny B7 (CD80 aCD86 na CD28) dochdza kalaej stimulcii tvorby IL-4 vT bunkch,

o vedie kamplifikcii cytoknovho signlu.

2.4.3 Mechanizmus tvorby IgE

Protiltky s vo vaeobecnosti zlo~en z>ahkch aea~kch reeazcov. =ahk reeazce obsahuj jednu variabiln ajednu konatantn domnu (VL aCL). da~k reeazce triedy IgE sa skladaj zjednej variabilnej domny VH aatyroch konatantnch domn CH1-4 (sekrtovan formy). Dodato ne eate m~u obsahovae C terminlnu M domnu, ktor je zodpovedn za ukotvenie protiltok vplazmatickej membrne. Jednotliv gnov lokusy pre reeazce vo vaeobecnosti obsahuj v aie mno~stvo gnov tandemovo usporiadanch za sebou (Obr.3), zktorch prostrednctvom uniktneho rekombina nho procesu dochdza kzostaveniu vslednho gnu kdujceho apecifick reeazec.

 Obr. 3 `truktra lokusov kdujcich imunoglobulnov reeazce. da~k reeazce s kdovan IGH lokusom, >ahk reeazce kkduje zase gnov komplex IGk areeazce l lokus IGl (upraven pod>a HoYeja aBartoHkov26).

2.4.3.1 Antignna apecifickose - preskupovanie gnov pre VH aVL domny imunoglobulnov Vpriebehu svojho vvoja prechdza B lymfocyt viacermi atdiami. Vatdiu pro-B za na tvorba protiltok, ktor nie je zvisl od antignneho stimulu. Ako prv sa za n tvorie ea~k (H) reeazce. Proximlna

ase IgH lokusu obsahuje sady segmentov pre tvorbu variabilnej

asti ea~kho reeazca: Vsegmenty (variabilita)  ka~d zVH gnov je zlo~en zexnu L (leader = sl~i ktransportu protenu do endoplazmatickho retikula) azexnu V, ktor tvor preva~n

ase celho gnu (jednej kazety V) D segmenty (diverzita) J segmenty (z anglickho joining)

Vprocese tvorby variabilnej

asti reeazca dochdza temer knhodnej kombincie V, D aJ segmentov (dochdza ktendencii preferovae Vsegmenty najbli~aie kJ segmentom). Pre proces rekombincie s potrebn enzmy RAG-1 aRAG-2, ktor maj k topoizomerze podobn aktivitu, s zodpovedn za atiepenie DNA aiza jej optovn spjanie (diskutovan vref.24). K presnmuur eniu miesta, vktorom m nastae atiepenie DNA, sl~ia tzv. rekombina n signlne sekvencie. Jedn sa osekven ne konzervovan heptamry anonamry, ktor s oddelen medzernkom 12 alebo 23 bz (koreaponduje k1 alebo 2 ot kam DNA zvitnice). Samotn V, D aJ segmenty s tmito sekvenciami olemovan  VH gny na 3 konci, D gny po oboch koncoch aJH gny na 5 konci. Krekombincii m~e djse len medzi jedno advoj zvitovm signlom25. Ike rozpoznanie miest atiepenie je presn, tak samotn ligcia fragmentov vznikajcich pri rekombincii u~ nie je celkom presn  fragmenty DNA s spojen tzv. N sekom, ktor je novo syntetizovan am nhodn sekvenciu nukleotidov. Toto poskytuje alaiu variabilitu pri vzniku antignnej apecifickosti protiltky26.

Ako prv sa preskupuj segmenty D aJ, kedy djde kvyatiepeniu DNA medzi nhodnm D aJH gnom. Pokia> ostali eate alaie nevyatiepen segmenty D aJ, tak tento proces sa m~e opakovae. Vnslednom atdiu dochdza kVD preskupeniu, kedy znovu dochdza kvyatiepeniu seku DNA medzi ur itm VH gnom aprestavanm DJH segmentom. Pokia> je vsledkom atiepenia produktvny VHDJH gn,

i~e je pod>a neho mo~n vytvorie funk n ea~k reeazec, tak proces preskupovania na druhej alele IGH je zastaven, dochdza ktzv. alelovej exklzii. Dsledkom prestavby je to, ~e promtor asociovan sVH gnom sa dostane bli~aie kenhacru (zosilHova  transkripcie, je medzi JH CH) anovozostaven gn sa stva transkrip ne aktvnym. Preto~e kJH segmentom je najbli~aie m germinlny C segment (Cm), tak najprv vznikaj IgM protiltky. IgD protiltky m~u vznikae neskr vdsledku rozdielneho splicingu.

Tvorba m reeazcov je charakteristick pre pre-B lymfocyt. Tento sa vaak eate nem~e sprovae s>ahkm (L) reeazcom, preto~e ten eate nie je vytvoren. Namiesto toho asociuje snhradnm L reeazcom (yL), ktor je tvoren protenmi VpreB al5. Tento komplex asociuje eate sdimrom signlnych protenov CD79a aCD79b) atakto sa ako pre-BCR objavuje na povrchu B lymfocytu. Toto je pre bunku signlom kza atiu preskupovania gnov pre L reeazce26. Variabiln oblasti kal reeazcov (L reeazce) s tvoren somatickmi rekombinciami V(Vk aVl) aJ segmentov (Jk aJl). Rekombincia prebieha obdobne kmechanizmu rekombincie ea~kch reeazcov, za na najprv vlokuse Igk  znovu dochdza ktakmer nhodnmu vberu Vk a Jk, kur eniu miesta atiepenia s znovu vyu~van sekven ne konzervovan heptamry anonamry, katiepeniu dochdza len medzi jedno advoj zvitovm signlom, atepen reeazce s znovu spojen novo syntetizovanm reeazcom N. Pokia> rekombincia na IGk nevedie kspeanej prestavbe (sekvencia pre funk n proten), tak dochdza krekombincii na IGl. Vprpade speanej kombincie VJ sa znovu zastavuje rekombincia na druhej alele (alelick exklzia), vopa nom prpade B lymfocyt hynie. Tvorbou plnohodnotnho IgM sa bunka stva zrelm B lymfocytom. Zrel B lymfocyt sa pri styku santignom na folikulrnych DC vlymfoidnch folikuloch aktivuje azroveH dochdza krozvoji intenzvnych somatickch mutci Vsegmentov preskupench gnov pre protiltky. Dle~it lohu vtomto procese m enzm AID (aktivciou indukovan cytidn deaminza). Tento proces alej zvyauje variabilitu imunoglobulnov, selektovan s mutanti snajvyaaou afinitou kantignu26.

2.4.3.2 Isotypov prieamyk  terminlna diferencicia B lymfocytu Po rozpoznan antignu na povrchu B lymfocytu prostrednctvom TCR orovnakej apecifickosti ako m BCR aza spoluprce alach kostimula nch signlov (vi vyaaie) za na T lymfocyt mimo in sekrtovae IL-4. Ten sa via~e na IL-4 receptor na povrchu B lymfocytu, dochdza kjeho aktivcii apredaniu signlu na STAT6, ktor tento signl prenaa do bunkovho jadra. Vjadre sa via~e do promtorovch oblast IL-4 responzibilnch gnov. Vprpade interakcie T aB lymfocytov po styku so apecifickm antignom (alergnom) sa STAT6 via~e do promtorovej oblasti Ce oblasti IGH lokusu. IGH lokus obsahuje nieko>ko gnov pre vaetky konatantn podjednotky H reeazcov (obr.3) Ka~d ztchto gnov m Iexn vpromtorovej oblasti, za ktorm nasleduje apecifick intrnov Soblase obsahujca repetitvne sekvencie, ktor s dle~it pre izotypov prepnutie. Vnimkou je Cm, ktor nem Soblase. Ako posledn potom nasleduj exny kdujce vlastn konatantn

ase H reeazca. Gn pre Ce typ protiltok obsahuje Ie exn, intrnov Se oblase, alej 4 Ce exny (kdujce cel oblase ea~kch reeazcov IgE) aeate event. 2 exny M pre transmembrnov domnu IgE (v prpade nesekrtovanej formy IgE). Promtorova oblase Ce obsahuje mimo vzbov miesto pre STAT6 imiesta pre alaie transkrip n faktory: 2 pre NFkB, alej pre BSAP (PAX5),C/EBP aPU.127. Pre sprvnu adostato n mieru expresie je nutn iinterakcia skomplexom CBP/p300 asNCoA28. Na zklade tejto signalizcie dochdza ktvorbe e germinlneho transkriptu (e-GLT) a to z miesta promtora. Zprimrneho transkriptu je vystrihnut Se oblase, tak~e e-GLT obsahuje Ie aexny Ce1-4 am ve>kose 1,7 kb29. Tento e-GLT sa vaak ozna uje ako steriln, preto~e vaetky mo~n

tacie rmce vIe obsahuj stop kodny ateda jeho translciou nedochdza ktvorbe IgE24,29.  Obr.4 IgE izotypov preskok (prieamyk)

Vhornej

asti obrzku je znzornen lokus pre ea~k reeazce imunoglobulnov, pri indukcii izotypovho preskoku (IL-4 aCD40 signalizcia) dochdza kpribl~eniu sekven ne apecifickch miest pre rekombinciu (oblase gnov pre konatantn reeazce) pred Cm (Sm) lokusom apred Ce (Se) lokusom, pri om DNA medzi tmito miestami sa vystrihne. Vsledkom (doln

ase obrzku) je vznik cirkulrneho fragmentu (ten sa degraduje) arekombinovanho miesta Sm/e, za ktorm nasleduje Ce lokus, apri transkripcii sa potom bud tvorie u~ reeazce pre IgE.

Pre izotypov prieamyk je dle~it, aby Ie aSe ostali intaktn. alej nedvne atdie poukzali na vznam samotnho Se po jeho vyatiepen z e-GLT mRNA pri splicingu. Zistilo sa toti~, ~e vo vaeobecnosti sa takto S  regin obsahujca RNA hybridizuje na komplementrnu genmov DNA, tvor DNA-RNA hybrid atoto vedie kvytvoreniu stabilnej  R slu ky  DNA-RNA hybrid je spolu aproti>ahl reeazec je vo forme ssDNA. Tieto R slu ky s nchyln katiepeniu DNA prostrednctvom exczne repara nch endonuklez XPF-ERCC1 aXPG. Vsledkom je potom vskyt zlomov na dsDNA atieto vlkna m~u bye navzjom spojen. Tento mechanizmus m~e prestavovae indukciu izotypovho prepnutia27. Samotn izotypov prieamyk sa ale uskuto n a~ na zklade druhho signlu, ktorm je signalizcia cez aktivovan CD40 (Obr.4). Toto vedie knasmerovaniu AID do oblasti Ce lokusu. Se oblase je bohat na cytozn a AID tu spsobuje deaminciu cytoznov na uracily. Tieto s nasledovne substrtom pre uracil-DNA-glykozylzu (UNG), ktor vytvra potom zlomy jednho vlkna DNA, tzv. nicky. Vysok hustota takchto zlomov m~e viese k dvojvlknovm zlomom vDNA indukovanch endonuklezou. Oba tieto enzmy maj ve>mi dle~it lohu pri izotypovom prieamyku, nako>ko ich deficit je spojen autozomlne recesvnym typu hyperIgM syndrmu uktorho postihnut osoby produkuj vysok hladiny IgM protiltok, no nie s schopn prepne na tvorbu protiltky inej triedy19,30,31.

2.5 `truktra IgE asignalizcia pomocou IgE Protiltky triedy IgE boli objaven ako posledn, dlho po objaven ostatnch imunoglobulnovch izotried a atruktrne s podobn ostatnm protiltkam. S zlo~en zdvoch >ahkch (L) advoch ea~kch (H) e reeazcov, vytvra sa teda tetramr. H reeazce obsahuj 5 domn - N terminlne jedna variabiln aalej 4 konatantn (kdovan exnmi Ce1-4). Vprpade membrnovo viazanej formy IgE je na C konci H reeazca eate jedna transmembrnov M domna. L reeazce s zlo~en zjednej variabilnej ajednej konatantnej domny. IgE sa via~u asignalizuj prostrednctvom dvoch odlianch receptorov  FceRI (vysoko afinitn receptor) aCD23 (FceRII, nzko afinitn IgE receptor). FceRI sa vyskytuje vdvoch formch: abg2 tetramr vyskytujci sa na povrchu ~rnych buniek abazofilov, alebo vo forme ag2 trimru prtomnho na mnohch alach bunkch. Za vzbu IgE je zodpovedn areeazec, dochdza k silnej aapecifickej interakcii so sekvenciami vCe2-3 oblasti H reeazcov. Pri fyziologickch hladinch IgE je FceRI nimi konatitutvne obsaden. b reeazec m dle~it amplifika n lohu pri signalizcii cez FceRI. Najv a vznam pri prenose signlu m ale g reeazec. Oba reeazce b ag maj vo svojej vntrobunkovej

asti prtomn sekvencie zvan tyroznom aktivovan imunoreceptorov motvy (ITAM, immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) aprve tieto s fosforylovan receptorovmi tyroznkinzami19.

 Obr. 5 `truktra asignalizcia cez FceRI

FceRI (vysoko afinitn receptor pre IgE) je zlo~en za, b a2 g podjednotiek. Vprpade vzby IgE spolyvalentnm alergnom, ktor je schopn s asne sa viazae na viac IgE, dochdza kmultimerizcii tchto receptorov, kich aktivcii aprenosu signlu na signlny komplex Gads/LAT/SLP-76. Tento aktivuje nasledovne nieko>ko alach intracelulrnych signaliza nch drh. S aseou komplexu je ifosfolipza Cg, ktor atiepi membrnov fosfo-inozitol-bifosft (PIP2) na inozitol-1, 4, 5 trifosft (IP3) adiacylglycerol (DAG).

IgE sa teda via~u na svoj vysoko afinitn receptor. Po kontakte spolyvalentnm alergnom dochdza kagregcii FceRI,

o je signlom pre degranulciu mastocytov abazofilov, zroveH dochdza i kistej novotvorbe alach ltok podporujcich zpalov reakciu (Obr.5). Po agregcii FceRI na povrchu bunky dochdza kfosforylcii ITAM, ktor je mediovan pomocou lyn tyrozn kinzy zrodiny src. Na fosforylovan ITAM sa nasledovne via~e syk (SH2 domnu obsahujca tyrozn kinza) atto potom prostrednctvom forforylcie molekl LAT, Gads aSLP-76 vedie kzostaveniu signlneho komplexu. S aseou tohto komplexu je ifosfolipza-Cg (PLCg), ktor hydrolyzuje fosfatidylinositol 4,5-bisfosfont na inozitol 1,4,5-trifosft (IP3) adiacylglycerol (DAG). IP3 nsledne indukuje uvo>nenie kalciovch inov zendoplazmatickho retikula. Elevcia intracelulrneho kalcia je potom ve>mi dle~itm pokynom kdegranulcii mastocytov. DAG azvaen hladina kalcia aktivuje zroveH iproten kinzu C, ktor spaea signalizciu potrebn pre gnov aktivciu vmastocytoch. Degranulciu agnov expresiu tie~ reguluj i alaie signlne drhy simultnne aktivovan agregciou FceRI (napr. SAPK aWASP drhy)19.

CD23 patr do rodiny lektnov typu C a m pri porovnan s FceRI plne in atruktru ifunkciu. Vdsledku alternatvneho zostrihu sa vyskytuje vdvoch formch: CD23a na povrchu B buniek aCF23b na povrchu T lymfocytov a mnohch alach buniek. Taktie~ sa m~e vyskytovae ivsekrtovanej podobe. CD23 je vo forme trimru, sdlhou, nadmerne glykozylovanou, extracelulrnou stopkou vykazujcou atruktrny motv  zapletenej cievky (coiled coil structure), ktor je zakon en tromi domnami tvaru hlavi ky  tieto via~u IgE (Obr. 6). Expresia CD23 je taktie~ ovplyvHovan hladinou IgE anaviazan IgE chrni CD23 pred jeho degradciou. CD23 vykazuje v aie mno~stvo funkci  napr. na povrchu B lymfocytov sa zd, ~e m~e suprimovae tvorbu IgE. alej m~e asistovae pri prostrednctvom IgE u>ah enej prezentcii antignu (sprostredkovva vychytvanie komplexu alergn/IgE B bunkou). Vneposlednej rade m~e mediovae itranscytzu potravinovch alergnov vzh>adom ktomu, ~e je exprimovan ina luminlnej strane

revnho epitelu19.

 Obr.6 `truktra nzko afinitnho receptora pre IgE FceRII (CD23).

CD23 je trimrom  monomr m tvar zvitnice ukon enej globulrnou hlavi kou. Cel receptor je vytvoren vzjomnm zapletenm sa zvitnicovch

ast monomrov. Hlavi ky potom vytvraj vzbov miesto pre IgE. Solubiln forma CD23 je tvoren odatiepenm globulrnej hlavi ky zreceptorovej atruktry. Pokia> je na receptor naviazan IgE, tak kjeho tiepeniu nedochdza (prevzat z Oettgen H a Broide DH19).

2.6 Fzy alergickej reakcie

2.6.1 Fza senzibilizcie Pri prvom stretnut salergnom prebieha indukcia odpovede imunitnho systmu pomocou veobecnch mechanizmov, po rozpoznan alergnu prostrednctvom APC dochdza krozvoju apecifickej T bunkovej odpovede. Ako u~ bolo spomenut, naj astejaie dochdza ksenzibilizcii na slizniciach. Alergn nimi prenik avmukznej

i submukznej vrstve dochdza ku kontaktu sAPC, poprpade dochdza kjeho zaneseniu do lymfatickch uzln. Prezentciou antignu na povrchu APC dochdza potom kindukcii tvorby Th1 alebo Th2 lymfocytov  od toho potom zvis ityp alergickej reakcie. Th2 lymfocyty indukuj tvorbu IgE, tie sa via~u na prsluan receptory atakto  vyzbrojuj hlavne mastocyty kuskuto neniu reakcie pri opakovanom styku salergnom. Th1 lymfocyty sa uplatHuj pri kontaktnej alergii (napr. ea~k kovy). Samotn fza senzibilizcie prebieha vskrytosti, bez klinickch prejavov, a~ pri opakovanou styku salergnom dochdza krozvoji vlastnej alergickej reakcie1.

2.6.2 V asn aoneskor fza alergickej reakcie Vprpade reakcie I. typu, polyvalentn alergn agreguje receptory pre IgE (FceRI) adochdza kokam~itmu vyplaveniu nachystanch granl zo ~rnych buniek. Tieto granule obsahuj ltky ovplyvHujce alergick reakciu, tzv. primrne meditory. Medzi ne patria hlavne heparn,histamn, serotonn a chemotaktick faktory pre eozinofily a neutrofily. ZroveH za na ide novo tvorba primrnych meditorov. Vo svojej podstate tto reakcia tkaniv nepoakodzuje priamo,uvo>nen ltky ved kvazodilatcii, bronchokonstrikcii, sekrcii hlienu astimulcii nervovch zakon en vko~i. Na v asn fzu plynule nadvzuje oneskoren fza, naplno sa prejav a~ po nieko>kch hodinch. Za naj sa tvorie sekundrne meditory reakcie (hlavne metabolitov kyseliny arachidnovej), ktor maj prozpalov vplyv ado miesta reakcie prieahuj eozinofily, trombocyty, neutrofily ilymfocyty. Tieto umocHuj alergick reakciu, pri om vpostihnutom tkanive u~ m~e dochdzae ikireverzibilnm zmenm. Tieto popsan mechanizmy platia len pre reakciu s aseou Th2 lymfocytov aIgE. Pri preferencii reakcii sTh1 bunkami, sa tto rozvja omnoho neskr, a~ po nieko>kch dHoch, uplatHuje sa reakcia IV. typu. Samotn alergick reakcia m~e prejse do chronickho atdia, ktor u~ nie je zvisl od primrnej pr iny vzniku alergickej reakcie1.

2.7 Alergick choroby Alergick reakcia sa na klinickej rovni prejavuje ako niektor zalergickch ochoren ato samostatne alebo vkombincii. Alergickm procesom s naj astejaie postihnut sliznice ako~a apod>a tohto m~eme potom rozliaovae ijednotliv ochorenia. Medzi choroby so symptomatolgiou zameranou na ko~u sa radia atopick ekzm, ~ih>avka (urtikria) akontaktn dermatitda. Postihnutie sliznc respira nho traktu sa manifestuje ako polinza (alergick ndcha), chronick celoro n ndcha abronchilna astma. Postihnutie sliznc spojivky sa prejavuje ako alergick konjunktivitda. Postihnut m~u bye isliznice gastrointestinlneho traktu. Potravinov alergie maj rzne prznaky, ktor sa m~u vzjomne kombinovae  napr. pri alergii na bielkovinu kravskho mlieka sa vyskytuj za~vacie problmy (zvracanie, hna ky, bolesti brucha, krv ahlien vstolici) sko~nmi arespira nmi problmami.

2.7.1 Vskyt alergi Je znmym faktom, ~e za poslednch nieko>ko desaero  doalo celosvetovo kdramatickmu nrastu vprevalencii alergi32-36. Napr. Jarvis aspol.32 uviedli, ~e vroku 1998 vo Ve>kej Britnii dochdzalo kzvyaovaniu prevalencie astmy alebo symptmov silne poukazujcich na astmu udet o5% za rok apodobn trend bolo mo~n pozorovae napr. iv`vdsku, `vaj iarsku, Nrsku, USA, Austrlii ana Novom Zlande.  Obr.7: Vskyt alergickch chorb aastmy udet za roky 1996, 2001 a2006 v R. Zprezentovan dta demonatruj dvojnsobn nrast vprevalencii alergickch chorb vpriebehu 10 rokov. Uvdzan hodnota vpercentch predstavuje kumulatvnu prevalenciu (prevzat zinformcii SZ37). Situcia v eskej Republike je obdobn, alergie s

astejaie hlavne udet. Pod>a prieskumu `ttneho zdravotnckeho stavu doalo vobdob rokov 1996  2006 temer kzdvojnsobeniu alergickch ochoren isamotnej astmy vdetskej populcii (obr.7) atento trend je vidiee ivjednotlivch vekovch kategrich37,38. Medzi naj astejaie prejavy alergie udet v R patr rhinokonjunktivitda38 anajv a vskyt medzi alergickmi chorobami maj pe>ov polinza (13% det) aatopick ekzm (12 % det, obr.8.). Ako naj astejaie alergny boli zisten pele travn (34% alergikov), alaie rastlinn alergny (pe> brezy aburn), arozto e38. Vskyt alergickch ochoren je zvisl na veku, preto bolo pozorovan, ~e vnajmladach vekovch kategrich sa vyskytuje najviac atopick ekzm, no ustarach det sa vyskytuje hlavne pe>ov polinza (obr.9).

Vzh>adom na tento vrazn nrast vprevalencii alergi sa hovor oepidmii alergickch ochoren. Ktejto zmene doalo ale vrelatvne krtkom obdob apreto je nepravdepodobn aby vpriebehu 1 genercie doalo ktak vraznej zmene vgenetickej vbave populcie, ktor by bola vysvetlenm takhoto nrastu. Preto~e samotn alergick choroby maj multifaktorilnu etiolgiu, tak vysvetlenm tejto dramatickej zmeny mus bye zvraznenie vplyvov vonkajaieho prostredia  zmeny ~ivotnho prostredia (smog, vyaaie mno~stvo polutantov apod.), zmena ~ivotnho atlu populcie, nesprvne stravovacie nvyky, ale ihypotza hygienickej terie. Tto sa d pou~ie kvysvetleniu napr. imenaieho rizika alergickej senzibilizcie

i vskytu alergickho ochorenia pre deti sv am po tom srodencov oproti jedincom smaximlne jednm srodencom  srodenci sa navzjom reinfikuj rznymi komunitnmi infekciami,

o potom stimuluje sprvnu polarizciu vvoja imunitnho systmu39,40.

 Obr. 8: Vskyt alergickch ochoren udet v R vroku 2006.

Na obrzku je znzornen vskyt ka~dho ochorenia celkovo aizvlae pre chlapcov azvlae pre diev at. Chlapci s znzornen lila farbou, diev at oran~ovou aobe pohlavia dokopy zelenou farbou (prevzat zinformcii SZ37).

 Obr.9: Vskyt alergickch ochoren pod>a veku udet v R vroku 2006.

Vskyt celkov apre jednotliv alergick ochorenia je na obrzku znzornen v4 vekovch katergrich  5, 9, 13 a17 rokov (prevzat zinformcii SZ37).

2.7.2 Asthma bronchiale

2.7.2.1 Vskyt Astma bronchiale predstavuje naj astejaiu neinfek n chorobu a v R postihuje 8 % populcie, pri om je

astejaie udet sodhadovanou prevalenciou 12-15 %41. Vzahrani  sa m~e tto choroba vyskytne iuviac ne~ 20 % populcie42 apod>a odhadov je celosvetov odhad vskytu astmy upribli~ne 300 milinov osb43. Astma sa

astejaie vyskytuje uchlapcov ne~ udiev at,

o sa vysvet>uje menam priemerom prieduaiek azvaenm tonusom umalch chlapcov. Okolo puberty sa za na vskyt uoboch pohlav vyrovnvae avdospelosti je astma skr

astejaia naopak u~ien.

2.7.2.2 Etiopatogenza astmy Astma je definovan ako chronick zpalov ochorenie dchacch ciest, na ktorom sa z astHuje mno~stvo buniek abunkovch produktov,pri om hladk svalstvo dchacch ciest abnormlne reaguje na vonkajaie podnety a podstupuje prehnan kontrakciu(bronchilnu hyperreaktivitu - BHR). Utohto ochorenia preva~uje bu chronick eozinofiln alebo neutrofiln zpal vdchacch cestch. Po kontakte dchacch ciest salergnom dochdza kalergickej reakcii, vdvoch fzach. V asn fza sa prejavuje za 10  30 min. po expozcii avjej priebehu s najdle~itejaie histamn aleukotriny  klinicky dochdza kopuchu, tvorbe hlienu akontrakcii hladkch svalov. ZroveH s do miesta zpalu atrahovan neurofily aeozinofily. Podnetom pre tvorbu eozinofilov je hlavne IL-5 produkovan Th2 bunkami. Voneskorenej fzy (za 4  8 hodn) dochdza vdsledku zmenenej permeability ciev kprestupu eozinofilov, lymfocytov a iasto ne ineutrofilov do perivaskulrnych priestorov, kde pokra uje zpal azvrazHuj sa jeho symptmy. Upacientov potom m~eme preukzae BHR44. alej dochdza kinfiltrcii epitelu asubmukzy iT lymfocytmi, mastocytmi abazofilmi. Samotn proces postupne prechdza do chronickosti, kedy u~ Th2 reakcie nemaj na alej prebiehajcich zmench vrazn vplyv1. Biopsie umladch osb poukzali na to, ~e eozinofily prtomn vbronchoalveolrnej lav~i s spojen svyaam rizikom perzistencie choroby, no zva~nejaie formy choroby s zvisl od prtomnosti neutrofilov ato udet idospelch45. Ike pre astma s dle~it alergick reakcia achronick zpal, tak vcentre diania s dchacie cesty. Poakodenie povrchovho epitelu dchacch ciest indukuje procesy, ktor toto pokodenie reparuj ad integrum, snormlnym pomerom pohrikovch avlskovch buniek. Mimo in dochdza ikaktivcii fibroblastov diferencujcich sa na myofibroblasty sekrtujce proteny extracelulrneho matrixu ameditory podporujce zpal. Pri pretrvvajcom strese, poakodzovan epitelu (napr. ivdsledku enzymatickej aktivity alergnov) sa repara n proces zvrazHuje adochdza kskvamznej metaplzii a/alebo hyperplzii pohrikovch buniek. Vchronickom atdiu astmy je u~ ale repara n proces utlmovan. Astmatick dchacie cesty s nsledne po poakoden opravovan pomalaie aneefektvne, je poruaen jemn rovnovha tvorby/degradcie extracelulrneho matrixu,

o vedie kzosilneniu zpalu aprestavbe dchacch ciest. Remodelcia dchacch ciest je tak charakterizovan metaplziou sliznice, zhrubnutm mezenchmu ahyperplziou hladkho svalstva adrobnch ciev46,47. Centrlne postavenie Th2 mediovanch procesov vmechanizme vzniku apriebehu astmy vaak nie je schopn vysvetlie vaetky pochody prebiehajce pri astme. Holgate akol.48 preto navrhli in hypotzu ado centra zujmu vetiopatogenze astmy postavili epitelovo  mezenchmov trofick jednotku (EMTU, zanglickho epithelial mesenchymal trophic unit, obr. 10). EMTU m svoje dle~it postavenie vo vetviacej morfogenze ( branching morphogenesis ) vpriebehu vvoja fetlnych p>c49. Opakovan inzulty vterne zvaenej nchylnosti epitelu apred:~enej opravy sve>kou pravdepodobnoseou smeruj kstavu chronickej rany,

o vedie kprolifercii mezenchmovch buniek, zhrubnutiu dchacch ciest aBHR. Pre dle~it postavenie EMTU vpatogenze astmy sved  aj to, ~e 6 zo 7 kandidtnych gnov pre astmu abronchilnu hyperreaktivitu je exprimovanch prve v EMTU. Kzostaveniu tejto hypotzy viedli hlavne tieto poznatky50: zmeny prebiehajce vdchacch cestch u astmy (ich prestavba - remodelcia) s obmedzen

isto len na oblase mimo alveolo-kapilrnej membrny, ato inapriek prestupu zpalovch buniek do alveolov aperibronchilnych priestorov v ainu porch vdchacch cestch pri astme je mo~n pripsae na vrub BHR, kedy dochdza ku kontrakcii svalstva prlia

asto ajednoducho ato vreakcii na rzne vntorn ivonkajaie faktory existuj faktory odlian od alergnov, ktor s dle~it nielen vplnch za iatkoch choroby, ale hraj vznamn lohu aj pri jej zva~nosti aprogresii.

2.7.2.3 Symptmy astmy Medzi typick prejavy astmy patr hvzdav dchanie (pskav zvuk pri vdychu), pocit dychovej nedostato nosti, pocit tiesne na hrudi a kaae>, hlavne vnoci. Pri fyziklnom vyaetren m~u bye prtomn distan n fenomny, auskulta ne spastick fenomny, vea~kch stavoch m~e bye naopak zase a~ oslabenie dchacch zvukov.

Vdiagnostike astmy m alej vznamn postavenie funk n p>cne vyaetrenie (spirometria, poprpade celotelov pletysmografie) sbronchoprovoka nm testom k evaluciiBHR. K vyhodnoteniu aktulnej zpalovej aktivity sl~i vyaetrenie srovho ECP (eozinifiln katinick proten  informuje oaktivite choroby) avydychovanho NO. Vyaaie uveden vyaetrenia sl~ia taktie~ kmonitorovan priebehu choroby aspeanosti terapie. Vpichov ko~n test avyaetrenie apecifickch IgE vsru sl~i kodhaleniu alergnov, ktor sa uvyaetrovanej osoby m~u spolupodie>ae na alergickej reakcii.

 Obr. 10  Patolgia dchacch ciest pri astme. Vcentre pozornosti stoj EMTU, kedy pri reparcii poakodench dchacch ciest je najdle~itejaia spoluprca epitelu amesenchymu. Poakodenie vyv~enej rovnovhy tejto spoluprce m~e viese kprestavbe dchacch ciest, zmno~eniu hladkho svalstva, rozvoj BHR. Vznam senzibilizcie alergnom tmto modelom nie je potla en do zadia, dop:Ha len celkov mozaiku etiopatogenzy vzniku apriebehu astmy  na predisponovan dchacie cesty nasad alergick reakcia svznamnou spoluprcou alach environmentlnych faktorov (prevzat a upraven pod>a Holgate a spol.50) 2.7.2.4 Klasifikcia astmy Astma m~eme delie pod>a nieko>kch kritri ato pod>a klinickho priebehu, alej ivzh>adom na vek (fenotypy udet do 5 rokov), pod>a vyvolvajcej pr iny avneposlednom rade ipod>a terapeutickej speanosti. 1. astma pod>a zva~nosti41: intermitentn  stupeH 1 >ahk perzistujca  stupeH 2 stredne ea~k perzistujca  stupeH 3 ea~k perzistujca  stupeH 4

2. astma udet do 5 rokov44: prechodn pskav dchanie doj iat abatoliat do 3 rokov veku perzistujce hvzdanie sv asnm za iatkom do 3 rokov veku bez znmok aprejavov atopie neskor nstup pskania det satopiou aalergiou asalergiou vrodine, pri om toto perzistuje do dospelosti

3. astma alergick anealergick.

4. Astma pod>a rovne kontroly41: astma pod kontrolou  pacient je bez ea~kost, alebo sa tieto vyskytuj len ojedinelo as mierne astma pod

iasto nou kontrolou  definovan po tom typickch respira nch symptmov vpriebehu t~dHa astma pod nedostato nou kontrolou

Klinick varianty astmy41: no n astma - predstavuje zva~nejaiu znmky zhoraenej kontroly astmy seznna astma  svis svskytom seznnych alergnov astma indukovan nmahou  je znmkou neplnej kontroly na astmou. Dochdza knej za 6-10 mint od za iatku fyzickej zea~e alebo do 10-15 mint po jej ukon en. ea~ko lie ite>n astma  vyskytuje sa asi u5% astmatikov, m nieko>ko podtypov, patria sem i: premenatrua n astma  u30-40% astmati iek, nieko>ko dn pred menatruciou

i vjej priebehu aspirnom indukovan astma  asi u10% astmatikov. Typicky sa vyskytuje medzi 30.  40. rokom veku. Pri kombincii alergie na salicylt, astmy aperzistujceho zpalu paranazlnych dutn snosnmi polypmi hovorme oaspirnovej trias.

kaae> ako ekvivalent astmy astma seniorov  vznik v ainou a~ po 65 rokoch veku aje

asto poddiagnostikovan profesionlna astma  vznik vdsledku opakovanej expozcii faktorom pracovnho prostredia41.

2.7.2.5 Lie ba astmy Terapia astmy zoh>adHuje etiopatogenzu isymptmy pacienta, pri om logickm primrnym cie>om je dostae

o mo~no najrchlejaie chorobu pod kontrolu a udr~iavae ju vtomto stave, kedy pacient nem ~iadne alebo len minimlne problmy. Tento cie> napomha zlepaovae kvalitu ~ivota pacienta, zni~uje celkovo vskyt i socio-ekonomick dopad lie by vraznch exacerbci astmy ataktie~ zni~uje riziko rozvoja zmien vdchacch cestch vedcich kich remodelcii. pln potla enie tchto zmien nie je mo~n, vzh>adom na to, ~e vpatogenze je vposlednej dobe uznvan teria dysfunkcie EMTU upredisponovanch jedincov aist po iato n zmeny vdchacch cestch boli pozorovan dlho pred vznikom symptomatolgie u~ iv relatvne v asnom doj enskom veku45. Dle~it je ale dodr~iavae udr~iavaciu lie bu ato aj napriek tomu, ~e pacienti ( asto deti ale iich rodi ia) maj pocit, ~e u~ nie je potrebn  len trval kontrola astmy zabezpe uje minimlne riziko zva~nch astmatickch stavov arozvoja ea~kch zmien dchacch ciest. Tto terapia vaak nemus bye celo~ivotn, pri dlhodobej kompenzcii ochorenia m~e bye lie ba ukon en. Vlie be sa uplatHuje nefarmakologick ifarmakologick prstup. Nefarmakologick postupy (re~imov opatrenia) sa zameriavaj na obmedzenie expozcie vyvolvajcimi faktormi apredstavuje vpodstate sekundrnu prevenciu. Mimo dsledn vyhbanie sa pr innmu alergnu sem patr ivyhbanie sa expozcii cigaretovmu dymu. Farmakologick prstup je zalo~en na podvan u>avujcich liekov (aktne prznaky, lie ba exacerbci  sl~ia kbronchodilatcii) avpodvan kontrolujcich antiastmatk, ktor je nutn podvae od 2. stupHa (>ahk perzistujca astma) ato ivbezprznakovom obdob41. U>avujce antiastmatik41: inhala n b2-agonisti srchlym nstupom inku, psobia do 3 mint aich inok pretrvva 4 hodiny. Do tejto skupiny patr napr. salbutamol. inhala n anticholnergik skrtkodobm inkom snstupom do 8 mint, s inkom na 4-6 hodn. Zstupcom je ipratropium. inhala n kombincie predchdzajcich skupn p.o. b2-agonisti systmov kortikosteroidy  ur en pre krtkodob podanie 10 -14 dn maximlne, apotom ich mo~no hne vysadie

Kontrolujce antiastmatick lieky41: inhala n kortikosteroidy (IKS), napr. budezonid, flutikazn apod.  pou~vaj sa samostatne alebo od stredne ea~kej astmy vo fixnej kombincii inhala n b2-mimetik sdlhodobm inkom (LABA) s inkom nastupujcim do 3 mint, pri om tento trv 12 hodn. Zstupcom je napr. formoterol. fixn kombincie  kombincia IKS + LABA, napr. budesonid/formoterol medzi alaie skupiny patria leukotrinov modifiktory (napr. montelukast), methylxantny spred:~enm inkom, systmov kortikosteroidy abiologick lie ba (rekombinantn >udsk anti IgE protiltka).

2.7.3 Atopick ekzm Atopick ekzm (AE) je v ainou chronick ochorenie ko~e, vrazne svrbiv, s astm rodinnm vskytom alergickej rhinokonjuktivitdy, astmy aatopickch chorb51. AE sa vyskytuje hlavne detstve, najviac vdoj enskom adetskom veku  60% postihnutch m prv vsev AE vprvom roku ~ivota a85% sa manifestuje do 5 rokov veku. m skr saAE vyskytne, tak tm je v aia aanca toho, ~e iskr odznie aasi u 75% pacientov djde kregresii AE do puberty, alebo maj len mierne symptmy. Do 20 rokov ~ivota v ainou postupne vymizne. Perzistencia dodospelosti je mlo

ast am potom tendenciu zmizne po 40.  50. roku ~ivota. Osoby sAE maj riziko vskytu hlavne astmy (30-50 % vpredakolskom veku) aalergickej ndchy. UAE rozoznvame tieto formy: doj ensk forma  za na obvykle v2.  6. mesiaci veku na tvri, neskr ivo vlasoch apostupne prechdza na cel hlavu, krk, trup ikon atiny. Vobdob, ke dieea za na lieze, tak sa vyskytuje hlavne na miestach snajv am trenm. Do 2 rokov spontnne regreduje, alebo pokra uje. detsk forma - udoj iat, predakolkov asakolkov. Presva sa do predilek nch oblast (flexry) anem u~ exsudatvny charakter.

forma dospievajcich adospelch  vznik samostatne alebo ako pokra ovanie predchdzajcich foriem, je vpredilek nch oblastiach, vraznejaie ale hlavne vsolrnej predilekcii ana rukch. Terapia vdetstve zahUHa pravu ~ivotosprvy, je dle~it edukcia aadaptcia celej rodiny. Lie ba je komplexn, kedy extern sa doplHuj systmovou terapiou. Je ve>mi dle~it starostlivose oko~u, pravideln mastenie a aplikcia loklnych kortikosteroidov. Sekundrna infekcia nasadajca do ternu AE je lie en antibiotikami prpadne antimykotikami. Zcelkovej terapie sa vyu~vaj antihistaminik (ovplyvHuj i svrbenie), vprpade ea~kch foriem isystmov kortikoidy. Uzva~nejach foriem sa uplatHuje ifototerapia. Ve>mi dle~it je iprevencia, kedy je nutn sa vyhbae potencilnym

i zistenm iritujcim ltkam (potraviny, pracie praky apod.)51.

2.7.4 alaie alergick ochorenia Alergick ndcha (polinza) je charakteristick zpalom sliznice nosa, ktor sa prejavuje jej prekrvenm, opuchom, produkciou sop>a, kchanm,svrbenm nosu apocitom ea~kost s dchanm. Polinza je spsoben hlavne reakciou na senzibilizujci alergn, m~e mae ale iceloro n formu, ktor postupne vchronickej fzy je u~ len mlo zvisl od vyvolvajceho alergnu. Vterapii sa sna~me ovyhbaniu sa kontaktu salergnom, podvaj sa antihistaminik a loklne kortikoidy51,52. Alergiou m~u bye postihnut io i, spolinzou

asto svis vskyt alergickej konjunktivitdy  alergn rozpusten vslzch reaguje sIgE na spojovkch. Kreakcii ved naj astejaie pe>ov alergny. Vterapii sa vyu~vaj znovu systmov alebo loklne antihistaminik.alej je mo~n pou~ie loklne kromony apri ea~kch formch iloklne kortikosteroidy51.

Medzi alaie alergick choroby patria urtikria, alergick exantmy, potravinov alergie areakcie na lieky. Prejavuj sa kombinciou ko~nch aslizni nch symptmov. Najzva~nejaou formou je anafylaxia, kedy alergn vyvol reakciu celho organizmu srizikom mrtia.

3. Genetika alergi

3.1 Dedi nose alergi Alergick ochorenia maj tendenciu sa vo zvaenej miere vyskytovae v rodinch atento fakt je vaeobecne uznvan. O rodinnom vskyte atopie vieme u~ zo starovekho Rma, kde prejavy atopickch ochoren boli popsan vJulinsko  Klaudinkej dynastii (cisr Augustus, jeho prasynovec Claudius aClaudiov syn Britannicus). Pravdepodobne prvm vliteratre dochovanm zznamom ovskyte astmy je popis jej familirneho vskytu vrode man~elky znmeho auznvanho lekra Daniela Sennerta zroku 1650. Sennert uvdza, ~e astma sa vyskytla ujeho svokra, alej udvoch man~elkinch bratov, ujej sestry audcry tejto sestry53. Odedi nosti astmy nepochyboval ani Salder vroku 18602, pri atdiu rodn svskytom astmy pozoroval rzne typy dedi nho prenosu akonatatoval, ~e prvostupHov prbuzn astmatikov boli v10% taktie~ postihnut tmto ochorenm. ZroveH konatatoval, ~e vrodinch sa m~e astma vyskytne unieko>kch srodencov bez toho, aby touto chorobou trpeli ich rodi ia. Vnasledujcej atdii 217 astmatikov pozoroval pozitvnu rodinn anamnzu astmy u39% postihnutch osb (citovan vref.54).

Oastma sa komplexne zaujmal itzv. otec astmy, vznamn americk lekr Robert Anderson Cook. Tento zujem bol uneho do ve>kej miery ur ite ovplyvnen itm, ~e ion sm bol astmatikom od 8 rokov. Vo svojich zpiskoch uvdza, ~e obdobie vpriebehu akolskho roka, ke bol mimo domov, bolo pre neho ve>kou >avou, preto~e nemal astmatick problmy. Przdniny ale predstavovali no n moru, nako>ko po nvrate domov zo akoly sa astma ihne ohlsila  pekne dokumentovan vzeah prostredia asenzibilizcie pacienta spredispozciou kalergickmu ochoreniu. Cook bol vznamnm mentorom celej plejdy vznamnch alergolgov po celom svete abol autorom viac ne~ 200 rznych publikci55. Prirodzene sa zaujmal aj odedi nose alergi aastmy, na zklade

oho boli publikovan 2 atdie vrokoch 1916 a192454,56. Vtchto vskumnch projektoch sledovali vskyt atopie vrodinch u 504 a462 osb a115 neatopickch kontrol, pri om rodinn anamnza vprvej atdii bola prtomn v48,4 %(ref.56) prpadov, vdruhej atdii v58,4 %(ref.54), no vprpade kontrol sa jednalo len o7% - tento anamnestick daj teda predstavoval riziko sOR = 19 (95% CI 9-39). Odhadovan rizika rekurencie atopie ur en na zklade vsledkov obidvoch atdi boli 69 % vprpade, ~e obaja rodi ia boli postihnut, alej 58 % vprpade vskytu je jednho zrodi ov akone ne len 2 % vprpade negatvnej rodinnej anamnzy atopie. Spsob dedi nosti najlepaie zapadal do obrazu autozomlne dominantnho typu spenetranciou 0,6 azroveH pozoroval v asneja vskyt choroby vprpade atopie oboch rodi ov. Monognovo dominantn model dedi nho prenosu ochorenia obhajovali iButcher aKeeler57. Wiener aspol.53 vo svojej prci zameranej na rodinn vskyt alergickch chorb pracovali taktie~ s monognovo zalo~enou teriou abimdovou distribciou ochorenia vzh>adom kveku. Vsledovanch rodinch nenaali jednozna n typ dedi nosti  bol pozorovan recesvny idominantn typ. Vysvetlenie bimdovho vskytu ochoren potom postavili na dominantnom modeli, vktorom homozygoti manifestovali ochorenie skr vporovnan sheterozygotmi vhypotetickom lokuse salelami H ah. Atkinson58 oproti tomu popisoval recesvny typ dedi nho prenosu. Richards aBalyeat59 zastvali zase kodominantn model. Schwartz vroku 195260 referoval ovskyte astmy aalergickch ochoren na skupine 191 astmatikov, pri om vskyt astmy alebo alergie bol vyaa uprvostupHovch prbuznch. Dedi n prenos bol

astejaie dominantn sinkompletnou penetranciou, pri om ale niektor rodiny vykazovali recesvny charakter dedi nosti. Tieto rozdiely vo vskyte uprbuznch pripisoval epistze aalej ako nevhodn vyhodnotil teriu Wienera aspol.53 oh>adne skoraieho vskytu choroby uhomozygotov.

Pri skman dedi nej podstaty ochorenia maj dle~it vznam iatdie dvoj iat. Tieto boli opakovane uskuto nen iv prpade alergickch ochoren apotvrdili vznam genetickej predispozcie vprocese rozvoja alergie3,4,61. Postupne vaak na zklade pribdajcej evidencie sa za ala vaeobecne uznvae teria omultifaktorlnej etiopatogenze alergickch chorb (s vnimkou niektorch ve>mi vzcnych monognovch chorb salergickou zlo~kou, ako napr. hyperIgE syndrm vdsledku mutci v STAT362,63), kedy dochdza kinterakcii faktorov vonkajaieho prostredia vterne geneticky predisponovanho jedinca vdsledku kombincie zmien vgnoch hlavne strednho inku.

Heritabilita samotnej astmy je 48  78% aheritabilita hladiny celkovch IgE je 47,3%64,65. Vbe~nej klinickej praxi, kedy sa kalkuluje smultifaktorilnym modelom dedi nosti alergi, sa pri genetickej konzultcii pre posdenie rizika optovnho vskytu alergie vrodine vyu~vaj tzv. rizik rekurencie. Je mo~n vyu~ie nasledovn rizik:

1. Riziko narodenia dieeaea salergickm ochorenm na zklade pozitvnej rodinnej anamnzy51: 30 % vprpade alergickej choroby ujednho srodenca, 40 % vprpade alergie ujednho zrodi ov, 50 % vprpade alergie oboch rodi ov, 70 % vprpade, ~e obaja rodi ia trpia rovnakm alergickm ochorenm.

2. Pravdepodobnose vskytu astmy pre dieea je uvdzan rzne:

A a) len na zklade vskytu choroby urodi ov66: 6 % pre dieea, ktorho rodi ia netrpia astmou, 20 % vprpade, ~e jeden zrodi ov je astmatik, 60 % vprpade vskytu astmy uoboch rodi ov.

b) alternatvne je mo~n vyu~ie iriziko (OR) na zklade vskytu astmy iualach prbuznch67: 2  4,3x vyaaie vprpade astmy jednho z rodi ov 3,2-12,1x vprpade ochorenia uoboch rodi ov 1,9  5,7x vyaaie vprpade astmy ujednho srodenca 2,5  5,8x vyaaie, pokia> sa astma vyskytuje urodi a alebo srodenca

3.2 Preh>ad genetickch atdi zameranch na vskyt astmy aatopie.

3.2.1 Vskytastmy aatopie vo vzeahu kHLA systmu Alergick ochorenia s spsoben patologickou odpoveou imunitnho systmu na vonkajaie podnety. Preto snaha odhalie gny zodpovedn za vznik atopie alebo astmy bola vprvom rade smerovan na HLA systm. U~ vroku 1977 Saito aspol.68 v atdii 30 rodn svskytom astmy aspoH ujednho

lena naali siln vzbu medzi piatimi lokusmi HLA-B ajednm lokusom pre fenotyp B buniek. Vatdii 62 pacientov spe>om indukovanou astmou apolinzou sa signifikantne

astejaie nachdzal HLA haplotyp A1 B8 pacientov ne~ ukontrol69. alaia atdia 57 osb z rodn svskytom astmy ujednho rodi a anajmenej ujednho zdet bola snejednozna nmi vsledkami, nako>ko nebola schopn definitvne potvrdie, ale ani vyvrtie vzbu HLA sastmou alebo hypotetickm lokusom pre astmu70. Autori upozorHovali na to, ~e tto atdia pracovala srelatvne malm sborom pacientov,

o mohlo skreslie vsledky. Nakai aspol.71 skmali taktie~ mal skupinu 23 japonskch astmatikov svysokou hladinou celkovch IgE asilno pozitvnymi ko~nmi testami proti americkm domcim rozto om (Dermatophagoides farinae). Vtejto skupine vaak nepozorovali signifikantne odlian distribciu HLA-A, -B a -DR antigny oproti zdravm kontrolm. Relatvne ve>k vzbov analzu 21 markrov, mimo in iHLA, vspojitosti shladinou celkovch IgE uskuto nili Meyers aspol.72 na 2 subpopulciach vUSA. Skmali 316 osb z5 mormnskych prbuznch vetv a204 Amiaov. Analza prenosu HLA neodpovedala ~iadnemu zo skmanch modelov dedi nosti pre hladinu IgE. Anavyae nebola ani zisten vzba ~iadneho zanalyzovanch markrov khladine celkovho IgE.

Analza 41 astmatikov so seznnou precitlivenoseou k ambrzii sneastmatickmi kontrolami provanmi na zklade podobnch hladn IgE odhalila signifikantne vyaaie zastpenie HLA-B5 ukontrolnej skupiny nonastmatikov73. Vkontrolnej skupine sa alej

astejaie vyskytovali alely HLA-B8 aA1, avaak tento rozdiel nebol signifikantn. I ke Blumenthal aspol.74 primrne taktie~ nezistili asociciu odpovede imunitnho systmu na ambrziov alergny sHLA systmom, vnasledujcej atdii 133 osb spozitvnou reakciou na antign Ra3 zistili vznamn pozitvnu reakciu uosb snzkou hladinou IgE anegatvnu asociciu uosb svysokou hladinou IgE75. Quiralte aspol.76 sa taktie~ zaoberali vzeahom pe>ovej alergie kHLA systmu, vybrali si vaak reaktivitu proti pe>u olivovnka u 146 osb so seznnou ndchou a / alebo astmou od aprla do jna, pri om ich celkov iapecifick IgE signifikantne korelovali sastmou. Vsbore tchto osb naali vznamn vzbu HLA-DR7 aDQ2 sreakciou proti Ole e 2 antignu aDR2(15) sreakciou proti Ole e 10 antignu. alaia pozitvna asocicia HLA-DR7 aDQ2 so apecifickmi IgE, tento krt proti Ole e 1 bola pozorovan u40 seznnych polinotikov (pri porovnan s179 zdravmi kontrolami)77.

Dotaznkov atdia uskuto nen Stephanom aspol.78 sa zamerala na vzeah HLA II molekl sregulciou imunitnej odpovede na senzibilizciu rozto mi. Pri analze kontrolnej skupiny bez apecifickch IgE (n = 20), skupiny senzibilizovanej inm alergnom (n = 22) askupine so apecifickmi IgE proti Der p 1 antignu nenaali ~iaden vznamn rozdiel vdistribcii HLA alel medzi skupinami sabez reakcie proti rozto om (antign Der p 1). Napriek tomuto vaak naali asociciou DRB- aDPB-haplotypov sanamnzou astmy, polinzy aatopie (definovan ako vskyt astmy a/alebo polinzy a/alebo ekzmu). Vprotiklade stm zase analza 102 atopickch a87 neatopickch astmatikov so 150 zdravmi kontrolami zroku 2000 zlyhala v snahe njse asociciu HLA Ialebo II satopickou / neatopickou astmou79.

Vaetky tieto vsledky poukzali na to, ~e HLA systm m ur it lohu pri vzniku alergi ato aj soh>adom na opakovan asociciu relevantnej oblasti na 6p svskytom alergickch chorb. Tto loha vaak nie je plne jasn avznam HLA by mohol bye skr vprocese vzniku apecifickej senzibilizcie na pe>ov alergny. Vposlednej dobe dochdza kur itej renesancii zujmu olohu HLA pri vzniku alergi. Nedvna v aia atdia chorvtskych detskch astmatikov sa zaoberala znovu asociciou HLA svskytom alergie80. Do vskumu bolo zaradench 143 atopickch astmatikov a163 neprbuznch zdravch kontrol, pri om sa zoh>adHovali celkov iapecifick IgE proti be~nm vzduanm alergnom. HLA-B8 antign bol signifikantne

astejaie prtomn uastmatikov, alej ivpodskupine pacientov selevovanou hladinou celkovch IgE ipecifickch IgE proti alergnom Der p, Der p + Dact g aAmb a. ZHLA II triedy vykzal pozitvnu asociciu sastmou aatopiou haplotyp HLA-DRB1*01, shladinou totlnych IgE nad 400 kU/l upacientov bol asociovan zase haplotyp HLA-DRB1*03. Naopak haplotyp HLA-DRB1*016 bol sastmou asociovan negatvne80. Asocicia HLA II haplotypov bola potvrden ivtdii 40 astmatickch farmrov vo Fnsku senzibilizovanch alergnmi kravskch upn81. Frekvencia aliel DRB1*0101, DRB1*0404, DQB1*0302, a DQB1*0501 bola vznamne vyia prve u osb senzibilizovanch antignom Bos d 2. Naopak alely HLA-DRB1*0301 a DQB1*0201 sa u alergikov vyskytovali vznamne menej vporovnan skontrolami. Spojenie HLA svskytom alergi potvrdili irecentn celogenmov asocia n atdie (GWAS), pri om atatistick vznamn vzbu scelkovmi IgE vmetaanalze dosiahli oblasti sHLA-G, HLA-DQA2,HLA-A aHLA-DRB182,83.

3.2.2 Vzbov acelogenmov atdie h>adajce lokusy pre astmu aatopiu Astma iatopia zpoh>adu dedi nosti patria medzi komplexn znaky. `tdium dedi nosti takchto znakov je komplikovan naprklad itm, ~e vsledovanch rodinch nevykazuj konzistentn typ mendelovskej dedi nosti aza ich rozvoj odpoved interakcia viacerch gnov spolu svplyvmi prostredia. Pre atdium tchto ochoren je preto dle~it vyberae ivhodn prstupy analzy. Naj astejaie sa vyu~vaj 2 postupy, ktor sa vdneanej dobe vdsledku revolcie molekulrnych biotechnolgi pou~vaj

asto spolo ne (tzv. pozi ne kandidtsky prstup) avpodstate obe v rznej miere vyu~vaj vzbov analzu (v tomto prpade neparametrick). Jedn sa ometdu funk nho apozi nho klonovania84. Metda funk nho klonovania pracuje su~ znmym gnom, uktorho u~ je znmy vzeah kchorobe, alebo sa tento vzeah d predpokladae vzh>adom kjeho funkcii. Utakhoto gnu uskuto nme asocia n / kosegrega n analzu jeho polymorfizmov so skmanm znakom. Druh metda (pozi n klonovanie) naproti tomu priamo nadvzuje na vsledky vzbovch analz. Sledujeme vnej rodiny / osoby sopakovanm vskytom skmanho znaku, utchto osb ur me genotypy vybranch markrov (v ainou sa jedn oSTR polymorfizmy) rozprestretch po celom genme asledujeme charakter ich distribcie na chromozmoch usledovanch osb. Miesta vykazujce najvyaaiu vzbu ksledovanmu znaku sa ozna uj ako lokusy av ich blzkosti by sa mal nachdzae potencilne kauzlny gn / gny. Takto gny sa sna~me pomocou rznych prstupov analyzovae aevaluovae ich vplyv na sledovan znak / chorobu (analza vskytu mutci, asocia n atdie polymorfizmov apod.).

Prvou atdiou, ktor speane popsala lokus odlian od HLA systmu, bola analza rodn sIgE odpoveou proti be~nm inhala nm alergnom. Cooksom aspol.17 vnej atudovali rodiny vykazujce dominantn typ prenosu au7 rodn naali vzbu slokusom v oblasti 11q13 (polymorfizmus D11S97). Vzh>adom kzisteniu, ~e atopia sa omnoho

astejaie vyskytovala udet matiek satopiou, ne~ udet atopickch otcov, tak sa Cookson aspol.85 nsledne venovali vplyvu parentlnemu pvodu lokusu na vznik alergie. Sledovali rodiny svskytom atopie  srodeneck pry, uktorch atopia bola definovan ako reaktivita pri ko~nch testoch so zostavou be~nch alergnov cez 2mm, zvaen hladina celkovch IgE, alebo pozitvny RAST (z angli tiny radioallergosorbent test) na prtomnose apecifickch IgE. Postihnut srodeneck pry zdie>ali alelu na 11q13 zdeden od matky v62% av32% od otca (p=0.001). Analza len paternlne prenesench aliel nezistila ~iadny rozdiel vdistribcii medzi tmito srodeneckmi prmi. Pozorovan fakt zvislosti vskytu choroby na maternlnom pvode alely si autori vysvet>ovali paternlnym genmovm imprintingom alebo maternlnymi vplyvmi na vyvjajci sa imunitn systm dieeaea. Vtretej atdii pokra ovala tto autorsk skupina vanalze 155 srodeneckch prov salelou na 11q13 zdedenou maternlne avtejto lokalite sa sna~ili njse alaie markry predisponujce katopii. Zistili, ~e b podjednotka FceRI tie~ le~ vtejto lokalizcii (11q13) a je vsilnej vzba khypotetickmu gnu pre atopiu86. Vneskoraej atdii 1004 osb z230 dvoj genera nch rodn zameranej na dva polymorfizmy vgne pre FceRIb naali prtomnose oboch polymorfizmov (Leu181/Leu183) u4,5% osb avaetky deti, ktor toto zdedili od matky, boli atopick87. Takto deti vporovnan sostatnmi vatdii mali zvaen riziko vskytu pozitvnych vsledkov ko~nch testov (rozto e, trvy), apecifickch IgE (pozitvny RAST) apre vskyt BHR (provokcia metacholnom). Deti, ktor tieto polymorfizmy zdedili od otca boli negatvne pri vaetkch testoch. Na zklade tchto testov navrhli, ~e Leu181/Leu183 polymorfizmy vgne pre FceRI- b zdeden od matky prestavuj riziko pre rozvoj atopie aBHR. Pozitvnu asociciu len samotnho polymorfizmu Leu181 shladinou celkovch IgE iapecifickch (traviny) bola neskr zisten ivatdii alach 10 britskch rodn ato znovu len vprpade prenosu Leu181 od matky88. Vplyv maternlne prenesenho Leu181/Leu183 aalach sledovanch polymorfizmov v FceRIb bola potvrden ivtalianskej atdii 77 atopickch det89.

Asocicia 11q13 satopiou zroveH odatartovala cel rad nslednch replika nch atdi. Prv vaak neboli presved iv90. Coleman aspol.91 svojou vzbovou analzou 95 rodn saktvnym atopickm ekzmom vyl ili 11q13 ako majoritn lokus pre atopiu. alej nepozorovali ani signifikantn rozdiel vdistribcii aliel medzi srodeneckmi prmi vzh>adom kich parentlnemu pvodu, maternlny vplyv na dedi nose atopie ale nemohli vyl ie. Vzba tejto oblasti khladine IgE (celkovch iapecifickch  rozto e atraviny) nebola preukzan ani vholandskej populcii, jedin slabo pozitvna vzba bola pozorovan sBHR92. Asociciu atopie s11q13 sa poksili replikovae iHizawa aspol.93 v4 ve>kch rodinch sautozomlne dominantnm typom prenosu atopie, ich snaha vaak bola nespean. Valaej atdii pracujcej so 14 atopickmi rodinami a 120 neprbuznmi japonskmi osobami vaak naali asociciu D11S97/PstI 0,96 kb alely so zvaenou hladinou celkovch IgE. Svyu~itm mnoho-po tovej vzbovej analzy vaak u~ lokus 11q13 nebol potvrden ako hlavn lokus pre kontrolu atopie vjaponskej populcii. Ur it vplyv na kontrolu IgE tm autori nevyl ili, poukzali vaak na evidentn heterogenitu pri porovnan sbritskou populciou94. Naproti tomu speane dopadla atdia 270 atopickch astmatikov a4 rozsiahlych rodn, keby vjaponskej populcii bola potvrden asocicia 11q13 (markr D11S97 agn pre FceRIb) sea~kou atopiou za predpokladu nevyv~ench pomerov maternlnych apaternlnych meiz,

m tie~ poukzali na lohu genmovho imprintingu vtomto lokuse95. Pozitvna vzba 11q13 bola replikovan ivjuhokrejskej populcii, ale len spozitvnoseou ko~nch testov, tto vzba nebola zisten pre BHR96. Replikcia tohto lokusu sa podarila aj vsamotnej britskej populcii pri rozren skmanej skupiny na 64 mladch nuklernych rodn97. Vzbu 11q13 satopiou uastmatikov potvrdila itdia holandskch 26 jadrovch rodn so srodeneckmi prmi sastmou aatopiou. Rozdiel vdistribcii sledovanch markrov vzh>adom kparentlnemu pvodu nebol pozorovan98. Vsledky tchto replika nch atdi nazna uj, ~e lokus 11q13 m vznam pri vzniku atopie, gny ztejto oblasti vaak nebud zo skupiny gnov ve>kho inku.

Oblase na 5q obsahuje mnoh kandidtne gny, ktor m~u ovplyvHovae IgE azpalov reakciu. Meyers aspol.99 sa preto rozhodli pre analzu markrov na 5q usrodeneckch prov avzbu tohto lokusu kzvaenm hladinm IgE ato srecesvnym typom dedi nosti. Xu aspol.100 uskuto nili dvoj - lokusov analzu u92 rodn svskytom astmy anaali vzbu IgE hladiny do oblasti 5q31-q32, pri om vzba bola silnejaia prve pri pou~it modelu sdvomi lokusmi. Pokus ozmapovanie tohto druhho lokusu si vzala za cie> nasledujca atdia rozaren o108 probandov aich rodiny ato na zklade rovnakej metdy vberu. Autori vtejto atdii za pou~itia zmieaanho modelu sdvomi hlavnmi gnmi zistili, ~e druh lokus modifikuje efekt toho prvho, preto~e vzba kelevovanm hladinm IgE bola pozorovan len vprpade kombincie homozygotnho rizikovho genotypu vprvom lokuse saspoH jednou rizikovou alelou vdruhom. Celogenmovm screeningom vaetkch 200 holandskch rodn naali vzbu klokusom na 7q (LOD skre 3,65, p= 0,00002), 5q (LOD 2,73, p=0,0002) a12q (LOD skre 2,46, p=0,0004). LOD skre nad 2,0 bolo pozorovan eate pre lokusy na chromozmoch 3 a13101. Vzbu tohto lokusu vaak nepozorovali Blumenthal aspol.102 vatyroch ve>kch rodinch svskytom atopie, predpokladali teda existenciu nieko>kch gnov ve>kho inku, ktor spolupracuj svplyvmi vonkajaieho prostredia pri vzniku vslednho fenotypu astmy alebo alergie. Vcelogenmovej atdii skupiny vedenej Danielsom103 vaak, inavzdory nlezu 6 mo~nch vzieb kfenotypom svisiacim sastmou, nebola potvrden vzba IgE alebo BHR s vyaetrenmi markrmi na 5q. Vzba oblasti 5q32-q33 shladinou IgE alebo sBHR nebola pozorovan ani vprpade vzkumu 67 rodn zo `ktska104. ala vznamn stimul kh>adaniu lokusov ansledne ignov zodpovednch za vznik astmy alebo IgE, mimo prstup pomocou atdia kandidtskych gnov, priniesli celogenmov atdie. Tieto zaznamenali svoj skuto n rozmach sairokou dostupnoseou modernch technolgii sobrovskou rozliaovacou schopnoseou (dostupnose obrovskho mno~stva sledovate>nch markrov vrmci jednho vyaetrenia), vo vskume chorb skomplexnou etiopatogenzou sa za ali vyu~vae tzv. celogenmov asocia n atdie (GWAS  genome wide association study). Na zklade tohto prstupu boli ur en alaie potencilne lokusy pre astmu alebo atopiu. `tdia Danielsa aspol.103 naala celkovo 6 lokusov asociovanch sastmou (atopickou) alebo svisiacimi fenotypmi, mimo in i11q13 (u~ znmy zpredchdzajcich atdi85) a7p. Celogenmov analza zroku 1997, ktor skmala 140 rodn s2 aviacermi srodencami sastmou z3 rozli nch rs sa zamerala na vyh>advanie novch lokusov svzbou kvskytu astmy105. Celkovo sa im podarilo odhalie vzbu astmy so 6 novmi lokusmi: 11p15 (p=0.0089) a 19q13 (p=0.0013) vskupine beloaskej populcie, 2q33 (p=0.0005) a 21q21 (p=0.0040) u Hispncov alokusy 5p15 (p=0.0008) a 17p11.1-q11.2 (p=0.0015) vrodinch afro - americkho pvodu.

Popula ne izolovan skupiny, smalm mno~stvom  zakladate>ov , s ve>mi ob>ben pri h>adan genetickch faktorov prispievajcich kvzniku choroby ato u~ od 70. rokov 20. storo ia106,107. Ober aspol.108 sa rozhodli h>adae nov lokusy asociovan sastmou vpopulcii Huteritov. Jedn sa onbo~ensk izolovan skupiny, ktor m svoj pvod zTyrolskch lp, do severnej Ameriky sa odseahovali v80. rokoch 18. storo ia. Pre celogenmov analzu boli vybran 4 prbuzn kolnie Huteritov, vktorch sa vzvaenej miere vyskytuje astma. Kanalze pou~ili 292 autozmovch markrov a3 zpseudoautozmovej oblasti, aanalzu uskuto nili v 2 ve>kch skupinch  v primrnej (361 osb) av skupine kreplikcii vsledkov (292 osb, zalach 5 kolni vJu~nej Dakote). Vka~dej skupine boli osoby bez astmy, sastmou, symptomatick osoby snejednozna nou BHR aosoby sBHR anejednozna nou anamnzou. Vprimrnej skupine naali 10 oblast smo~nou vzbou kastme. Vzbu sastmatickmi fenotypmi voboch skupinch, primrnej ipre replikciu, vaak vykazovali len 4 lokusy: 5q23 31, 12q15 24.1, 19q13 a 21q21. Mo~n vzba alaieho lokusu 3p24.2 22 bola uHuteritov pozorovan po prv krt. Tieto vsledky poukzali na to, ~e ivpopulcii srelatvne malou genmovou diverzitou (mal mno~stvo pvodn, rozdielnych genmov) je za vznik astmy zodpovednch viacero lokusov. Celogenmov atdia 58 rodn afro-americkho pvodu h>adala lokusy asociovate>n shladinou apecifickch IgE avsledkami ko~nch testov proti vybranm alergnom. Hizawa aspol.109 vnej naali vzbu lokusu 5q31-q33 so apecifickou odpoveou proti alergnu psov. Lokus 11q13 bol spojen shladinou apecifickch IgE proti pe>u bermudskej trvy (troskut prstnat, Cynodon dactylon), alergnu ma iek arozto om (Dermatophagoides farinae). Obidva tieto lokusy boli alej spojen spozitvnym vsledkom ko~nch testov proti aspoH jednmu z30 be~nch alergnov.

Vskyt lokusov spojench salergickou astmou bol sledovan i na myacom modeli. Zhang aspol.110 vtejto tdii nali 5 potencilnych lokusov viazanch na vskyt fenotypov asociovanch sastmou, znich 4 (s potencilnou vzbou kBHR) korepondovali >udskm lokusom 11q23, 12q22-q24,17q12-q22 a6p21, ktor u~ boli predtm asociovan so znakom svisiacim sastmou.

V97 nemeckch rodinch svskytom astmy bolo sledovanch celkovo 156 srodeneckch prov. Celogenmov atdia naala potencilnu vzbu lokusov na chromozmoch 2, 6, 9 a 12 sastmou a ajs hladinou celkovch

i apecifickch IgE111. Vrozsiahlej talianskej atdii det zo 172 rodn, 189 sporadickch prpadov svskytom hlavnch atopickch chorb a77 neprbuznch kontrol bol uplatnen prstup analzy kandidtnych gnov icelogenmov analza112. Tto atdia zistila vzbu lokusu pre FceRI sBHR apozitvnym ko~nm testom usrodeneckch prov, alej ivzbu mutcie NcoI vgne pre lymfotoxn a (LT a) sastmou agenotyp 2/2 NcoI v LTa bol pozorovan uvaetkch diev at selevovanmi IgE. }iadna vzba nebola njden pre variantu -308 vTNFa ani pre mutciuQ576R vgne pre IL4 receptor. Zvaen hladina IgE, astma aBHR boli spojen sPAR2 lokusom na chromozme X. Sastmou bol spojen lokus na chromozme 12, BHR smiestom na chromozme 14 a atopia schromozmom 19112. Alcas aspol.113 skmali astmatick deti nemeckho pvodu, uskuto nili GWAS zameran na lokusy pre astma avek nstupu pskanie. Mimo lokusy, ktor u~ boli predtm spojen svskytom astmy, naali vzbu lokusu 12q24-q25 prve kveku nstupu piskotov u astmatikov.

Vplyv prostredia pri vzniku alergickch chorb ahlavne astmy m nezanedbate>n lohu. Colilla aspol.114 sa preto vo svojej GWAS zamerali na spojitose genetickej predispozcie acigaretovho dymu. Signifikantn vzba (p < 0,05) sa prejavila vlokusoch 1p (markry D1S1669-D1S1665), 5q (markry D5S1505-D5S816) a 9q (markr D9S910). Lokusy 1q a17p sce nedosiahli nominlnu signifikanciu, ale stle dosiahli vznamnho rozdielu od zkladnej hladiny LOD skre pri kalkulcii scigaretovm dymom vanalze. Tto tdia poukzala na vplyv expozcie faktorom vonkajieho prostredia pri vzniku astmy. Pomyselnm vrcholom pri h>adan gnov zodpovednch za vznik astmy aatopickch ochoren s meta-analzy apotom i modern GWAS atdie pracujce sobrovskm sborom skmanch osb iatudovanch polymorfizmov aplne vyu~vajce metdy NGS (z angl. Next Generation Sequencing). Wise115 vroku 2001 referoval ovsledkoch meta-analz, ktor ur ili siln vzbu predispozcie kastme slokusom na 6p aalej s lokusmi na chromozmoch 2, 9, 10 a15. Denham aspol.116 vroku 2008 uskuto nili meta-analzu 11 GWAS, ktor vyhoveli ich selek nm kritrim  humnne atdie kaukazskch populci, prca psan vangli tine, obdobie 1996  2006, vyl enie preh>adovch

lnkov, dostupnose celogenmovch dt adostupn daje oLOD skre. Dkaz signifikantnej vzby BHR bol zisten slokusmi 2p12-q22.1, 6p22.3-p21.1 a 11q24.1-qter (989 rodn). Spozitvnoseou ko~nch testov boli spojen lokusy 3p22.1-q22.1 a 17p12-q24.3 (1093 rodn). Hladina celkovch IgE bola vsignifikantnej vzbe slokusmi 5q11.2-q14.3 a 6pter-p22.3 (729 rodn). Astma ako tak (fenotyp = astma, bez alaej defincie) nebola na celogenmovej rovn vsignifikantnej vzbe k~iadnemu lokusu (hladina celogenmovej vznamnosti bola ur en ako pom bolo posdie tie~ ivplyv SNP snzkym stupHom, ktor

asto m~u bye vmno~stve sledovanch SNP prehliadnut (tzv. faloan negatvnose). Alelick skre hodnoten z46 SNP snajvyaam hodnotenm bolo asociovan s fenotypom v asnho nstupu perzistujceho pskania (pko polymorfizmov, ale len niektor maj iskuto n klinick dopad. Vprpade Arg-Gly 16 substitcie dochdzalo in vitro kzvrazneniu down - regulcie b2 adrenoreceptorov po provokcii agonistami, zatia>

i vprpade Gln-Glu 27 substitcie dochdza koslabeniu down regulcie tohto receptoru140,141. Gly 16 forma receptoru bola spojen sno nm poklesom spirometrickch parametrov azvaenou BHR142,143. Glu 27 forma bola naproti tomu spojen so zn~enou reaktivitou dolnch dchacch ciest umiernych a~ stredne zva~nch astmatikov144. `tdia 60 rodn sastmatikmi naala asociciu Glu 27 vADRB2 azvaenou hladinou IgE145. Asocicia tchto dvoch variant vpozcich 16 a27 vaak nebola zisten svskytom astmy aatopie ako takej. Ike tieto 2 polymorfizmy neprispievaj zsadne krozvoji astmy, tak ur ite bud mae modifikujci vplyv na priebeh choroby145.

Vlokuse 5q je lokalizovan ign pre IL-9, konkrtne voblasti 31.1146. Vexperimente na myaiach bol lokus pre IL-9 spojen sBHR aexpresia IL9 bola zn~en umya so zn~enou bronchilnou reaktivitou147. Ba

o viac, iutransgnnych mya skonatitutvnou expresiou IL-9 bol pozorovan vskyt fenotypov podobnch astme  prtomnose eozinofilnho alymfocytovho zpalu, nadprodukcia hlienu ahyperplzia pohrikovch buniek. ZroveH bola zisten iprtomnose Th2 cytoknov (napr. IL-4, IL-5, IL-13), pri om ale najdle~itejaiu lohu znich vtomto prpade vdchacch cestch m IL-13  uRAG1 deficitnch mya skonatitutvnou produkciou IL-9 bola pozorovan zvaen produkcia IL-13 vepitelu dchacch ciest148. Laitinen a spol.149 sledovali 157 rodn svskytom astmy zizolovanej fnskej oblasti Kainuu a h>adali vnich vzbu 6 markrov z5q (mimo in iIL-9) svskytom astmy. Tto vaak nenaali ani pomocou podrobnej permuta nej analzy, ani pomocou sekvenovania IL-9 apreto dospeli knzoru, ~e je nepravdepodobn, aby oblase 5q31 prispievala kdedi nosti srovch IgE alebo krozvoji astmy vo fnskej populcii149. Vznam IL-9 vpatogenzy astmy bol potvrden vexperimente smyaami, ktorm bol IL-9 instilovan intratrachelne po dobu 10 dn. Utchto mya bola nsledne zisten zvaen srov hladina IgE av bronchoalveolrnej lav~i bola zisten p>cna eozinoflia150. Niimy aspol. objavili voblasti 5q31-q34 gn pre uteroglobnu prbuzn proten (UGRP1) a jeho exprimciu pozorovali vprieduanici ap>cach, pri om zn~enie hladiny UGRP1 mRNA bolo pozorovan vp>cach mya santignom indukovanou pneumniou151. alej zistili, ~e genotypy -112A/-112A a -112A/-112G vtomto gne boli signifikantne asociovan sastmou152. Vreplika nej atdii 47 japonskch rodn sastmatickmi deemi vaak asociciu tchto genotypov ani jednotlivch aliel sastmou nepotvrdili153.

3.2.3.3 chromozm 6 Voblasti 6p21.3 sa nachdza TNF gnov komplex, ato medzi skupinami gnov pre HLA II/III aHLA I. triedy154. Vtomto komplexe sa nachdzaj gn pre lymfotoxn-a (LTA, LTa, TNFSF1, TNFb), za nm nasleduje tumor nekrotick faktor (TNF, TNFa) avprotismernej orientcii potom eate lymfotoxn-b (LT b)155. TNF bol ur en ako siln prozpalov cytokn zvyaujci BHR u>ud156,157. Zvaen hladiny TNF boli njden vdchacch cestch ivbroncho  alveolrnych vplachoch158,159. Jeho zvaen sekrcia by mohla bye vsvislosti s alelou

. 1 NcoI polymorfizmu (zmena Gna A, intrn

.1) vLTA160 aalej s alelou

. 2 varianty vpozcii -308 vpromtorovej oblasti TNF, priktorej bola pozorovan 6  7x vyaaia expresia vporovnan sbe~nou variantou161. Vatdii 88 austrlskych nuklernych rodn s 92 astmatikmi, sa preukzal vznamne

asteja vskyt uvedench polymorfnch aliel prve uosb sastmou. Tto asocicia bola zroveH obmedzen na haplotyp zlo~enztchto variant (LTa NcoI*1 / TNF-308*2 haplotyp) apreto nebolo mo~n rozlaie samostatn efekt jednotlivch polymorfnch aliel162. alaia austrlska atdia taktie~ potvrdila asociciu tchto dvoch polymorfizmov svskytom astmy, avaak vinverznom vzeahu ne~ predchdzajca atdia  sastmou boli asociovan alely LTa NcoI*2 a TNF-308*1. Autori alej pozorovali linerny trend zvyaujceho sa rizika vskytu astmy vzvislosti od vaetkch mo~nch genotypov (homozygoti pre uveden asociovan alely mali riziko najv aie), ato vprpade oboch polymorfizmov163.

Kpodobnm zverom doala iatdia 131 talianskych rodn sdeemi satopickou astmou164. Tto naala signifikantn asociciu LTa NcoI*2 spozitvnoseou ko~nch testov aatopiou (definovan ako zvaen hladiny IgE, pozitvnose ko~nch testov, alebo prtomnose oboch tchto fenotypov). Asocicia sce nebola potvrden pre polymorfizmus vTNF, ale haplotypov analza tchto polymorfizmov bola spozitvnym vsledkom. Autori konatatovali vznamn rozdiely valelovch frekvencich vtchto troch populcich (talianska, 2 austrlske), pri om si to vysvet>ovali mo~nm vplyvom HLA lokusu (TNF lokus je vsilnom disekvilibriu sHLA DR). ZroveH poukzali na to, ~e austrlske atdie pracovali sosobami, ktor nezdie>ali rovnak ale ve>mi odlian prostredie,

o mohlo viese krozdielnej imunologickej polarizcii osb vnich zaradench atm aj k ovplyvneniu vsledkov asocia nej analzy164. Vplyv HLA bol pozorovan ipri nchylnosti kpotravinovm alergim  v37 rodinch svskytom alergie na araaidy bol pozorovan vznamne vyaa vskyt genotypov DRB1*08, DRB1*08/12 tyr16 aDQB1*04 vporovnan skontrolnou skupinou165. Distribciu HLA-DRB1 v230 rodinch zBusseltonu sledovala skupina Moffattovej aspol.166, pri om naali vzbu tohto gnu khladine celkovch iapecifickch (rozto e, ma ky) IgE. VzbaHLA-D oblasti (6p21) bola pozorovan i vatdii 299 osb z45 beloaskch rodn so zvaenou hladinou apecifickch IgE proti rozto om167. `pecifik IgE boli vyaaie vznamne

astejaie sa uosb s196 bp alelou markru D6S1281 a 104 bp alelou markru DQCAR. Naopak 200 bp alela markru D6S1281 a 204 bp alelou markru D6S291 sa u takchto osb vyskytovali ove>a menej

asto a preto by mohli predstavovae protektvny inok167.

3.2.3.4 chromozm 7p Vatdii fnskej populcie zizolovanej Kainuu oblasti naali Laitinen aspol.168 vznamn vzbu lokusu 7p14-p15 sastmou, vysokou hladinou IgE alebo kombinciou oboch tchto fenotypov. Tto vzba bola najvyaaia pre hladinu IgE. Vpokra ujcej atdii sa Polvi aspol.169 zamerali na vytvorenie fyzickej mapy tohto lokusu aalej uskuto nili asocia n atdiu gnu pro g reeazec heterodimrickho g /d receptoru T buniek (TCRG). Vdvoch nezvislch zostavch fnskych rodn vaak nebola njden asocicia TCRG ani scelkovmi IgE ani sastmou169.

Laitinen aspol.170 skmali 133 kb segment ur en ako suspektne ovplyvHujci vznik astmy voblasti na 7p. Vtejto oblasti naali 2 gny  AAA1 aGPRA. Vzh>adom ktomu, ~e rozli n distribcia protenovch izoforiem GPRA bola zisten vo vzorkch zbiopsi v bronchoch, tak na tento proten upriamili svoju alaiu pozornose. GPRA (taktie~ znmy iako GPR154) je sirotsk receptor spriahnut sG protenom. Autori atdie zistili, ~e v3 kohortch zKanady aFnska sa vyskytovali SNP haplotypy asociovan svysokou hladinou IgE alebo astmou. alej vexperimente na myaom modeli stimulovanom ovalbumnom bola pozorovan zvaen expresia gnu homologickho prve kGPRA170. Asocicia GPR154 bola potvrden aj vtalianskej populcii, kde sledovali vskyt 7 polymorfizmov upacientov salergickou astmou. Asocicia shladinou IgE bola zisten spolymorfizmami SNP 546333 a rs740 347, P=0.006 ashaplotypom H4. Sastmou boli asociovan haplotypy H5 aH6171. Asocicia SNP haplotypov vGPR154 bola nasledovne potvrden aj valach, rozli nch eurpskych populcich172.

3.2.3.5 chromozm 11q Vzba lokusu 11q svskytom atopie bola popsan Cooksonom aspol.17 u~ vroku 1989 aalaie atdie venovali tejto oblasti zna n pozornose. Vatdii 123 srodeneckch prov sastmou asvisiacimi fenotypmi (atopia, BHR), van Herweden aspol. pozorovali vzbu mikrosatelitnho polymorfizmu vpiatom intrne gnu pre FceRIb sdiagnzou astmy aBHR. Tto vzba sBHR bola signifikantn ipo vyl en atopickch osb92,173. Zmena izoleucnu za leucn vpozcii 181 tohto gnu, ktor bola asociovan satopiou vbritskej atdii, nebola pozorovan vskupine japonskch pacientov94. Pozorovan asocicia sastmou aBHR vaak bude mo~no spojen svskytom zmien vregula nch oblastiach tohto gnu alebo vdsledku mutcii vinch pri>ahlch gnoch174.

CC10 (10 kDa proten Clarovch buniek) je proten svysokou expresiou vdchacch cestch ataktie~ m~e mae dle~it lohu vmodulcii zpalu (protizpalov inok) vstene dchacch ciest175. Lokalizcia gnu pre tento proten bola ur en do oblasti medzi markry D11S16 aD11S97 (11q12-q13)  oblase do ktorej bol mapovan hypotetick lokus pre atopiu aalej ign pre FceRIb176. IL-8 je uznvan ako dle~it meditor zpalovej reakcie vdchacch cestch. Funguje ako chemotaktick faktor neutrofilov, ktor lka do miesta zpalu apotom indukuje fagocytzu177. IL-8 zroveH indukuje i angiogenzu178. IL-1b aktivuje NF-kB a nsledne dochdza kaktivcii expresie IL-8179. Samotn proten CC10 je konatitutvne exprimovan bunkami epitelu vaetkch sliznc, ktor s vstyku svonkajam prostredm, napr. aj vdchacch cestch180. CC10 je znmy pre protizpalov inky, ovplyvHovanm IL-8. CC10 knock-outovan mya vykazovali znmky zvaenej zpalovej aktivity dchacch ciest vreakcii na alergn181.

Long a spol. 182 vexperimente na bunkch nosnej sliznice ana CC10 knock-outovanch myaiach zistili, ~e CC10 inhibuje expresiu IL-8 indukovan IL-1b a~e CC10 reprimuje aktivciu NF-kB indukovan cestou IL-1b, priama interakcia medzi CC10 ap56 ale nebola pozorovan. Vkultrach zexplanttov nosnej sliznice u>ud mala hladina CC10 inverzn vzeah kkIL-1b indukovanej expresii IL-8182. Asocicia CC10 sastmou vskupine 275 osb britskho a 300 osb japonskho pvodu vaak nebola potvrden ato bez oh>adu na atopick stav183. Avaak vindickej populcii bola njden signifikantn vzba intragnovho repetitvneho polymorfizmu sastmou pri omvo vzbe bol aj haplotyp A_18 zostaven zpolymorfizmu A38G (ten samostatne nebol asociovan) auvedenho repetitvneho polymorfizmu. Na zklade tchto dajov je mo~n predpokladae, ~e tento gn nebude patrie medzi gny silnho inku predisponujceho kvzniku astmy184.

3.2.3.6 chromozm 12q Oblase 12q bola svskytom astmy prv raz spojen vroku 1996 vatdii kaukazskej aafro-karibskej populcii185. Vzba chromozmu

. 12 sastmou bola nsledne hlsen ivatdii 3 rozli nch americkch rs105 avzbu katopii popsala i jedna nemeck atdia186. alaia atdia zameran na nemeck populciu asociovala oblase 12q13 svskytom astmy iatopie spolo ne111. Dle~it postavenie lokusu 12q pri nchylnosti kastme alebo sHou svisiacich fenotypov potvrdili ialaie, celogenmov atdie131,187,188. Raby aspol.189 vykonali podrobnejaiu analzu lokusu 12q13-q24 pomocou 32 mikrosatelitnch markrov. Vtomto lokuse naali 3 samostatn oblasti  jednu svzbou kastme, druh kBHR atretia svisela so zmenami p>cnych funkci (FEV1, BDPR indexy). Do oblasti 12q bolo mapovanch nieko>ko kandidtskych gnov pre atopiu (napr. gn pre interfern g - IFNG,

i rastov faktor mastocytov  MGF apod.). Ztohto dvodu sa Barnes aspol.185 zamerali na tto oblase vskupinch astmatikov z Barbadosu (afro - karibsk populcia, prostredie svysokou zea~ou alergnmi) azPensylvnie (belosk populcia Amiov starho poriadku). Sledovanm polymorfnch markrov z12q nali voboch skupinch vzbu lokusu 12q15-q24.1 kastme, zvenm IgE ikombincii oboch185. Asociciu tohto lokusu sIgE potvrdila i nemeck tdia, vktorej sledovali deti sperzistujcimi vysokmi hladinami IgE, presne definovali extrmny fenotyp (IgE nad 85% hodnt atopickej populcie) anali tak vzbu smarkrmi D12S379, D12S1064, D12S351 aPAH186. Sastmou bol asociovan imarkr D12S390 (lokus 12q13.13) vtalianskej populcii190.

Voblasti 12q24 sa nachdza ign pre neuronlny NOS (NOS1), ktor hr dle~it lohu vpri vzniku astmy  napr. vexperimentoch na myaiach vykazoval dle~it lohu pri vzniku BHR, preto~e myai deficitn pre tento gn boli menej nchyln odpovedae na bronchoprovoka n stimuly, ne~ wt myai. A o viac, polymorfn markry vNOS1 boli pozorovan vo zvaenej miere uastmatikov aintrnov (AAT)n polymorfizmus bol spojen so zvaenou koncentrciou NO vdchacch cestch(rozoberan v 191). Shao aspol.192 sa zamerali na polymorfizmy vgnoch, ktor boli aspoH 1x spojench sastmou vdetstve,

i sHou svisiacich fenotypov, nachdzajcich sa vlokuse 12q13-q24. Repetcie GT vdruhom intrne NOS1 aGT repetcie vprvom intrne STAT6 boli vasocicii sastmou, no CA opakovanie vintrne

. 1 gnu pre IFNg apolymorfizmus 465C>T vgne pre AID (AICDA) nevykzali ~iadnu vzbu sastmou.

3.2.3.7 chromozm 13q V 86 rodinch svskytom atopickej astmy bola uskuto nen podrobn analza chromozmu

. 13, ktorou bola njden vzba astmy slokusom 13q14.2 vjaponskej populcii193. Vzbu lokusu 13q14 satopiou zistili iDaniels aspol. 103 vo svojej celogenmovej atdii. Vzbu tohto lokusu asociovali iHizawa aspol.194 ato s vskytomdetskej astmy sprecitlivenoseou krozto om. Ober aspol.108 zase vpopulcii Hutteritov asociovali lokus 13q21.3 sastmou vprvej etape hodnotenia rodn, avaak u~ nie vdruhej.

Bhattacharyya a spol.195 analzou 59 polymorfnch markrov spresnili lokalizciu lokusu pre aatopiu do oblasti okolo markru D13S161, shranicami medzi markrmi D13S328 a D13S1269. Vnasledujcej tdii tto skupiny nala vtomto lokuse asociciu novho mikrosatelitnho markru USAT24G1 shladinou celkovch IgE196. Zhang a spol.197 nakoniec vtejto oblasti asociovali polymorfizmy vPHF11 shladinou IgE iea~kou astmou. Mimo PHF11 le~ vtejto oblasti i SETDB2 a to hne pred nm. `tdia austrlskych rodn svskytom atopickho ekzmu skmala SNPy vtchto 2 gnoch a stouto chorobou asociovala polymorfizmy v PHF11, konkrtne rs2247119 vintrne

.3 ( p = 0,029) a rs1046295 v 3UTR (p = 0,007)198. Tieto vsledky prilo~ili ala zkamienkov do mozaiky dkazov poukazujcich na vznamu lokus 13q14 vregulcii atopickch chorb.

3.2.3.8 chromozm 14q Voblasti 14q11.2 le~ TCR a/d gnov komplex, ktor obsahuje gny pre tvorbu aad reeazcov TCR199. Vatdii asocicie apecifickch IgE (proti antignom rozto ov, srsti ma iek apsov, travn aAlternaria alternata) Mofattov aspol.200 nepozorovali signifikantn vzbu IgE klokusu sgnmi pro TCRd. Upostihnutch srodeneckch prov (populcia zUK azAustrlie) vaak naali vznamn vzbu sledovanch mikrosatelitnch sekvenci zoblasti TCR a, prenesench od oboch rodi ov. Tento vsledok pod>a autorov poukazuje na prtomnose gnu / gnov zoblasti TCRa, ktor modifikuj apecifick IgE odpove200.

3.2.3.9 chromozm 19 Chromozmov oblase 19q bola spojen sastmou vnieko>kch GWAS108,112. Analzou 22 markrov zchromozmu

. 19 v111 rodinch svskytom alergickej astmy bola odhalen vzba oblasti 19q13.3 katopii, pozitvnosti ko~nch testov ahladine IgE201. Voblasti 19p13.3 le~ gn pre nzko  afinitn IgE receptor202. Laitinen aspol.203 skmali asociciu tohto gnovho lokus vo fnskej populcii s3 fenotypmi: celkov IgE, astma aapecifick IgE. Haplotypovou analzou sledovanch SNP naali vzbu kvysokej IgE odpovedi a u asti rodn (s vskytom astmy u2 aviacerch det) ikastme.

Zlo~ka komplementu C5 m siln zpal podporujci inok, ktor uplatHuje cez svoj receptor C5R1, ktor je

lenom rodopsnovej rodiny204. C5R1 je exprimovan na mnohch bunkch imunitnho systmu, ale taktie~ ivmnohch bunkch dchacch ciest205,206. Gn kdujci C5R1 sa nachdza na lokuse 19q13.3-q13.4207. Barnes a spol.208 naali polymorfizmus vpromtore gnu pre C5R1. Uskuto nili asocia n atdiu tohto polymorfizmu sastmou alebo fenotypom atopie vtroch rozli nch atdich, avaak nepozorovali ~iadnu asociciu ktmto fenotypom . A o viac, nebola zisten ani zmena promtorovej aktivity asociovate>n stmto SNP208. Je preto nutn uskuto nie alaie atdie, ktor definitvne zhodnotia mieru vplyvu tohto gnovho lokusu pri vzniku alergickch ochoren.

3.2.3.10 chromozm 20q Prevratn celogonmov atdiu predstavuje prca van Eerdewegha spol.126, ktor vskupine 460 srodeneckch prov (beloask populcia, kombinovan zUS aUK populcie) odhalila 2 peaky voblasti 20q13 aalaou presnejaou analzou (vzbov analza, sekvencia pri>ahlch gnov ana zver asocia n analza polymorfizmov tchto gnov) preukzala asociciu ADAM33 sastmou aBHR. Tto prca odatartovala mno~stvo replika nch atdi ainch atdi zaoberajcich sa funkciou ADAM33 vdchacch cestch apri vzniku astmy. Vzba lokusu 20q13 khladine apecifickch IgE (rozto e) ikastme ( i k jej rozli nm fenotypom) bola neskr potvrden ivGWAS pracujcej s 202 austrlskymi rodinami209.

3.2.3.11 chromozm Xq Ve>mi dle~it lohu vmechanizme spustenia tvorby IgE  pri indukcii samotnho izotypovho prepnutia  m interakcia medzi CD40 ligandom ajeho receptorom (CD40). Ztohto dvodu bola tudovan ich loha pri vzniku alergickej reakcie. Gn pre CD40L sa nachdza na Xq26.3210. Lokus gnu pre CD40 je zase v oblasti 20q13.12211. loha interakcie CD40L CD40 vpatogenze astmy aprizpale asociovanom stvorbou IgE bola skman na myacom modeli stimulovanom antignom Aspergillus fumigatus. Takto my potom vykazovali elevciu IgE aeozinofiln zpal vp>cnych tkanivch avmaterili zbroncho-aleveolrnej lav~i212. V kmeHoch sknock-outovanch jednm alebo druhm gnom bola vznamne zn~en tvorba IgE, zpal vp>cnych tkanivch vaak pozorovan nebol. Krozvoju BHR doalo, ale len umya svyradenm gnom pre CD40L212.

3.3 Charakteristika vybranch kandidtskych gnov Posledn 3 desaero ia boli svedkami obrovskho pokroku vmolekulrne genetickej podstaty vzniku alergickch chorb. Za toto obdobie doalo kvraznmu nrastu po tu lokusov ansledne ignov (kandidtskych

i ur ench pomocou pozi nho klonovanie) asociovanch svskytom astmy aatopickch chorb. V80. rokoch minulho storo ia sa za alo so skmanm vplyvu HLA systmu na vznik alergickch ochoren, napr. Saito aspol.68 naali siln vzbu niektorch lokusov HLA-B srodinnm vskytom astmy, usilovn vskum na poli HLA vo vzeahu kalergim pretrvva dodnes. plne nov lokus (11q13) asociovan satopiou bol popsan vroku 198917. Od tohto okamihu doalo vdsledku vzbovch analz, atdi kandidtskych gnov icelogenmovch atdi kzvaeniu po tu asociovanch gnov avroku 1998 tak u~ bolo znmych 6 lokusov spojench svskytom alergi. Snstupom modernch biotechnolgi, ukon enm sekvencie aresekvencie celho >udskho genmu s asne sextrmnym rozarenm databz polymorfizmov vHom, atm pdom instupom celognomovch atdi na kvalitatvne ikvantitatvne vyaaom stupni doalo kalaej expanzii asociovanch lokusov, vroku 2008 ich bolo znmych u~ viac ne~ 20018. Medzi gny asociovan sastmou vposlednej dobe tak patria napr. PERLD1 asociovan s astmou hne nieko>kmi GWAS119,213-215, ORMDL3 asociovan sdetskou astmou214,216,

i GSDMB taktie~ spojen svskytom detskej astmy119,216, pri om tieto 3 gny sa nachdzaj na 17q21.

Asocicia gnov je potvrdzovan vreplika nch atdich  uniektorch gnov tieto boli snegatvnym vsledkom, asocicia alach gnov bola replikovan v1-2 atdii. Replikcia v6-10 atdich bola spean pre 15 kandidtskych gnov aasocicia salergickm ochorenm vo viac ne~ 10 replika nch atdich bola uskuto nen len vprpade 10 gnov. Medzi gny sreplikovanou asociciou v6  10 atdich patr STAT6 amedzi gny sreplikciou vo viac ne~ 10 atdich patr zase ADAM33217. Vzh>adom na tento fakt sa nasledujca

ase bude venovae charakteristike tchto 2 gnov avnadvznosti na to bud vexperimentlnej

asti popsan vsledky asocia nej atdie tchto gnov sastmou aatopiou udet vybranch z eskej populcie.

3.3.1 STAT6 Atopiu charakterizuje sklon kzvaenm hladinm IgE ato vreakcii na be~n, neakodn alergny vonkajaieho prostredia. Za tvorbu IgE s zodpovedn plazmocyty (bunky vterminlnom atdiu diferencicie B buniek). Ktvorbe IgE vaak dochdza a~ po spoluprci dvoch signlov  stimulcia B lymfocytov prostrednctvom IL-4 azroveH na zklade pomoci Th2 lymfocytov prostrednctvom interakcie CD40L (povrch T buniek) sCD40 (B lymfocyty). U>ud tak dochdza k izotypovmu preskoku atvorbe IgE aIgG4218, pri om prednostn tvorba IgE m~e bye pravdepodobne ovplyvnen interakciou CD23/CD21219. Expresia germinlnych transkriptov zgnov Ce aCg4 m~e vrelatvne nzkej miere prebiehae aj bez stimulcie prostrednctvom IL-4 (mechanizmom zvislm od interakcie CD40/CD40L). Dostato n tvorba e-GLT ansledn efektvny izotypov preamyk po stimulcii CD40 prostrednctvom CD40L na T bunkch je vaak plne zvisl od funk nosti STAT6  vexperimentoch so STAT6-/- myakami bolo zisten extrmne zn~enie tvorby zrodkovch transkriptov Ce aCg1, kompletn poruaenie synergizmu signlov z IL4 receptoru azCD40 autakchto myaiek neboli detekovate>n hladiny IgE220. Anavyae, jeden nedvny experiment popsal zaujmav pozorovanie, asce ~e nematurovan B bunky sa preferen ne prepnaj zIgM priamo na IgE, ne~ cez IgG1 medzistupeH vplne diferencovanch B bunkch221.

3.3.1.1 `truktra STAT6 STAT6 patr do rodiny protenov prenaajcich signl aaktivujcich transkripciu vreakcie na vzbu ligandu na prsluan receptor (STAT = zangl. Signal Transducer and Activator of Transcription). Hou aspol.222 vroku 1994 ako prv speane identifikovali aklonovali STAT6. Pomocou vyh>advania velektronickej databzy >udskch cDNA ah>adania homolgie ku~ znmym protenom zrodiny STAT, popsali STAT6 i Quelle aspol.223 ato nezvisle od skupiny okolo Houa. Gn pre STAT6 je mapovan do oblasti 12q13.3224, m ve>kose o nie o v aie ne~ 19 kb aje zlo~en z23 exnov225. Exn

. 1 aproximlna

ase druhho exnu tvoria 5UTR atranslcia tak za na od 22. nukleotida vexne

. 2 akon  za 189. nukleotidom vposlednom exne, ktor tak tvor 3UTR. (Obr.11). Transkripciou STAT6 m~e vznikae nieko>ko mRNA izoforiem226-228:

STAT6  mRNA zostaven zo vaetkch relevantnch exnov, STAT6a  izoforma bez

asti 3UTR, STAT6b  forma bez exnu

.4, STAT6c 

ase exnu

. 16 je s aseou intrnu Neskr boli popsan eate alaie 2 izoformy vznikajce retenciou intrnu: STAT6d obsahuje mimo exnov sekvencie iintrn

. 17 aSTAT6e obsahuje isekvencie intrnov

. 17 a . 18229.

 Obr. 11 `truktra STAT6 Na obrzku je znzornen atruktra STAT6  23 exnov, exn 1 a ase exnu 2 tvoria 5UTR,

ase poslednho exnu (siv farba) predstavuje 3UTR. Na obrzku s alej znzornen ipozcie polymorfizmov vSTAT6, ktorch asocicia khladine IgE akastme bola posudzovan naj astejaie.

3.3.1.2 `truktra STAT6 protenu STAT6 patr do rodiny protenov STAT, ktor tvor celkovo 7

lenov: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT6b a STAT6. Vaetky tieto proteny zdie>aj homolgiu vatruktre domn (Obr. 12) iv aiu

i menaiu sekven n homolgiu. STAT proteny tak obsahuj postupne za sebou ulo~en N terminlnu domnu, (NTD), domnu via~ucu sa na DNA (DBD), domnu podobn SH3, SH2 podobn domnu atransaktiva n domnu na C konci230. Reeazec STAT6 je tvoren celkovo 847 aminokyselinami.

N terminlna domna m tvar tzv. zapletenej cievky (CCD  zangl. coiled coil domain). Prvch 130 aminokyseln vtejto domne je silne konzervovanch medzi protenmi rodiny STAT atto

ase protenu prestavuje dle~it funkciu v dimr  dimrovch interakcich, pri tetramerizcii medzi dimrmi STAT anslednej spoluprci pri vzbe kDNA231,232. Vtejto oblasti sa taktie~ nachdza Arg vpozcii 32, ktor je zsadn pre metylciu STAT6. Vprpade mutcie postihujcej prve tento arginn alebo pri inhibcii jeho metylcie dochdza kplnmu zruaeniu fosforylcie, transportu do jadra avzby STAT6 na DNA233.

Oblase DBD je taktie~ pomerne vysoko konzervovan medzi protenmi STAT rodiny asl~i knaviazaniu na GAS sekvencie231. GAS s sekvencie DNA aktivovan vaeobecne vodpovedi na signalizciu iniciovan INFg.

 Obr. 12. `truktra protenu STAT6 Obrzok zobrazuje atruktra STAT6  zlo~enie vlastnch domn je spolo n pre vaetky proteny zrodiny STAT. CCD  domna zapletenej cievky (coiled coil domain), DBD  DNA via~uca domna, SH3  domna spodobnoseou kSH3, SH3  domna so sekven nou podobnoseou kSH2, TAD  transaktiva n domna. Y641  tyrozn vpozcii 641, ktor je vprpade STAT6 dle~it lohu, je fosforylovan ansledne umo~Huje dimerizciu. CBP aNCoA-1  koaktivtory SAT6, pri om

iernou zvislou

iarou vTAD s znzornen dve

asti, ktor maj rozdielnu, pritom ale dle~it funkciu pri transaktivcii, via~u CBP aNCoA-1. sla predstavuj ozna enie poradia aminokyseln vSTAT6 na rozhran jednotlivch domn. Podrobnosti vi text.

Domny SH3 sa vo vaeobecnosti nazvaj molekulrne such zipsy, nako>ko maj schopnose interagovae soblaseami bohatmi na proln234,235. Konzervovan domna shomolgiou kSrc typ 2 je schopn asociovae sreceptorom pre cytokn ainteragovae sprotenmi obsahujcimi fosfotyrozn a tm pdom m~e dochdzae kdimerizcii salam STAT aovplyvHovae transaktivciu236,237. Domna TAD m dve rozdielne oblasti, pri om prtomnose obidvoch je dle~it pre transaktivciu. ase tejto domny bli~aia kN koncu bielkoviny spolupracuje sCBP (proten via~uci CREB) adistlna

ase (bli~aia kC konci) interaguje sNCoA1(koaktivtor jadrovho receptoru 1,

len p160/SRC rodiny koaktivtorov)., ktor je apecifickm STAT6 koaktivtorom238. Vzba oboch je dle~it pre plne funk n transaktivciu.

3.3.1.3 Funkcia STAT6 protenu STAT6 m dle~it lohu vo funkcich T buniek azroveH ipri diferencicii smerom kTh2 bunkm apri prolifercii stimulovanej IL-4. Rzne aspekty vplyvu STAT6 vT bunkch, ipostihnutie tvorby samotnch IL-4 aIL-13 boli demonatrovan vexperimentoch sSTAT6-/- myakch239-241. STAT6 mimo in ovplyvHuje iexpresiu Gata3, ktor je zsadnm faktorom vdiferencicii smerom kTh2 bunkm242. VB bunkch je STAT6 zodpovedn za tvorbu buniek vspoluprci zo signalizciou aktivovanho CD40220 ahladiny IgE boli vznamne redukovan vmyom STAT6-/- modeli po alergnnej senzibilizcii239-241. Expresia rznych molekl B buniek, ktor hraj dle~it funkciu vprocese spracovania antignu (za situcie, ke B bunka sa s asne chov ako APC), je taktie~ indukovan IL-4, signl ktorho prenaa prve STAT6  jedn sa mimo in oHLA II. triedy, CD80 aCD86239-241. No a vneposlednom rade IL-4 prostrednctvom signalizcie cez STAT6 m dle~it lohu vzchrane B buniek od programovanej smrti243. STAT6 sa uplatHuje imimo B aT bunky. Z astHuje sa diferecicie alternatvne aktivovanch makrofgov prostrednctvom IL-4 stimulcie asprostredkovva vnich expresiu gnov indukovan IL-13244,245. Vdentritickch bunkch vyvolva tvorbu IL-12, ktor je dle~it pre Th1 imunologick pochody a zni~uje produkciu IL-10246. Vbunkch prsnch ~liaz zase vIL-4/IL-13/STAT6 drhe indukuje vvoj luminlneho epitelu247. Vdchacch cestch je zase zapojen do signlnej drhy spaeanej IL-13, ktor ovplyvHuje vznik BHR248.

 Obr. 13. `truktra IL-4 / IL-13 receptorov Receptor pre IL-4 patr do skupiny cytoknovch receptorov typu 1, pre ktor je charakteristick prtomnose extracelulrne ulo~ench 4 konzervovanch cystenov (Cys) aWSXWX motvu. Vintracelulrnej

asti sa nachdzaj 2 domny limitovanej homolgie medzi cytoknovmi receptormi typu I, nazvaj sa box 1 (bli~aie kcytoplazmatickej membrne, je zlo~en z8 aminokyseln a bohat na proln) abox 2. Box 1 svis viacej saktivciou receptoru, box2 viacej sasociciou sJAK  tie sa sem via~u prostrednctvom svojej N koncovej

asti252. Vysvetlivky: IL-4Ra - reeazec apecifick pre vzbu IL-4; IL-13Ra1  reeazec apecifick pre IL-13; IL-13Ra2  reeazec klamlivho receptoru pre IL-13 (typ 2 receptor pre IL-13); JAK1, JAK3, TYK1  kinzy zo skupiny JAK; IRS-2  proten substrtu pre inzulnov receptor 2, ktor aktivuje drhy vedce kprolifercii atie~ fosforyluje DNA via~uci proten HMG-I/Y (moduluje transkripciu vlokuse Ce); SHC  SH2 obsahujci transformujci proten, je tzv. adaptorov proten, ktor aktivuje MAPK signlnu drhu; oba tieto proteny interaguj styroznom vpozcii 497; SHP-1 (SH2 obsahujca tyrozn fosfatza 1)  via~e sa na piaty na obrzku znzornen tyrozn anegatvne reguluje signalizciu tmto receptorom253.

3.3.1.4 Signlna drha STAT6

Ako u~ bolo nazna en, tak STAT6 je zapojen do signlnej drhy indukovanej IL-4 alebo IL-13. Receptor pre IL-4 patr do skupiny cytoknovch receptorov typu 1(vi preh>ad 249). IL-4 m mo~nose signalizovae prostrednctvom 2 receptorov (Obr. 13).



Obr. 14 IL-4 - STAT6 signlna drha. Na obrzku je znzornen signlna drha IL-4  STAT6, farebn zna enie zodpoved obrzku

. 13. Po naviazan IL-4 na jeho apecifick receptorov reeazec dochdza kdimerizcii receptoru, ten sa aktivuje, dochdza kvzjomnej transfosforylcii kinz JAK atie vytvoria dokovacie miesto pre STAT6. Dochdza kfosforylcii STAT6, ten sa nsledne dimrizuje, translokuje do jadra, kde sa via~e na STAT6 apecifick sekvencie (GAS elementy) avkomplexe s nuklernymi faktormi spaea transkripciu.

Typ 1 IL-4 receptoru je zlo~en zIL4-Ra agc reeazca (be~n reeazec cytoknovch receptorov) aje apecifick prve pre IL-4. Je exprimovan hlavne vhematopoetickch bunkch, na T iB bunkch. Typ 2 receptor (taktie~ zvan ireceptor typ pre IL-13) je spolo n pre IL-4 iIL-13, je zlo~en z IL4-Ra aIL-13Ra1.Nachdza na povrchu rznych buniek, zlymfocytov ho vaak exprimuj len B bunky. Druh receptor pre IL-13 je zlo~en zIL-13a2reeazca, ktormu chba intracelulrna

ase atak neprenaa signl  funguje ako  klamliv (decoy) receptor areguluje tak IL-13 indukovan signalizciu250,251.

IL-4 apecificky rozpoznva IL-4Ra apreto typ 1 IL-4 receptoru via~e len IL-4. Po jeho naviazan djde kdimrizcii receptorovch jednotiek (IL-4Ra sgc reeazcom)

m dochdza ktesnmu pribl~eniu sa kinz triedy JAK. JAK1 je asociovan s IL-4Ra a JAK3 je asociovan s gc reeazcom. Vreakcii na toto JAK fosforyluj sam seba alebo seba navzjom. Aktivovan JAK nsledne fosforyluj apecifick tyrozny IL-4Ra reeazca, jedn sa konkrtne oY575, Y603 aY6033 >udskho IL-4 receptoru. Tieto tyrozny predstavuj  prstavn / dokov miesto pre STAT6, ktor sa sreceptorom asociuje prostrednctvom jeho SH2 domny adochdza tak kfosforylcii konzervovanho Y641. Valaom kroku dochdza kdimrizcii STAT6 monomrov  fosforylovan Y641 jednho STAT6 interaguje sdomnou SH2 druhho monomru. Dimry STAT6 s nsledne prenesen do jadra avia~u sa na GAS elementy (sekvencie aktivovan IFNg), vprpade STAT6 dochdza krozpoznaniu TTCN4GAA sekvencie237,preh>ad 251,254, preh>ad 255. Tto konsenzusov sekvencia pre STAT6 m~e uprostred obsahovae 3 alebo 4 nukleotidov medzernk256,257. alam spresnenm sa zistilo, ~e na zklade palyndrmovho rozarenia konsenzusovej sekvencie, m~e STAT6 rozliaovae tieto sekvencie: TTC CNNG GAA aTTC ANNT GAA pre miesta so sekvenciami obsahujcimi 4 nukleotidy uprostred, a alej CTTC NNN(N) GAAG aTTTC NNN(N) GAAA s3 alebo 4 nukleotidmi uprostredpreh>ad 228. Celogenmov analza skmajca gny regulovan STAT6 zistila, ~e vT bunkch a~ 79% miest pre vzbu STAT6 obsahovalo konsenzusov sekvencie  50% znich obsahovalo 4 nukleotidov medzernk a23% ich obsahovalo 3 nukleotidov medzernk258. STAT6 teda omnoho viacej preferuje sekvenciu s4 nukleotidovm medzernkom, pri om ~iadny zalach testovanch STAT sa na takto sekvenciu neviazal259. ZroveH bolo zisten, ~e 66% vzbovch miest pre STAT6 sa nachdza vo vntri gnov (hlavne vprvch dvoch intrnoch), zvyaok je pred atartom alebo za koncom transkrip nho miesta258.

3.3.1.5 Aktivcia transkripcie zvislej na STAT6

Ike STAT6 je apecifick faktor potrebn kspusteniu tvorby IgE, len jeho samostatn naviazanie sa do oblasti promtora Ce nesta , je nutn vzba aspoluprca salami jadrovmi atranskrip nmi faktormi. Voblasti o rozsahu 20  90 nukleotidov pred Ie exnom sa nachdzaj postupne IL-4 reponzibiln element (IL-4RE - miesto naviazania pre STAT6 so apecifickou TTCN4GAA sekvenciou), miesto pro PU.1, dve miesta pre naviazanie NF-kB (NF-kB1 a NF-kB2) amiesto pre BSAP. Pred vzbovm miestom pre STAT6 je eate miesto pre naviazanie sa C/EBP-b, vpozcii -105  -96 pred miestom za iatku transkripcie eGLT. Samotn transkripcia je vsledkom funk n synergie medzi STAT6 a C/EBP-b, tto je zvisl na interakcii ich TAD ike priama interakcie STAT6 C/EBP-b nebola dolo~en. Prtomnose C/EBP-b pravdepodobne pomha stabilizovae vzbu STAT6preh>ad230. Ce promtor je tie~ aktivovan isignalizciu zCD40  pomocou NF-kB. Jedn sa oskupiny transkrip nch faktorov, ktor synergicky sSTAT6 aktivuj transkripciu, pri om neporuaen vzbov miesta v Ce s nevyhnutn pre transkripciu. Tieto faktory pravdepodobne zvyauj afinitu STAT6 kIL-4RE afyzicky priamo kontaktuj STAT6. Do prvho miesta (NF-kB1, proximlne od IL4-RE) sa via~e klasick komplex NF-kB zlo~en zp50/65 heterodimrov ado druhho miesta (NF-kB2) sa via~e heterodimr p50/relB28,230. Vexperimente zameranom na Ce promtor bolo zisten, ~e bodov mutcia vmieste pre NF-kB2 vedie kvraznmu zn~eniu odpovede na stimulcii IL-4, obdobn mutcia v NF-kB1 naopak aktivitu promtora zvaila. NF-kB2 m teda dle~it vznam, ale pre spustenie transkripcie mus interagovae so STAT6260. Transkripciu podporuje iBSAP, pri jeho over-expresii dochdza kzvaenmu IgE izotypovmu preskoku261. Promtor je taktie~ regulovan transkrip nm faktorom PU.1, apecifickm pre monocyty, ktor spolupracuje so STAT6. Miesto pre PU.1 sa nachdza pred NF-kB1, pri om ich vzbov miesta sa

iasto ne prekrvaj (sekvencia GGGAA). Mutcia miesta pre PU.1 alebo pre NF-kB2 nemala ~iadny alebo len minimlny vplyv na transkripciu po stimulcii IL-4, mutcia oboch miest zroveH zruailo vplyv IL-4 na transkripciu262. Jednou zhlavnch loh transkrip nch faktorov je prilkae apecifick transkrip n faktory, ktor modifikciou histnov podporuj transkripciu apremoseuj enhancr stranskrip nm komplexom  dochdza tak ktvorbe tvz. enhaceozmu. Za be~nch okolnost je na oblase IL-4RE naviazan PARP-14,

len rodiny poly-ADP ribza polymerz, ktor na seba via~e histn deacetylzy HDAC2 a3. Vtomto stave je gn neaktvny. Po naviazan sa STAT6 na IL-4RE, modifuje PARP-14 seba iHDAC2, HDAC3 (anavyae iprtomn p100), dochdza kich disocicii,

m umo~Huj aktivciu gnu. STAT6 nsledne prilka koaktiva n proteny komplexu p300/CBP pri omsCBP asociuje pomocou svojej C terminlnej

asti28. Venhaceozme sa taktie~ nachdzaj ikoaktivtory patriace doskupiny jadrovch koaktivtorov p160 steroidovho receptora (NCoA), vprpade STAT6 sa jedn oNCoA1, interagujci sC terminlnou domnou STAT atto asocicia je zvisl na LXXLL motve TAD vSTAT6263. Na koaktivcii transkripcie riadenej STAT6 sa nepriamo z astHuje iNCoA3, ktor sa nevia~e na STA6 ale na p300. Vtomto komplexe sa nachdzaj iu~ spomenut p100/SND1 (obsahujci stafylokokov nuklezov atudorov domnu 1) aRNA helikza A (rekrtovan prostrednctvom SND1), ktor je naviazan prve na p100. Proten p100 pomocou svojej SN-podobnej domny interaguje sTAD STAT6 ataktie~ asociuje sve>kou podjednotkou RNA polymerzy II,

m vytvra premostenie medzi komplexom polymerzy aSTAT628,264,265.

3.3.1.6 Polymorfizmy v STAT6 Vroku 1996 bola prv krt popsan asocicia lokusu 12q shladinou celkovch IgE asastmou185. Od tej doby bola venovan ve>k pozornose vskumu vplyvu polymorfizmov aich haplotypov vSTAT6 na hladinu IgE avskyt astmy,

o potvrdzuje ifakt, ~e STAT6 patr do skupiny nieko>ko mlo gnov, uktorch bola tto asocicia potvrden v6  10 replika nch atdich217.

Neprekladan oblase STAT6 na 5konci obsahuje nieko>ko polymorfizmov, do centra pozornosti sa dostali naprklad GT repetcie (rs71802646) popsan Tamurom aspol.266 vJaponskej populcii, kde alela nesca 13 GT opakovan (a hlavne potom 13/15GT heterozygotn genotyp) bola asociovan svskytom alergickch chorb (astma, atopick ekzm apotravinov anafylaxia). Alela (GT)13 vaak vJaponskej populcii nebola asociovan shladinou IgE. Vnemeckej populcii zase (GT)17 alela vykazovala trend zvyaovae hladinu IgE, alej mala signifikantn vplyv na eozinofliu, avaak s astmou alebo BHR nebola tto alela asociovan267. Vbritskej populcii bola alela (GT)13 vasocicii satopickou astmou no a alela (GT)16 bola recipro ne vrazne

astejaou medzi osobami sneatopickou astmou268. Nagarkatti aGhosh268 popsali ala GT repeti n polymorfizmus vSTAT6 promtore, ozna ili ho ako R1 aalej popsali alelov frekvencie GT polymorfizmu vexne

. 1 STAT6 (ten si ozna ili ako R3). Vnslednej atdii naali Nagarkatti aspol.269 asociciu 16 GT repetci vR3 a15 GT repetci vR1 sastmou vindickej populcii. 16 repetci GT vR3 malo negatvnu asociciu vindickej populcii. Funk nou analzou Gao aspol.268 zistili, ~e (GT)13 alela vexne

. 1 (lokus R3) vykazovala najvyaaiu promtorov aktivitu vporovnan skratami

i dlhami alelami. ZroveH vyslovili hypotzu, ~e

m dlhaia alela, tm m~e mae relatvne stabilnejaiu vzbu na nuklerne faktory. Sprihliadnutm kefektu GT repetci vinch gnoch, Gao aspol.268 vyslovili domnienku, ~e tieto repetcie by mohli ovplyvHovae formciu sekundrnych atruktr DNA ateda iviazanie transkrip nch faktorov.

Celognovm sekvenovanm odhalili Duetschov aspol.267 (mimo in) i3 polymorfizmy vintrne

. 2: rs167769, rs324012 and rs324011. Ike ani jeden znich nebol asociovan sastmou, tak polymorfizmus rs324011 bol asociovan shladinou IgE vnemeckch populcich267,270,271, avak nie vo fnskej populcii272. Vplyv tohto polymorfizmu skmali iHuang aspol.273, asociciu shladinou pecifickch IgE nenali. Prekvapivo vak popsali asociciu alely C (normlna wild type alela) salergiou na peniciln asurtikou. Schedel aspol.270 vo svojej prci po ta ovou analzou sekvenci STAT6 zistili, ~e vintrne

. 2 sa nachdzaj 2 pravdepodobn miesta pre vzbu NF-kB a polymorfn alela rs324011 SNP je zodpovedn za tvorbu distlnejaieho znich. Vnslednej funk nej atdii preukzali, ~e tto alela je zodpovedn za zven tvorbu IgE229.

Leung aspol.274 posudzovali asociciu polymorfizmov piatich gnov svskytom astmy vich populcii avyetrovali ipolymorfizmy T1309C (rs841718) aC1507T (rs3024974) vSTAT6. Polymorfizmus C1507T svznamnou mierou vtejto populcii ovplyvHoval pokles FEV1 (spirometrick merania boli uskuto nen sro nm odstupom). Tento SNP vaak nebol vasocicii sIgE v nskej populcii vpredchdzajcej atdii tchto autorov275 aani vbeloaskch populcich nemeckho pvodu270. Avaak alaia atdia na nemeckej populcii popsala slabo signifikantn vplyv T1309C asiln vplyv C1507T na hladinu IgE267. Polymorfizmy, ktor by eventulne mohli ovplyvHovae STAT6 funkciu sa nachdzaj iv3UTR. Duetsch aspol.267 skmali 5 takchto polymorfizmov, pri om zistili vznamn vzbu 3UTRSNP3 (rs1059513) sBHR a 3UTRSNP4 (rs4559) shladinou IgE. Vpopulcii

nskych det nebola njden ~iadna asocicia sastmou, bola vaak zisten vznamn interakcia medzi tromi SNP - GT repetcie v intrne

. 1, C258T (rs4559) a T710C (rs324015) v nskej populcii276. Vo framingtonskej GWAS atdii bol njden signifikantn vplyv rs1059513 na dysregulciu IgE277.

Vtejto oblasti sa nachdza eate jeden, extenzvne skman polymorfizmus - 2964 G>A SNP (rs324015). Gao aspol.278 ho asociovali shladinou IgE alebo miernou atopickou astmou vjaponskej populcii, avak bez asocicie zostal tento polymorfizmus vprpade vznamnej astmy (det idospelch) a to vjaponskej ibritskej populcii. V japonskej populcii bol vak tento polymorfizmus asociovan seozinofliou, detskm atopickm ekzmom apotravinovou alergiou279. Vpopulcii britskch det taktie~ nebola potvrden asocicia shladinou IgE, bola zato ale njden vznamn spojitose spotravinovou alergiou proti orieakom280. Naproti tomu, ~iadna asocicia nebola njden sastmou

i atopiou vnemeckej,

nskej alebo fnskej populcii267,272,281. Vzh>adom na tieto vsledky mo~no predpokladae najviac tak nepriamy vplyv polymorfizmov v3UTR na STAT6276.

3.3.2 ADAM33 ADAM33 je prvm gnom asociovanm svskytom astmy, ktor bol identifikovan pomocou pozi nho klonovania, na zklade vsledkov predchdzajcej celogenmovej asocia nej atdie126. loha ADAM33 vpatogenze astmy bola nsledne extenzvne atudovan, samotn ADAM33 patr medzi nieko>ko mlo gnov, ktorch asocicia sastmou bola speane replikovan vo viac ne~ 10 replika nch atdich217. Jeho dle~it lohu pri vzniku astmy alebo BHR zvrazHuje aj jeho expresia vdchacch cestch aalej ivznam pri embryonlnom vvoji dchacej sstavy  je preferen ne exprimovan vp>cach vpriebehu tzv.  vetviacej sa morfogenzy (branching morphogenesis) asugestvne tak m dle~it lohu vEMTU.

3.3.2.1 `truktra ADAM33 ADAM33 patr do rodiny pribli~n 40 protenov sdizintegrnovou ametaloproteinzovou aktivitou (z angl. A Disintegrin And Metalloproteinase), ktor sa z astHuj rznych biologickch procesov. Samotn gn pre ADAM33 sa nachdza voblasti 20p13 a je tvoren 22 exnmi, ktor s preruaen 21 intrnmi adlh viac ne~ 14 kb. Cel kdujca sekvencia dohromady m d:~ku 2541bp, z oho 87bp tvor 5UTR a 2442 bp kduje vlastn sekvenciu ADAM33 od:~ke 813 aminokyseln282.

Ike sa exny (a analogicky potom iintrny) pod>a systematickho prstupu ozna uj

slom vzostupne vsmere 5! 3, tak ADAM33 ztohto poh>adu predstavuje vnimku. Vdobe objavu ADAM33 apopisu jeho atruktry si autori ozna ili exny vuvedenom smerovan pomocou psmeniek abecedy126. Pod>a klasickho (systematickho) postupu maj i intrny svoje ozna enie  dohodou sa intrny ozna uj skratkou IVS, za ktorou sa pripoj

slo exnu, po ktorom dan intrn bezprostredne nasleduje. Vprpade ADAM33 sa intrny ozna uj kombinciou psmeniek ozna ujcich exny, medzi ktormi dan intrn le~. Svyu~itm tohto postupu potom napr. medzi exnmi  S a  T le~ intrn  ST (Obr.15). Toto ozna enie, ike zpoh>adu s asne platnej nomenklatry vmolekulrnej genetiky  netradi n , sa v~ilo astle sa pou~va. Toto je vidiee hlavne vprpade ozna ovania polymorfizmov, ktor je doposia> silne v~it apou~van, kedy meno polymorfizmu je tvoren psmenom ozna ujcim exn/intrn, vktorom sa nachdza, spripojenm

sla pod>a polohy, vktorej s tieto polymorfizmy postupne v rade za sebou ulo~en vsekvencii gnu (Obr. 15).

3.3.2.2 `truktra ADAM33 protenu ADAM33 patr do rodiny ADAM protenov, ktor tvor podskupinu super rodiny metaloproteinz zvislch od Zn283. Svoj nzov maj odvoden od 2 funk nch domn (dizintegrnov ametaloprotezov domny), ktor zdie>aj so svojimi najbli~ami prbuznmi  PIII trieda metaloproteinz hadieho jedu (SVMP). Vaetky proteny skupiny ADAM maj rovnak organizciu, obsahuj signlnu sekvenciu, prodomnu adomny: katalytick (metaloprotezov), dizintegrnov, na cysten bohat, EGF (epidermlny rastov faktor) podobn, transmembrnov acytoplazmatick (obr. 16). Tak ako iniektor alaie ADAM proteny, tak iADAM33 obsahuje konsenzusov sekven n motv HEXGHXXGXXHD pre vzbu zinku vich metaloproteinzovej domne, ktor je potrebn pre ich katalytick aktivitu284.



Obr. 15. Organizcia ADAM33 ajeho polymorfizmy. Na obrzku je znzornen atruktra exnov aintrnov ADAM33. alej je ozna en pozcia polymorfizmov, ktor boli

asto sledovan vreplika nch atdich aktorch asocicia sa zroveH posudzovala v eskej populcii.

Signlna sekvencia je umiestnen na N  konci protenu aje dle~it pre nasmerovanie ADAM protenov do sekrtorickch drh. Prodomna nasleduje hne za signlnou sekvenciou aje dle~it pre maturciu ADAM bielkovn. Primrnou funkciou prodomny je udr~ovae metaloprotezov domnu vinaktvnom stave. in tak prostrednctvom cystenovho preskoku, kedy konzervovan cysten prodomny interaguje saktvnym miestom protenu pre zinok. Sekundrnou lohou prodomny je funkcia aapernu aje tak zodpovedn za poskladanie ADAM protenu do sprvnej konformcie,

o sa tka hlavne metaloprotezovej domny. Metaloprotezov domna (MP) ADAM33 je aktvna, m proteolytick aktivitu. Jej aktvne miesto obsahuje atmy zinku avody potrebn pre hydrolytick procesy atieto molekuly s vo vzjomnej koordincii s3 konzervovanmi histidnmi adistlnejaie ulo~enm metionnom. Katalytick miesto MP je do ve>kej miery konzervovan, ike je uka~dho aktvneho ADAM trochu in  tento rozdiel vatruktre by mohol svisiee so substrtovou apecifickoseou285. Medzi substrty ADAM33 patr mimo in inapr. beta amyloidn prekurzor APP286. Dizintegrnov domna (DD) m svoj nzov odvoden od toho, ~e je taktie~ prtomn vatruktre SVMP, kde s zapojen do vzby integrnovch receptorov krvnch doati iek. Blokovanm tchto receptorov nedochdza k vzbe ich prirodzench ligandov ako je naprklad fibronektn,

o vedie kinhibcii tvorby agregcie doati iek vmieste poranenia. Za interakciu sfibronektnom je zodpovedn konsenzusov RGD sekvencia 13 aminokyseln vtzv. dizintegrnovej slu ke amnoho ADAM protenov zdie>a RX6DEVF sekvenciu. V aina ADAM protenov sa m~e vaka tejto sekvencii viazae na a9b1 integrny. Interakcia stmito integrnmi m vznam vo fzii buniek, ako bolo zisten naprklad v prpade ADAM12 a a9b1 vprocese diferencicie myognnych prekurzorov. Vznam EGF podobnej domny adomny bohatej na cysten (CRD) nie je plne jasn. Je vaak pravdepodobn, ~e CRD doplHuje funk ne DD azroveH by mohla dodvae apecifickose interakcim riadenm pomocou DD. Pri posudzovan vlastnost CRD m vaak pravdepodobne najv a vznam jej schopnose fungovae ako apecifick ligand pre syndekany (adhzne molekuly). Predpoklad sa, ~e iEGF podobn domna by mohla mae vznam vbunkovej adhzii. Cytoplazmatick koniec ADAM protenov je silne variabiln vsekvencii id:~ke apredpoklad sa, ~e m lohu vregulcii metaloprotezovej aktivity abunkovej signalizcie riadenej zvntra buniek smerom von alebo vkontrole maturcie asubcelulrnej lokalizcie tchto protenov285. ZroveH m~e predstavovae vzbov miesto pre proteny asociovan scytoskeletom46.

 Obrzok 16. `truktra protenu ADAM33 Obrzok znzorHuje atruktru ADAM33 vo vzeahu kodpovedajcim exnom ADAM33, ktor kduj jednotliv domny. sla ozna uj poradia aminokyseln na rozhran domn, je znzornen i3UTR. erven hviezda ozna uje miesto vzby zinku amiesto konsenzusovej sekvencie je pod iarknut. MD  metaloprotezov domna, DD  dizintegrnov domna, CRD  domna bohat na cysten, EF  domna spodobnoseou kEGF, TD  transmembrnov domna.

3.3.2.3 Isoformy ADAM33 amo~n funkcie protenu ADAM33

ADAM33 m nieko>ko izoforiem. Medzi hlavn patr a-izoforma, ktor je vytvoren pod>a celej cDNA. Naproti tomu b-forma je vytvoren na zklade alternatvnoho zostrihu svynechanm exnu

. 17 (exn Q), vdsledku

oho vtejto forme chba 26 aminokyseln na rozhran CRD aEGF podobnej domny284. alaou (predpokladanou) izoformou je pravdepodobne sekrtovan varianta, sADAM33, ktor vznik delciou 37 bp vexne R,

m dochdza kposunu

tacieho rmca avznik proten bez transmembrnovej jednotky.

Expresia ADAM33 bola pozorovan vrozli nch >udskch tkanivch (mimo tkanivo pe ene), no relatvne najvyaaia expresia pri vyaetren adultnch tkanv bola zisten vp>cach, slezine, cievach aplacente284. Vdchacch cestch je expresia ADAM33 obmedzen na mezenchmov bunky a u~ Eerdewegh aspol.126 pozorovali prtomnose ADAM33 len vp>cnych fibroblastoch ahladkom svalstve bronchov, avaak nie vepitelilnych bunkch. Nortern blotovou analzou objavili prtomnose dvoch transkriptov ove>kosti 5 a3,5 kb. 5kb transkript nebol prtomn vcytoplazme apreto pravdepodobne predstavuje formu snevystrihnutmi intrnmi, nako>ko 3,5 kb produkt obsahuje vaetky exny ADAM33.

 Obr. 17. Varianty ADAM33 Vysvetlivky: SS  signlna sekvencia; PD  prodomna; CRD na cysten bohat domna; DD  dizintegrnov domna; EPD  domna spodobnoseou kEGF; TD  transmembrnov domna; CD  cytoplazmatick domna (upraven pod>a Holgate ST aspol.288).

Svskytom astmy boli spojen i intrnov polymorfizmy vADAM33,

o logicky viedlo kpredpokladu, ~e by mohli ovplyvHovae zostrih gnu atak ovplyvHovae jeho expresiu,

i poprpade viese kvzniku rznych izoforiem ADAM33. Tto hypotza viedla k inorodmu vskumu zameranmu na miesto expresie iprtomnose izoforiem ADAM33. Mimo prv dve hlavn izoformy aab284, bola vexpresnej analze vzoriek zbronchilnej biopsii zisten prtomnose ialach izoforiem ADAM33. Powell a spol282 vnej pozorovali prtomnose 2 foriem ADAM33 obsahujcich dlh D exn  ten bol pred:~en prtomnoseou 39 bp,

m sekvencia prodomny bola obohaten o13 aminokyseln. Obom variantom ADAM33 vaak chbala funk n MD. alaia analza zameran na prtomnose jednotlivch exnov / domn odhalila zaujmav skuto nose asce, ~e izoformy stakmer kompletnm reeazcom obsahujce iMD s exprimovan len vmalej miere. Anavyae,napr. mRNA pre predpokladan sADAM33 formu tvorila len pribli~ne 2% zo vaetkch izoforiem detegovanch vp>cnych fibroblastoch. Vaetky novo identifikovan izoformy ADAM33 nekdovali funk n MD (Obrzok 17). Proximlna

ase MD (exny G aH) bola prtomn len vizoformch sdlhm exnom D afunk n MD bola prtomn len u menej ne~ 5% vaetkch detegovanch izoforiem282. Analza mRNA transkriptov ADAM33 vcytoplazme ajadre priniesla ala zaujmav poznatok, preto~e a~ 90% vaetkch transkriptov sa nachdzalo vjadre. Vcytoplazme sa vo v aom mno~stve nachdzala mRNA pre izoformy kdujce proteny sMD aalej bol detegovan iamplikn zodpovedajci sADAM33. Vcytoplazme nebola detegovan forma sdlhm exnom D  tto bola len vjadre avykazovala pomerne dlh ~ivotn pol as abude tak najskr predstavovae jadrov zostrihov predformu. alaie detegovan izoformy mali relatvne rovnak zastpenie voboch sledovanch kompartmentoch. Western blotov analza bola vyu~it kzisteniu,

i detegovan mRNA s itranslatovan. Pomocou tejto analzy bola zisten prtomnose 120 kD bielkoviny (nematurovan produkt) a alej bielkovn ove>kosti 100 kD (odpovedajcej maturovanmu protenu), 37 kD - naj astejaia zforiem bez MD (zodpoved klonu 1 zobr. 17) anakoniec skupina bielkovn ove>kosti 50  60 kD, ktor zodpovedali klonom 3  6 (obr. 17) schbajcou funk nou MD. b-forma ADAM33 tvorila a~ 30% vaetkch transkriptov a mala rovnomern zastpenie vcytoplazme ijadre282. Je znma svojou mo~noseou inhibcie maturcie ADAM33 ateda by mohla mae dominantne negatvny efekt na protezov aktivitu289. Analogicky ksitucii sADAM19, by izoforma bez signlnej sekvencie mohla mae vlastnose cytoplazmatickej lokalizcie290. Zostrihov varianty, ktorm chbaj prodomna aMD, s atruktrne podobn syntetickmu ADAM12-S, ktor je in vivo schopn vyvolvae myogenzu291.

Tento autorsk kolektv nsledne atudoval vznam ADAM33 pri vzniku astmy, sledovali jeho expresiu vzdravch, astmatickch afetlnych p>cach287. Itto atdia odhalila prtomnose viacerch izoforiem ADAM33, jednalo sa oformy shmotnoseou 22, 37, 50 a65 kD, pravdepodobn sADAM33 izoforma vaak vcytoplazme nebola njden. Analza materilu zfetlnych p>c naala navyae eate 25 kD formu287. Vhladkej svalovine dchacch ciest boli detegovan iformy aab, pri om b forma bola prtomn vmenaej miere vporovnan spredchdzajcom experimente, ktor ale atudoval primrne fibroblasty282. Imunohistochemick vyaetrenie materilu zbronchilnych biopsi lokalizovalo udospelch osb ADAM33 do hladkho svalstva aizolovanch buniek submukzy, spolo ne sa-aktnom hladkch buniek287. Vprpade analzy fetlnych p>c (materil zI. trimestrlnych potratov, 8.  10. g.h.) bol ADAM33 prtomn okolo bronchilnych tubulov, bol vaak prtomn vairaom okol - vnediferencovanom mezenchme ne~ a-aktn hladkch buniek287. Lokalizcia vzvzkoch hladkch svalov avokol fetlnych bronchov teda nazna uje dle~it lohu pri vvoji p>c (bronchilne, neurlne ivaskulrne atruktry) ateda ipotencilny vplyv na  modelciu dchacch ciest sich nasmerovanm kastmatickmu fenotypu. Vtejto atdii nebola zisten lokalizcia ADAM33 vepitely dchacch ciest aalej nebol ani zisten vznamn rozdiel mRNA foriem ADAM33

i izoforiem ADAM33 medzi astmatikmi akontrolami287. Vznamnm poznatkom postupne rozairujcim ur ite rozsiahlu akomplexn mozaiku funkci ainterakci ADAM33 vdchacch cestch, pri ich vvoji a pri vzniku astmy, je izistenie toho, ~e tento proten sa neobjavuje vepitely dchacch ciest ato inapriek nieko>km prcam popisujcim jeho vskyt vtejto lokalite292,293. Yang aspol.294 sa zamerali prve na expresiu ADAM33 celkovo, sledovali distribciu tejto expresie asvyu~itm ibioinformatickch prstupov analyzovali predpokladan promtor ADAM33. Jeho umiestnenie sa predpoklad voblasti -550  +80 vzh>adom kmiestu transkripcie. Zistili, ~e promtor vtejto oblasti bol skuto ne transkrip ne aktvny a predpokladan CpG ostrov ek (ur en na zklade bioinformatickej analzy) le~iaci voblasti -362  +80 bol hypermetylovan vbunkch epitelu anaopak hypometylovan vo fibroblastoch exprimujcich ADAM33. Kdemetylcii promtora vADAM33 nedoalo ani po expozci epitelilnych buniek efektu 5-aza-2-dezoxycytoznu (demetyla n

inidlo). Vplyvom TGF-b1 na epitel docielili jeho epitelovo-mezenchymlny prechod (z angl. EMT  epithelial-mesenchymal transition), bunky vykazovali redukovan expresiu epitelovch azvaen expresiu mezenchmovch markrov (napr. metaloproteinz), no expresia ADAM33 nebola pozorovan aani ADAM33 promtor nebol hypometylovan. S asne porovnali expresiu (bez skmania izoforiem) ADAM33 vo vzorkch od 15 osb sea~kou astmou as8 kontrolami anenaali ~iadny signifikantn rozdiel medzi porovnvanmi skupinami. Autori na zklade tchto vsledkom usdili, ~e je nepravdepodobn, aby poruaen regulcia expresie ADAM33 vepitelovch bunkch prispievala kpatogenze astmy294. Predchdzajce nlezy ADAM33 vepitely si vysvet>ovali napr. i skr~enou reaktivitou protiltok, ktor pozorovali ioni sami (napr. scytokeratnmi). alam kskom do mozaiky lohy ADAM33 pri astme bol nlez 55 kD solubilnej formy ADAM33 (sADAM33) vo vzorkch zbroncho-alveolrnej lav~e (BAL) vprpade osb sastmou avaak nie uzdravch kontrol, pri om mno~stvo sADAM33 inverzne korelovalo so stupHom astmy ishodnotou FEV1% pri spirometrickom vyaetren292. sADAM33 m MD apreto by mohol vyu~val metaloprotzov aktivitu ina substrty, ktor s membrnovm formm odopret. Nako>ko prtomnose sADAM33 vdsledku alternatvneho zostrihu nebola pozorovan vbec287 alebo len minimlne282, tak sa Puxeddu aspol.295 zamerali na mo~nose vskytu ektodomnovho zhadzovania (z angl. ectodomain shedding) u ADAM33, tak ako to bolo preukzan napr. v prpade adam13 ~iab rodu Xenopus296. Vo svojom experimente na rekombinantnch bunkch zistili prtomnose 55 kDa ADAM33 (sADAM33), bez prtomnosti prodomny (teda katalyticky aktvna forma) ateda tento proten vznik spracovanm ektodomny snslednou posttransla nou glykozylciou295. Aeate mimo spontnne odhadzovanie ektodomny, nrast indukovanho odhadzovania ektodomny ADAM33 bol pozorovan po expozci TGF-b2, pri om tento efekt bol zvisl

asovo iod koncentrcie TGF-b2. Svyu~itm vysoko purifikovanho protenu zistili, ~e MD vADAM33 m schopnose ve>mi rchlo vyvolae diferenciciu endotelilnych buniek in vitro azroveH stimulovala tvorbu novch ciev vex vivo iin vivo prepartoch295. Angiogenza je zvaen udetskch idospelch astmatikov, koreluje so zn~enou funkciou p>c asamotn sADAM33 by tak mimo in mohol zaiseovae potrebn v~ivu pre rozvjajce sa hladk svalstvo. Vposlednej dobe sa uva~uje, ~e po iatky astmy je nutn h>adae u~ prenatlne aisamotn ADAM33 je exprimovan vo fetlnych p>cach. Haitchi aspol.297 zistili, ~e kvraznmu zvaeniu expresie ADAM33 dochdza 2x vpriebehu vvoja p>c (v dobe skorho pseudoglandulrneho atdia atesne po prode) aIL-13 vrazne suprimuje mRNA zADAM33. Na myaom modely potom zistili, ~e alergick stav vyvolan umatky viedol taktie~ ksupresii Adam33 mRNA, avaak doalo kzvaeniu mno~stva spracovanho ADAM33. S asne bola pozorovan iprtomnose nieko>kch malch izoforiem spodobnoseou ksADAM33297. Fyziologick funkcie ADAM33 ani jeho presn zapojenie do patogenzy astmy nie s plne jasn. Funkcie ADAM33 mo~no odvodzovae na zklade jeho similarity kalam ADAM protenom, hlavne

lenom podskupiny, do ktorej patr  tto tvoria ADAM12, ADAM13 aADAM19. Funkcie protenu je tak mo~no posudzovae na zklade jeho domn, porovnanm sich homolgmi v ADAM protenoch so znmou funkciou. alam vodtkom kpochopeniu lohy ADAM33 vprocese vzniku astmy je iprtomnose rznych izoforiem ADAM33 azroveH iprtomnose solubilnej formy ADAM33. Prtomnose sADAM33 vo forme pravdepodobne

iasto ne degradovanho protenu ove>kosti 25 kDa bola pozorovan iupacientov sp>cnou sarkoidzou,

o nazna uje lohu sADAM33 vprocese rozvoja zpalu aremodelcii dchacch ciest vo vaeobecnosti anie len pri astme298.

3.3.2.4 Polymorfizmy v ADAM33

ADAM33 je prvm gnom asociovanm sastmou, ktor bol identifikovan pozi nm klonovanm. Eederwegh aspol.126 pri celogenmovom screeningu naali asociciu astmy soblaseou 20q13 apri nslednej analze polymorfnch markrov naali dva signly vo vntri ADAM33. Sekvenovanm tohto gnu identifikovali celkom 55 jednonukleotidovch polymorfizmov (SNP), pri om 14 znich bolo asociovanch svskytom astmy vkaukazskej populcii (skupina zUK, skupina zUS aspojen skupina), no distribcia asociovanch SNP vjednotlivch skupinch avkombinovanch dtach bola rzna. Preto~e predpokladali kumulatvny vplyv identifikovanch polymorfizmov na funkciu ADAM33 atm aj na vznik astmy, uskuto nili eate haplotypov analzu (kombinciu v~dy 2 SNP do haplotypu) zpolymorfizmov, ktor boli samostatne asociovan sastmou. Tieto zaujmav vsledky vzbudili ve>k zujem oatdium lohy ADAM33 pri vzniku astmy, mno~stvo prc sa poksilo asociovae SNP vADAM33 sastmou vrznych populcich. Prvou atdiou, ktor speane replikovala asociciu SNP vADAM33 bolaatdia na vzorku nemeckej populcie299. Vprpade familirneho vskytu boli sastmou asociovan F+1, ST+4 aST+5 polymorfizmy. Niektor ztchto SNP boli eate s asne spojen aj selevciou hladiny celkovch IgE (F+1, ST+5), sBHR (F+1, S2) alebo sfenotypom astma + BHR (F+1, S2). Pri posudzovan skupiny prpadov/kontrol bol sastmou asociovan polymorfizmus ST+7 asBHR polymorfizmus ST+5. Haplotypov analza (dvoj- atrojlokusov kombincia) vskupine sfamilirnym vskytom ochorenia asociovala 1 haplotyp sastmou aalach 5 haplotypov sBHR299. Spojitose medzi SNP ADAM33 avskytom astmy sa pokaali njse aj Lee aspol.300 vsbore krejskch astmatikov. Uskuto nili genotypizciu piatich polymorfizmov zo14 pvodne asociovanch polymorfizmov126  S1, T1, V_1 V1 aV4. V skupine 326 astmatikov a151 kontrol sa im vaak nepodarilo njse signifikantn rozdiel vdistribcii SNP ani haplotypov medzi skmanmi skupinami a ani vzbu na hladinu IgE. Jedinou vnimkou bola vzba T1 polymorfizmu ahaplotypu h4 na hladinu BHR vyjadrenej pomocou PC20 (pokles FEV1 o20% pri provokcii metacholnom)(ref.300). Hirota aspol.301 skmali vplyv SNP ADAM33 na vskyt astmy dospelch osb v sbore 504 astmatikov a651 kontrol zjaponskej populcie. Pomocou sekvencie identifikovali celkovo 48 SNP, zktorch 29 u~ predtm popsal Eederwegh aspol.126 Do asocia nej analzy zaradili 14 polymorfizmov, pri om signifikantn asociciu sastmou vdospelosti vykazoval polymorfizmus T1 apo korekcii vzh>adom kpo tu analyzovanch SNP bola njden ihrani n asocicia pre S2 aV_3 polymorfizmy301. alej zostavili haplotypy zo atyroch SNP  S2, T1, T2 (SNP, ktor nebol signifikantn po korekcii na mnohopo etn vber) aV_3 azistili atatisticky vznamn vzbu haplotypu CCTG na vskyt astmy vdospelosti. Vprotiklade k tmto vsledkom, nebol ani jeden zo atudovanch polymorfizmov asociovan sastmou vislandskej populcii302. Autori vaak eate uskuto nili meta-analzu svyu~itm dostupnch literrnych dajov, a naali signifikantn asociciu polymorfizmov ST+7, F+1, Q_1, S2 aT1 sastmou. Prv dva ztchto polymorfizmov boli vo ve>mi tesnej vzbe (linkage disequilibrium = 0.965).

Howard aspol.303 h>adali asociciu medzi astmou (+ event. svisiacim fenotypom) a8 polymorfizmami v 4 rznych populcich  holandskej, beloaskej zUS, afroamerickej ahispnskej. Ike naali asociciu piatich polymorfizmov sastmou, tak ani jeden polymorfizmus nebol asociovanm sdanm fenotypom vo vaetkch populcich. Drobnou vnimkou bol len S2 SNP, ktor nebol asociovan len vholandskej populcii. Haplotypovou analzou odhalili v~dy 2 haplotypy so signifikantnou asociciou vholandskej aafroamerickej populcii. Vostatnch populcich signifikantn vzba sledovanch haplotypov kvskytu astmy nebola zisten303. Ve>k austrlska atdia neobjavila asociciu medzi ~iadnym z10 skmanch polymorfizmov, odhalila vaak nieko>ko haplotypov, ktor boli vznamne spojen sastmou  za tento trend boli najviac zodpovedn polymorfizmy V-1 aST+7304. Lind aspol.305 sa poksili replikovae asociciu aiestich SNP (S1, T1, V-1, V1, V4 a T2) sastmou, jej zva~noseou, odpoveou na bronchodilata n ltky ahladinou celkovch IgE vpopulcich zMexika aPortorika. Asociciu sa im vaak nepodarilo njse ani pre jeden polymorfizmus

i haplotypy (kombincie 2  6 SNP). Jongepier aspol.306 sa zamerali na vzeah SNP vADAM33 kprogresii astmy. Vskupine 200 astmatikov sledovanch viac ne~ 20 rokov zistili, ~e vzcna alela polymorfizmu S2 bola asociovan svraznm ro nm poklesom parametra FEV1. Tto prca poukzala teda namo~n vplyv SNP vADAM33 nielen na rozvoj astmy, ale aj na priebeh choroby. Asociciu detskej astmy spolymorfizmami vADAM33 skmali Simpson aspol.307 vbritskej populcii det vo veku 3 a5 rokov. Vzcna alela F+1 SNP bola vtejto populcii vo vzbe na zn~en funkciu p>c utrojro nch det. Svyu~itm recesvneho modelu dedi nosti bola pozorovan asocicia F+1, S1, ST+5 aV4 smeranm apecifickej rezistencie vdchacch cestch upe ro nch det. Srizikom vskytu nzkeho FEV1 boli zase asociovan polymorfizmy F+1, M+1, T1 aT2 ariziko vskytu prechodnho skorho pskania predstavovala alela Apolymorfizma F+1 vheterozygotnom stave307. Raby aspol.308 sledovali 652 nuklernych rodn svskytom astmy aposudzovali asociciu 17 SNP vADAM33 svskytom detskej astmy. Ike vbeloaskej aafro-americkej populcii zUSA nebol aastmou asociovan ani jeden zo sledovanch SNP, tak polymofizmy T1 aT+1 vykazovali hrani n asociciu (p = 0,04) vpodskupine hispnskej populcie. Haplotypovou analzou odhalili v beloaskej populcii z USA asociciu haplotypu

. 16 (p=0,006). Tieto atdie poukazuj na to, ~e vplyvy SNP vADAM33 za naj u~ prinajmenaom vranom detstve. Medzi posledn asocia n atdie patr ivzkum vzeahu astmy a faj enia spolymorfizmami vADAM33 vskupine mladch japonskch ~ien. Pri uva~ovan kodominantnho modelu bola njden asocicia AA genotypu polymorfizmu Q-1 (rs612709) sastmou pri porovnan sgenotypom GG. Signifikantn vzbu svskytom astmy vykazoval haplotyp CCGGAAGA (obsahuje mimo in ialelu Apolymorfizmu Q-1 aG alelu polymorfizmu S2). Hranicu signifikancie pre vzjomn interakciu sfaj enm pri vzniku choroby takmer dosiahli polymorfizmy V-3 aS2309. Signifikantne zvaen riziko pre astmu udet prestavovali vpopulcii zo Saudskej Arbie polymorfizmy T1 a T2 (pri vyu~it dominantnho modelu). Polymorfizmy S1 aST+4 neboli aastmou vtejto populcii asociovan310. Navyae v meta-analze zdt populci vUK azIslandu, ktor analyzovala celkovo 1299 pacientov a1665 kontrol, bola njden asocicia F+1 aST+7 polymorfizmov svskytom astmy311. Skuto n anajsilnejaia asocicia spomedzi polymorfizmov sledovanch vjednej zposlednch GWAS atdi bola zisten pre S2 polymorfizmus vADAM33312.

4. Ciele dizerta nej prce Medzi gny naj astejaie spojen satopiou ahladinou IgE patr STAT6 amedzi gny naj astejaie asociovan sastmou a/alebo BHR patr zase ADAM33. Preto~e SNP vtchto gnoch m~u ovplyvHovae ich funkciu aviese tm pdom krozvoju astmy aalergie, tak tto dizerta n prca mala nasledujce ciele: ur ie genotypy vybranch polymorfizmov (SNP) vSTAT6 aADAM33 vsledovanch rodinch svskytom astmy avskupine kontrol, nsledneatatisticky zhodnotie ich asociciu sastmou, hladinou celkovch IgE aBHR, zo zskanch genotypov SNP v STAT6 avADAM33 vytvorie haplotypy STAT6 aADAM33 aatatisticky zhodnotie ich asociciu s astmou, hladinou celkovch IgE a BHR, posdie mo~n rozdielny vplyv zostavench haplotypov vzvislosti od ich rodi ovskho pvodu (maternlny vs. paternlny prenos).

5. Materil ametdy

5.1 Charakteristikasledovanch skupn

Do vskumu bolo zaradench 109 det sdiagnzou asthma bronchiale. S asne boli vyaetren aj ich prbuzn (rodi ia a srodenci), celkove 375 osb z 108 rodn. Kontroln skupinu tvorilo 45 nhodne vybranch osb zbe~nej populcie. Projekt bol schvlen etickou komisiou pri fakultnej nemocnici vOlomouci. Rodi ia vaetkch det zaradench do vskumu podpsali informovan shlas. Diagnza atopickej astmy bola ur en pod>a doporu en GINA zroku 2002 u vaetkch 109 pacientov vyaetrench na Detskej klinike vrokoch 2003  2005. Pod>a rovnakch doporu en bol upacientov vyhodnoten stupeH zva~nosti ochorenia ana zklade klinickho obrazu a vsledkov laboratrnych vyaetren (absoltny po et eozinofilov, celkov hladina IgE vsre, percentulne mno~stvo eozinofilov sCD44 na povrchu). Do sboru pacientov bolo zaradench celkove 75 chlapcov a 34 diev at svekom 0,4  20,2 rokov (medin 11 rokov). Deti svrodenou chybou dchacch ciest alebo so zva~nou chorobou respira nho traktu neboli do vskumu rieaenho touto dizerta nou prcou zaraden.

5.1.1 Posdenie atopie vsledovanch skupinch Atopick status bol posden u vaetkch pacientov pomocou ko~nho prick testu svyu~itm extraktov be~nch alergnov (pele travn a stromov, rozto e, plesne, extrakty srsti psov a ma iek). Hladiny celkovch IgE protiltok boli ur en nefelometrom BN II, Dade Behring skitom N Latex IgE mono, firmy Siemens. Podstatou tejto metdy je to, ~e polystyrnov

astice obalen apecifickmi protiltkami proti >udskm IgE s agregovan po pridan vzorku obsahujceho >udsk IgE. Tieto zrazeniny rozpty>uj l  svetla prechdzajci vyaetrovanou vzorkou. Koncentrcia vyaetrovanho analytu je mern intezite rozptlenho svetla, meranie mus bye v~dy porovnan so vzorkou oznmej koncentrcii. Meranm hladiny celkovch IgE vskupine pacientov ikontrol amedzi tmito skupinami bol signifikantn rozdiel (pcnych funkci aBHR pomocou spirometrie Spirometria bola u sledovanch osb uskuto nen pred nasadenm protizpalovej terapie. Vaetky sledovan deti boli bez znmok infekcie respira nho traktu a to po dobu 4 t~dHov pred uskuto nenm spirometrickho vyaetrenia. U vaetkch vyaetrovanch subjektov sa po~adovalo vysadie lie bu kortikosteroidmi, antihistaminikami iantileukotrinami 72 hodn pred samotnm vyaetrenm. Podanie krtkodobo inkujcich b-mimetk vprpade potreby bolo povolen. Rno vdeH testovania nebolo povolen podvanie salbutamolu. Osoby, u ktorch bola zkladn hodnota FEV1 pod 80% predpokladanej hodnoty, boli zo atdie vyl en. Spirometrick vyaetrenie sa uskuto nilo pomocou prstroja Jaeger MasterScreen Spirometry system (Jaeger Co., Nmecko). P>cne funkcie boli vyaetren vpolohe po sedia ky. Vaetky vyaetrovan osoby museli mae zkladn hodnotu FEV1 nad 80% smenej ne~ 5% variabilitou medzi tromi nasledujcimi meraniami. Hodnoty p>cnych funkci boli vyjadren ako absoltne hodnoty apercent zpredpokladanch hodnt. Predpokladan hodnoty pre ka~d testovan subjekt boli ur en pomocou atandardizovanej metdy sprihliadnutm kpohlaviu vyaetrovanch osb, ich veku, hmotnosti a vaky.

Samotn bronchoprovokcia bola vykonan pomocou histamnu a metacholnu, v~dy svyu~itm dvoch rozli nch metd podvania: metda bolusovho podania dozimetrickm MedAid nebuliztorom (Jaeger Co, Nemecko)  elektronicky riaden ventil dvkuje kalibrovan mno~stvo aeroslu pri ndychu alebo vpriebehu

asti ndychu, kedy je prietok vdchacch cestch najefektvneja 

bp  $ ( L N P



6

>

@

D

ĩufVfGf;fhUCJaJmHsHhDJhJhCJaJmHsHhDJhJh5CJaJmHsHhDJhzCJaJmHsHhPjhyFACJaJmHsHhyFACJaJmHsHhyFAhPj5CJaJmHsHhyFA5mHsHhPjhPjCJaJmHsHhPjCJaJmHsHhPjhPj5CJaJmHsHhDJhPj5CJ,aJ,mHsHhDJhPjCJaJmHsHhDJhPj5mHsH@bdfhjlnp   " $ & ( N P dgdPj

$da$gdPj

X







`

$da$gd*J*dgd*J*D

F

L

b

d

x

















 ( : > @ X d r 

, ʾ❋|||||||||hDJh!CJaJmHsH"hDJhz5>*CJaJmHsH"hDJhJh5>*CJaJmHsHhDJhUCJaJmHsHhCJaJmHsHhzCJaJmHsHhUCJaJmHsHhDJhzCJaJmHsHhDJhJhCJaJmHsH-` b d f h dgd*J*, 2 B D .j"DH|ǷǛf1jh"h"56CJU\]aJmHsHhDJhz5CJ aJ mHsHh>xCJaJmHsHhUCJaJmHsHhDJh9CJ\aJmHsHh9h9CJ\aJmHsHh9CJaJmHsHhDJh!CJaJmHsHhDJhzCJaJmHsHhDJhdwECJaJmHsH# vc/A+*B*UmHnHphuҷ҄yyhXҷhdi5CJ\aJmHnHu jYhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu2jhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu :;?@ABC_`abø}ofoLø2jhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi5CJ\aJmHnHuhELmHnHu jShdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2jhdihdi>*B*UmHnHphu 

$%&()*+,-IJ²¤oddSF¤hdiCJaJmHnHu jG hdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu2jhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi5CJ\aJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu jMhdiUmHnHuJKLmno~pgpM*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu jA

hdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2j hdihdi>*B*UmHnHphu "

 RTҷ҂ooddSҷ j5 hdiUmHnHuhdimHnHu%hhdi0J6H*mHnHsHu"hhdi0J6mHnHsHu2j hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHuTVX 

  ./01]^_y~pgpM=hhdi0JmHnHsHu2j hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu j/ hdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2j hdihdi>*B*UmHnHphuyz{}~²¤qffU²¤ j#hdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu2jhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi5CJ\aJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu j)hdiUmHnHu5679:;Z[\]PRT~pgpM*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu jhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2jhdihdi>*B*UmHnHphu:BDFHJLҷ҄yyhXҷhdi5CJ\aJmHnHu jhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu2jhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu456PQ~pgpM*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu j hdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2jhdihdi>*B*UmHnHphuQRTUVWXYuvwxҷ҂wwfҷL҂w2j|hdihdi>*B*UmHnHphu jhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2jhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHuW cn F!V"D#Z$L%%U&&']''(h(()s)) 

 

 

 

 

 '()*@AB\]^`abcde𶩶xfU𶩶 jhdiUmHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2jvhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHu jhdiUmHnHuhdimHnHujhdiUmHnHu(*,`b~pgpM*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu jhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2jphdihdi>*B*UmHnHphubdhjlnpr "Z\^`ҷ҂wwfҷL҂w2j^hdihdi>*B*UmHnHphu jhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu2jdhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu" $ & ( N P R 𶩶xhWHhdi56\]mHnHu jhdiUmHnHuhhdi0JmHnHsHu2jXhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHu jhdiUmHnHuhdimHnHujhdiUmHnHu !!!8!:!*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi5CJ\aJmHnHuhELmHnHu jhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2jRhdihdi>*B*UmHnHphuH"J"L"P"R"T"V"X"Z""""""##6#8#:#>#@#B#D#F#H###²¤oddSF¤hdiCJaJmHnHu jhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu2jFhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi5CJ\aJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu jhdiUmHnHu###$$$L$N$P$T$V$X$Z$\$^$$$$$%%

%>%@%~pgpM*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu jhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2j@hdihdi>*B*UmHnHphu@%B%F%H%J%L%N%P%%%%%%%%%%%%%%%%%&&&&2&3&ҷ҂wwfҷL҂w2j."hdihdi>*B*UmHnHphu j!hdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2j4!hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu3&4&N&O&P&R&S&T&U&V&W&s&t&u&v&&&&&&&&&&&&&&&𶩶xfU𶩶 j#hdiUmHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2j(#hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHu j"hdiUmHnHuhdimHnHujhdiUmHnHu&&&&&&&&&''''''"'#'$'%':';'*B*UmHnHphu j&hdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2j&hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu''( (

( ( (((((-(.(/(0(E(F(G(a(b(c(e(f(g(h(i(j(((𶩶xfU𶩶 j(hdiUmHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2j

(hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHu j'hdiUmHnHuhdimHnHujhdiUmHnHu(((((((((((((((((((((())~pgpM*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu j)hdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2j)hdihdi>*B*UmHnHphu))))))))8)9):);)P)Q)R)l)m)n)p)q)r)s)t)u)))))ҷ҂wwfҷL2j+hdihdi>*B*UmHnHphu ju+hdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2j*hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu)))))))))))))*** ****0*1*2*4*5*6*չզeSBչզ ji-hdiUmHnHu"hhdi0J5mHnHsHu2j,hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi5CJ\aJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHu jo,hdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu)7***X++,,,,8--.v/0q00M12f3:444O55577 

 

 

 

6*7*8*9*U*V*W*X*o*p*q******************ѮߜqfLߜ2j.hdihdi>*B*UmHnHphuhELmHnHu jc.hdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2j-hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhdiCJaJmHnHu*********++++5+6+7+Q+R+S+U+V+W+X+Y+Z+v+w+µ§rggVµ§ jW0hdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2j/hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu j]/hdiUmHnHuw+x+y+++++++++++++++++ ,

, ,%,&,~pgpM*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu jQ1hdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2j0hdihdi>*B*UmHnHphu&,',),*,+,,,-,.,J,K,L,M,i,j,k,,,,,,,,,,,,,,ҷ҂wwfҷL2j3hdihdi>*B*UmHnHphu jE3hdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2j2hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu,,,,,,,,,,,,,,,,,---1-2-3-5-6-7-8-ԸԥgUDԸԥ j95hdiUmHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2j4hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHu j?4hdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu8-9-:-V-W-X-Y-z-{-|-------------.n.p.r..߼tgM2j6hdihdi>*B*UmHnHphuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu j36hdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2j5hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHu$jhhdi0JUmHnHu.............0/2/4/h/j/l/p/r/t/v/x/z///µ§rggVµ§ j'8hdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu2j7hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu j-7hdiUmHnHu//////000000000708090:0N0O0P0j0k0ø~pgpMø*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi56\]mHnHuhELmHnHu j!9hdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2j8hdihdi>*B*UmHnHphuk0l0n0o0p0q0r0s0000000000000000000ҵ҂wwfVҵhdi5CJ\aJmHnHu j;hdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu2j:hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi56\]mHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu000*1+1,1F1G1H1J1K1L1M1N1O1k1l1m12t2v2x222~pgpMhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu2j=hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu333444243444748494:4;4hdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2j>hdihdi>*B*UmHnHphu4444444444444444444444445555ҷ҂wwfҷL2jnAhdihdi>*B*UmHnHphu j@hdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu2jt@hdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu5+5,5-5G5H5I5L5M5N5O5P5Q5m5n5o5p5~55555555555555չզeTչզ jBhdiUmHnHu2jhBhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi5CJ\aJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHu jAhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu555555555555555 6"6$6&6666 77ø~pgpMø*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi56\]mHnHuhELmHnHu jChdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2jbChdihdi>*B*UmHnHphu7777777 7X7Z7\7^777777777777788ҴttcVҴhdiCJaJmHnHu jEhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu2jVEhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi5CJ\aJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu888\8]8^8x8y8z8}8~8888888888888~pgpM=hhdi0JmHnHsHu2jJGhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu jFhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2jPFhdihdi>*B*UmHnHphu788c99U::J;;Z??@2AABfCjC|C~CEο$d`a$gdBdgdB d@&gdBdgd*J* 

 

 

 

888888888

9 9 9 9?9@9A9[9\9]9`9a9b9c9d9e999²¤oddSF¤hdiCJaJmHnHu jHhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J5mHnHsHu2jDHhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi5CJ\aJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu jGhdiUmHnHu999999999999999999999xk]T]:2j8Jhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu jIhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu%hhdi0J56mHnHsHu"hhdi0J5mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2j>Ihdihdi>*B*UmHnHphu91:2:3:M:N:O:R:S:T:U:V:W:s:t:u:v:::::::::::::::ԸԥgVԸԥ jKhdiUmHnHu2j2Khdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHu jJhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu:::&;';(;B;C;D;G;H;I;J;K;L;h;i;j;k;{;~pgpM;"hhdi0J5mHnHsHu2j&Mhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu jLhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu"hhdi0J6mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2j,Lhdihdi>*B*UmHnHphu{;;;;;;;;;;;;;;;;;|>~>>>>>>>>>>Ѯߜ~o~^oSohELmHnHu jPhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu%hhdi0J56mHnHsHu"hhdi0J5mHnHsHu2jPhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHu$jhhdi0JUmHnHuhdiCJaJmHnHu>>>>????J?L?N?T?V?X?Z?\?^?????xk]T]:2jRhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdiCJaJmHnHuhELmHnHu jQhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHu%hhdi0J56mHnHsHu"hhdi0J5mHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2jQhdihdi>*B*UmHnHphu?????????????6@8@:@*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi56\]mHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHu jRhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu@@@@@@"A$A&A,A.A0A2A4A6AnApArAtAAAAAø~pgpM=hhdi0JmHnHsHu2jThdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi56\]mHnHuhELmHnHu jyThdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsH u$jhhdi0JUmHnHu2jShdihdi>*B*UmHnHphuAAAAAAAAB8B:BBhBjBlBBBBBBBBBBBB³¥rggV³¥ jmVhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu2jUhdihdi>*B*UmHnHphuhdimHnHuhhdi0JmHnHuhdi56\]mHnHu$jhhdi0JUmHnHuhELmHnHujhdiUmHnHu jsUhdiUmHnHuBBBC C"CVCXCZC`CbCdCfChClC|CCø~eVF7hDJhBCJaJmHsHhDJhB5CJ aJ mHsHhDJhT%CJaJmHsH1jhDJh"56CJU\]aJmHsHhdi56\]mHnHuhELmHnHu jgWhdiUmHnHujhdiUmHnHuhdimHnHuhhdi0JmHnHsHu$jhhdi0JUmHnHu2jVhdihdi>*B*UmHnHphuCCCDEEF$G&GzJJJZK.LnMtMxMzMMMNNNNN

OQQQQhd]CJaJmHsHhBCJaJmHsHhDJhBCJaJmHsHhDJhB5CJaJmHsHh@DF.0ln|~~68@Bfhpr:>@ю'hDJhB6CJOJQJaJmHsHhBCJaJmHsHhDJhBCJH*aJmHsH$hDJhBCJOJQJaJmHsHhDJhB6CJaJmHsHhDJhBCJH*aJmHsHhDJhBCJaJmHsH8TXZ(*TV*0\^`@Bvx ~ohd]hBCJaJmHsHhUhB6CJaJmHsH$hDJhBCJOJQJaJmHsHhd]hB6CJaJmHsHhDJhBCJH*aJmHsH'hDJhB6CJOJQJaJmHsHhDJhB6CJaJmHsHhDJhBCJaJmHsHhBCJaJmHsH+,  "

^`b$$%V%p)r)2ô $d@&a$gdB$d`a$gdd]

$da$gdd]

$da$gdd]$d`a$gdB

$da$gdB $d@&a$gdB68np "BDXZ`2 4      "

  " $ H J P R   ީ{h{h{h{h{h$hDJhd]CJOJQJaJmHsHhDJhd]CJaJmHsHhJ>K>g>h>>FFF~KNPQRQ~QXXXɽ $d@&a$gdBgdW $d@&a$gdB

$da$gdB

$da$gdB$d`a$gdBK>f>g>h>>@@DDFFFFGGHHII L"L&M2MHQJQNQPQRQ~QTTWWXXYYYY[[[ĸĸĨĕĸąĸĸĨĸĸĸĨĨĸp(jxhLhd]CJUaJmHnHuhDJhB6CJaJmHsH$hDJhBCJOJQJaJmHsHhDJhBCJH*aJmHsHhBCJaJmHsHhDJhBCJaJmHsHhDJhB5CJaJmHsH hWhWhW5mHsHhDJhB5mHsH)X[[^d@lBlDlFlHlLllnnnn(o`pbpdpppp $d@&a$gddi $d@&a$gdB$d`a$gdB

$da$gdd]

$da$gdB[[~\

^^^^|_z``aaccd$j&jjj2l$hLhBCJUaJmHnHuhDJhBCJaJmHsHhDJhBCJH*aJmHsHhBCJaJmHsHhd]hBCJH*aJmHsHhd]hBCJaJmHsHhDJhBCJaJmHsHhDJhd]CJaJmHsHh>sggg\M?$

& Fda$gdB$d`a$gdB

$da$gdB $$da$gdBkd\$$IfF\i x'644

Fa7p(>6?|?@X@@(AnA@BBBBBBBPCTCVCfFhFFGFGG$

& Fda$gdB

$da$gdB$d`a$gdB$

& Fda$gdBBBBBBBBB@CLCPCRCTCVC^F`FfFhFFFFFGGGGJGLG\G^GtGvGGGNHPHpHHHHFIHInJpJtJ|JJJJװ׌zzzzzzz" jmhDJhBCJaJmHsH(jhLhBCJUaJmHnHuhDJhBCJaJmHsH(jhLhBCJUaJmHnHu"h+fhB56CJaJmHsHh+fhB5CJaJmHsHhB5CJaJmHsHhBCJaJmHsH0GLHPHHHHH*IFIHIhJKL^LMJMMNNQQɻ$hd^ha$gdB$

& Fda$gdB$d`a$gdB$

& Fda$gdB

$da$gdB$

& Fda$gdBJJLLNNNNNN,O@OBOFOQQQQlRvR|RTTUUUUU

VYYYYƱơpdThDJhB5CJaJmHsHhBCJaJmHsHhhB>*CJaJmHsHhhBCJaJmHsH"hhB56CJaJmHsHhhB5CJaJmHsH(jhhB5CJUaJmHsHhB5CJaJmHsHhBCJaJmHsHhDJhBCJaJmHsH" jmhDJhBCJaJmHsH QQQ|RUUU

VYYYZPZZ[B[D[[[\\\$b&b d`gdBdgdB$d`a$gdB d@&gdB

$da$gdBYYYYZZZJZLZZZ[

[$[&[[D[[\_^_____bbb b&bbbbbc񢕢k\hP7hBCJaJmHsH4hP7hB56CJOJQJ\]^JaJmHsHhDJhBCJaJmHsHhB5CJaJmHsHhDJhB5CJaJmHsHhBCJaJmHsH$hDJhBCJOJQJaJmHsHhDJhBCJH*aJmHsHhDJhB>*CJaJmHsHhDJhBCJaJmHsH#&bbbbbbcc0ccul $Ifgd:kxvkdlR$$IfFF ,&'''=%6    44

Fa7p $$Ifa$gd:kxdgdB cccccc:do@oPoRoZoooooopppppq@qBqqqqqqǸ(hP7hBCJOJQJ^JaJmHsH.hP7hB5CJOJQJ\^JaJmHsHhP7hBCJaJmHsH4hP7hB56CJOJQJ\]^JaJmHsHhB5CJaJmHsHhDJhB5CJaJmHsH6nnnnnoqee\e $Ifgd:kx $$Ifa$gd:kxkd `$$IfF8\X$'f'''

$644

Fa8p(ooo

o0oPoofffZ $$Ifa$gd:kx $Ifgd:kxkdPa$$IfF48\X$&f&''

$644

Fa8p(PoRoZozooooccZc $Ifgd:kx $$Ifa$gd:kxkdb$$IfF48\X$f''

$644

Fa8p(ooooopofffZ $$Ifa$gd:kx $Ifgd:kxkd*d$$IfF48\X$&f&''

$644

Fa8p(pppqoccZc $Ifgd:kx $$Ifa$gd:kxkdqh$$IfF4\X$f''

$644

Fa8p(>q@qBqDqxqqofffZ $$Ifa$gd:kx $Ifgd:kxkdi$$IfF48\X$&f&''

$644

Fa8p(qqqqqroccZc $Ifgd:kx $$Ifa$gd:kxkd=k$$IfF4\X$f''

$644

Fa8p(qqrrrrHrJrZr\rbrrrrrrss"s$s0ssssssssttLtVtltztZv~vvZ|^|`||||rĵ~q~qhBCJH*aJmHsHhDJhBCJH*aJmHsHhDJhBmHsHhDJhB5mHsHhDJhB6CJaJmHsHhDJhBCJaJmHsHhP7hBCJaJmHsH.hP7hB5CJOJQJ\^JaJmHsH(hP7hBCJOJQJ^JaJmHsH,rrrr:rZrofffZ $$Ifa$gd:kx $Ifgd:kxkdl$$IfF48\X$&f&''

$644

Fa8p(Zr\rbrrrroccZc $Ifgd:kx $$Ifa$gd:kxkdn$$IfF4\X$f''

$644

Fa8p(rrrrs"sofffZ $$Ifa$gd:kx $Ifgd:kxkdo$$IfF48\X$&f&''

$644

Fa8p("s$s0sPsssoccZc $Ifgd:kx $$Ifa$gd:kxkdp$$IfF4~\X$f''

$644

Fa8p(ssssstofffZ $$Ifa$gd:kx $Ifgd:kxkdPr$$IfF48\X$&f&''

$644

Fa8p(tttXvZvv,{nodd\PdA$d`a$gdB $d@&a$gdBdgdB

$da$gdBkds$$IfF4j\X$f''

$644

Fa8p(npr΂prvfxNû d@&gd]ERdgd]ER d@&gd]ERgdB$d`a$gdBdgdB $d@&a$gdB

$da$gdBĂƂȂʂ̂΂^jprtv tv˸񨖨t񨖨hhhXKXKhBCJH*aJmHsHhh9hBCJH*aJmHsHhBCJaJmHsH%juhDJhBCJUaJmHsHhh9hBCJaJmHsH"hh9hB56CJaJmHsHhh9hB5CJaJmHsH%juhDJhBCJUaJmHsH$jhDJhBUmHnHsHu%jhDJhBCJUaJmHsHhDJhBCJaJmHsH26$$7$G$Ifa$gd:kx $7$G$Ifgd:kxkdW$$IfT4r p x44

lap2T--..2.J.^.ZNNNN?$$7$G$Ifa$gd:kx $7$G$Ifgd:kxkda$$IfTr px44

lap2T^.`.z.....ZNNNN?$$7$G$Ifa$gd:kx $7$G$Ifgd:kxkd]$$IfTr px44

lap2T.../6/N/b/ZNNNN?$$7$G$Ifa$gd:kx $7$G$Ifgd:kxkdY$$IfTr px44

lap2Tb/d//L0N0ZKK? $7$G$Ifgd:kx$$7$G$Ifa$gd:kxkdU$$IfTr px44

lap2TN0P0R0T0f2h2j2n2p2t2334uul d@&gd]ER

$da$gd]ERdgd]ERvkdQ$$IfTnF p)  x    44

lapT 11T2V2j2l2p2r2t222"3333344 4T4^44455777 7f7h7圏m]]]hDJh]ER6CJaJmHsH"hDJh]ER56CJaJmHsHhDJh]ERCJH*aJmHsHh]ER5CJaJmHsHhDJh]ER5CJaJmHsH%jhDJh]ERCJUaJmHsH%jhDJh]ERCJUaJmHsH$hDJh]ERCJOJQJaJmHsHhDJh]ERCJaJmHsHh]ERCJaJmHsH4f7h7l7n7r78889::FTe*k,k.kkkkİ$$If]^a$gd:kx$$If^a$gd:kx$d`a$gd]ER d@&gd]ERdgd]ER

$da$gd]ERh7j7n7p7~77777`8b8d8888888888@999999۹ۧۘubO۹ۧۘu%j&hDJh]ERCJUaJmHsH%jRhDJh]ERCJUaJmHsHhDJh]ERCJH*aJmHsH$hDJh]ERCJOJQJaJmHsHhDJh]ERCJaJmHsH"hDJh]ER56CJaJmHsHh]ER5CJaJmHsH(jhDJh]ER5CJUaJmHsHhDJh]ER5CJaJmHsH(jhDJh]ER5CJUaJmHsH9:B:\:::::DH@R@f@h@ոոխxlx\x\xlx\x\xlh#h]ER6CJaJmH sH h]ERCJaJmH sH h#h]ERCJaJmH sH h#h]ER5CJ aJ mH sH hDJh]ERCJaJmHsH htKWh]ERhC5h]ERmHsHh:

8;

<

$7$8$H$a$gdt$a$gdt<

=

>

@

@

A

\B

6E

VE

F

0I

J

L

M

O

P

R

"T

V

X

Z

H\

B^

`

c

bd

f

g

9^l6#̛sSS%2,.aDyBUKvp=~EP7"y&/6z6{cl`4!y f; I p89U!iCB"ACG r L+vV0N '$B蒼L@,d{)N:Ss$F8K#LHm@^8%̮%pH1681

>}=Ez'BQ@Q@M]?KXK9/ #

2ynp xvH仸D!;Z;lmQp2/,?ë>>|e=9cˠ؂STsjwvy>UOGŵ}G̼Q[ٜx[DME姘_,[qp@9 wb"ros*T cmȸ..]k .C@MPE/*qf=\c,&DT,77.~֙o7bRoszy hjBl1y̏2o\r6KdvGr."0K˗x EM1Dbk(ncؐ2 "&#ȉ"3Dd

lpALv;q]\@\$=r(ϋO10Y|6Ѱs"CFm%(vpv@$g49DI& V`CЊ}BDZ,86#N2:6nnA8^y&$n5k

I3UK ǞJ'5_9O[ķ.N86rn[XYRGA$x-I8P(Q5j{/NYxN*ܻr?8/מ)h/ykL.N[9:a@4u OwRL{尡@ zu'=)[%݅DRw}}neԞ)v>Wi kW2>(Ek.pMgϤ}MMY/!4ԱKDQɨ'HӴ8tf^Z[ݭ$F"fH'$|zӴ[IFI fsyNeX~:{:m]Z$jFyZfy} c'֍Q~rX2Ȓn,6crx]Nq`d

e0 9+Ќ}jwLK AV'ޛ 9cq uς[{[lJn^6QjQٵMEB((I @ŝ!2ͽF6$88kҔ&k|?c(]_MAc*Fyi\ghݏ;\1 -6\ZvB&I.qV9;T5G3\ի)I)h-(Q~ ^ØP(d;YI #9 ܖ76Bn[D$YNrppImL֐^>&f 됅 '[eΟFp\@p

gyl*[~~wV}XZ5Vhvr߻ߗ_5JmBͮƒ

A1]`Îx >е{mRƌ쩿dJPcR@`FH'w׆nK=apG6qZW pY *#Nx^kGO{.f^qqRRPͫth\hm5[bW23L tت306m[qZ Hcr=}+˝|`G`

 $\|9|O,;yEςI\m\1۲æܭ;[̓Vk-R1i]BPH"\C:m~{5 };7!LI0hKm; \qvٖ)R3.ĨspJH"ͽV,.ȗ;W$=:8d_,*P]y/ P EIf,w r>NF089o\9k"B a`TF##Ɩ+x #ʆ8ؠ|8jJ)3BJV,O !hLa*»q1\m+\GpoR $#Nާy$%yM˶~ciB)}sKֳIYQtvbN퀐~F%@MO+s ÷>/ PjPfX Rc

s|d25$ a¸ 9 TU'ڷ˯CS[Vս^וZ6ʾR%

v$uR$†b!Ȥ!apoGfqwD6yyi>W)w:N{Sye68~]'qjbJ!I{vBАцڠm

 wr2s8ʢeXn3`:2ʋcY]y>ohLv35gs^Au 0BbF:r3ЎW={mN!r׻Hy!ev#gv`:]2Ր:ɾIF9XNY{gqT)#]!w]TWzj̣wΧQ8)|_1o2lC$@q{|(e8&;v dd_]n ;v`랄Vgr82m䏘*qׂZNt^5f^U+uNv9YM/MNl5[ adq2"z7Ιw-o G`nyC2\mc (--g+k2ckT`3x0O8'%W9^l6#̛s@kF(O4^F6ܜ ぜW>DQ?؏2R?G

xNF089yyi>W)w:N{ohLv(DҼ@$8Om"&"|S-8 ulyjjdB蒼L@,d{) ؄.b`1d޸m탚

d +C)܀dA#x84Bb_>/1_p\w

aF3+\(R ` N0O99}BDZ, ................
................

In order to avoid copyright disputes, this page is only a partial summary.

Google Online Preview   Download

To fulfill the demand for quickly locating and searching documents.

It is intelligent file search solution for home and business.

Literature Lottery

Related searches