Thermo Fisher Scientific



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Kit SeCore® GSSP

Istruzioni per l’uso

Kit SeCore® GSSP

Istruzioni per l’uso

I prodotti di sequenziamento specifico per gruppo (Group Specific Sequencing Products - GSSP) Invitrogen SeCore® sono concepiti per risolvere casi di combinazioni eterozigote HLA ambigue, e sono utilizzati in associazione con i kit di sequenziamento SeCore® . I reagenti sono destinati esclusivamente al sequenziamento post-amplificazione. Per istruzioni su come preparare l’amplificazione genomica del DNA specifica per il locus, si rimanda alle Sezioni 1-6 delle Istruzioni per l’uso dei kit di sequenziamento SeCore® .

Ogni prova SeCore® GSSP utilizza miscela di primer della reazione di sequenziamento specifica per il gruppo, miscela di BigDye®, e soluzione tampone di sequenziamento PPT. La sequenza amplificata trattata con ExoSAP-IT™, preparata con il kit di sequenziamento SeCore® , è il modello per le reazioni GSSP. I dati ricavati dal GSSP vengono analizzati con i dati originali tratti dal corrispondente kit di sequenziamento SeCore® per stabilire il risultato della sequenza.

Contenuto del manuale

|Sezione |Descrizione |Pagina |

|1. |Componenti inclusi nei kit |3 |

|2. |Materiali, reagenti e apparecchiature non inclusi |3 |

|3. |Preparazione del campione |4 |

|4. |Reazione di sequenziamento |5 |

|5. |Precipitazione in etanolo dei prodotti della reazione di sequenziamento |5 |

|6. |Elettroforesi dei prodotti della reazione di sequenziamento |6 |

|7. |Analisi dei dati |7 |

|8. |Restrizioni e precauzioni |7 |

|9. |Risoluzione dei problemi |8 |

|10. |Licenze e marchi |10 |

Componenti del kit:

I kit GSSP Invitrogen SeCore® sono forniti come loci singoli e/o gruppi. I prodotti in Classe I sono identificati con un codice “Z”, i kit in Classe II sono identificati come loci/gruppi “DR”. Vedere gli specifici kit per l’identificazione dei loci/gruppi.

|Descrizione |Quantità |Conservazione |

|Miscela di primer della reazione di |Kit dipendenti |-20°C in un congelatore non anti-brina |

|sequenziamento | | |

|Miscela del BigDye®T |Kit dipendenti |-20°C in un congelatore non anti-brina |

|Soluzione tampone di sequenziamento PPT |kit dipendenti |-20°C in un congelatore non anti-brina |

| |

|Nota: la miscela contenente i BigDye® è sensibile alla luce e deve essere conservata e utilizzata in condizioni protette dalla |

|luce. |

Materiali, reagenti e apparecchiature non inclusi:

1 Ciclatore termico a 96 pozzetti con coperchio riscaldato:

1 I Kit di sequenziamento SeCore® sono stati testati usando i ciclatori termici specificati qui di seguito:

MJ Research PTC 225 DNA Engine Tetrad, Applied Biosystems Gene Amp 9600, Gene Amp 2700 e Gene Amp 9700.

2 Sequenziatore di DNA automatizzato e relativi accessori:

1 I kit di sequenziamento SeCore® sono stati testati sul sequenziatore Applied Biosystems ABI Prism® 3100. Per l’uso di altri sequenziatori di DNA è necessaria la validazione da parte dell’utente.

1 Utenti dell’ABI 3100: Generatore capillare 3100 da 36 cm per l’ABI 3100, Applied Biosystems Codice di prodotto 4315931.

3 Set Vaschetta/Portapozzetti da 96 pozzetti MicroAmp®, Applied Biosystems Codice di prodotto 403081

4 Provette di reazione da 0,2 ml MicroAmp®, Provette di reazione (8 provette/striscia) e cappucci (8 cappucci/striscia), Applied Biosystems Codici di prodotto N801-0533, N801-0580 e N801-0535

5 Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp® e coperchio per piastra a copertura completa 9600, Applied Biosystems Codici di prodotto N801-0560 e N801-0550

6 Centrifuga da banco con adattatori piastra per piastra da 96 pozzetti. La centrifuga deve raggiungere una forza di 2500 x g

7 Pipette e punte: 1-10 µl, 10-200 µl, 100-1000 µl

8 Pipette d’erogazione elettroniche: in grado di erogare aliquote da 1 a 125 µl.

9 Pipette multicanale (8 o 12 canali): volume regolabile da 1 a 100 µl

10 Sistema CoolSafe compatibile con le provette da 0,2 ml, codice di prodotto Diversified Biotech CSAF-1000

11 Reagenti per il sequenziatore capillare ABI 3100:

1 Polimero POP-6, codice di prodotto Applied Biosystems 43163577. L’uso dei polimeri POP-4 e POP-7 deve essere validato dall’utente.

2 Tampone per analizzatore genetico 10X, codice di prodotto Applied Biosystems 402824

3 Formammide Hi-Di™, codice di prodotto Applied Biosystems 4311320

12 Etanolo assoluto, codice di prodotto Sigma Aldrich 270741-1L

13 Software per sequenziatore:

1 Da usarsi con l’ABI 3100

Software per la raccolta dei dati ABI Prism® v1.1 o successiva (Win NT)

Software per l’analisi del sequenziamento v3.7 o successiva (Win NT)

14 Software di analisi

1 Software Invitrogen uTYPE® SBT, codice prodotto 539991 or 539992 (CE)

Preparazione del campione:

1 Le amplificazioni genomiche del DNA specifiche di locus purificate con ExoSAP-IT™ derivate dai kit di sequenziamento SeCore® si possono utilizzare con questo kit.

Nota: le sequenze amplificate trattate con l’ExoSAP-IT™ possono essere conservate ad una temperatura di –20º C per un periodo massimo di una settimana.

Nota: sostituire i puntali delle pipette tra un pipettamento e l’altro di ciascun campione e ogniqualvolta si passa da una miscela o un reagente all’altro, onde prevenire la contaminazione crociata. Si può utilizzare lo stesso puntale per dispensare la stessa miscela o lo stesso reagente in provette multiple purché il puntale non entri a contatto con il DNA genomico o con il prodotto della PCR. In caso di dubbio che ciò si sia verificato, sostituire il puntale della pipetta per prevenire la contaminazione.

Reazione di sequenziamento:

1 Preparazione delle reazioni di sequenziamento:

Nota: le miscele per le reazioni di sequenziamento devono essere mantenute le più fredde possibili usando il sistema CoolSafe raccomandato o conservandole su ghiaccio.

1 Per i campioni della Classe II, le sequenze amplificate trattate con ExoSAP-IT™ sono state diluite per il sequenziamento iniziale, pertanto non è necessario diluire ulteriorment. Se non sono stati diluiti, diluire 2volta il volume delle sequenze amplicate della PCR.

2 Per le reazioni della Classe I e della Classe II, aggiungere 2 µl delle sequenze amplificate della PCR trattate con ExoSAP-IT™ nella provetta o nel pozzetto corretto.

3 Combinare il contenuto delle fiale contenenti la miscela del Terminatore BigDye®e la miscela di primer della reazione di sequenziamento.

Nota: dopo la miscelazione, la fiala di primer di reazione/ BigDye® deve essere conservata a -20°C fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta del kit.

4 Aggiungere 8 µl della miscela di sequenziamento specifica per ogni gruppo nella provetta o nel pozzetto appropriato.

5 Coprire le provette o la piastra, vorticare brevemente per miscelare e centrifugare le provette o la piastra per far depositare il liquido sul fondo dei pozzetti.

6 Collocare le provette o la piastra nel ciclatore termico ed eseguire il profilo descritto nella Sezione 4.2.

3 Profilo di sequenziamento per la Classe I e la Classe II:

|Passaggio |Numero di cicli |Temperatura |Durata |

|Ciclo |25 |95°C |20 sec |

| | |50°C |15 sec |

| | |60°C |60 sec |

|Bagno |1 |4°C |infinito |

Il tempo di reazione totale è ≈1,5 ora.

Precipitazione in etanolo dei prodotti della reazione di sequenziamento:

Dopo il sequenziamento tramite ciclizzazione, si deve eseguire una precipitazione in etanolo per rimuovere i terminatori in eccesso. Le istruzioni da osservarsi sono identiche a quelle vigenti per le reazioni di sequenziamento della Classe I e della Classe II.

2 Aggiungere 2 µl di tampone di sequenziamento PPT in ciascuna miscela di reazione di sequenziamento.

3 Centrifugare brevemente per accertare che tutti i contenuti siano debitamente miscelati e si depositino sul fondo del pozzetto.

4 Aggiungere 40 µl di etanolo al 100% in ciascuna miscela.

5 Coprire la piastra e vorticare accuratamente per 60 secondi circa.

Nota: accertarsi che i contenuti di tutte le provette o pozzetti siano ben miscelati.

7 Centrifugare la piastra in una centrifuga dotata di un adattatore per piastra per 30 minuti ad una velocità pari o superiore a 2.000 x g.

8 Rimuovere il coperchio, coprire con un foglio di carta ed invertire. Centrifugare brevemente con il foglio di carta (< 1 min. ad una velocità di 500 x g) in posizione inversa per rimuovere quanto più liquido possibile.

9 Aggiungere 100 µl di etanolo al 70% nei pellet di DNA. NON vorticare la piastra.

10 Centrifugare la piastra per 5 min ad una velocità pari o superiore a 2.000 x g.

11 Rimuovere il supernatante mediante ciclizzazione inversa di cui alla Sezione 8.6.

Nota: se è previsto l’uso di provette singole, centrifugare le provette per 15 minuti per la precipitazione iniziale e per 5 minuti per il lavaggio a ≈12,000 gpm. Rimuovere il supernatante mediante breve ciclizzazione inversa o aspirazione.

Nota: i pellet del DNA possono essere conservati ad una temperatura di –20°C per un periodo massimo di 7 giorni.

Elettroforesi dei prodotti della reazione di sequenziamento

1 Preparazione dei campioni di caricamento

1 Aggiungere 15 µl di formammide Hi-Di™ (codice di prodotto Applied Biosystems 4311320) in ciascun pellet di DNA.

Nota: se fino a questo passaggio si sono usate provette singole, trasferire i campioni in una Piastra ottica da 96 pozzetti (ABI Codice di prodotto N801-0560). Usare la configurazione dei campioni consigliata nella Sezione 7.1.4.2.

3 Coprire la piastra e centrifugare brevemente.

4 Denaturare i campioni ad una temperatura di 95°C per 2 minuti in un ciclatore termico.

5 Centrifugare brevemente per rimuovere le eventuali bollicine d’aria presenti nei campioni.

Nota: la penetrazione di bollicine d’aria nel sequenziatore capillare ne causa il danneggiamento.

7 Inserire la piastra nell’autocampionatore sequenziatore.

2 Condizioni per l’elettroforesi su un sequenziatore capillare ABI Prism® 3100

|Parametri |Impostazioni |

|Dye Set |E |

|Mobility File |KB_3100_POP6_BDTv1.mob |

|Basecaller |Kb.bcp |

|Run Module |RapidSeq36_POP6 |

|Injection Time |10 seconds |

|Default Run Time |1800 seconds |

Analisi dei dati:

1 Usare il software per l’analisi del sequenziamento per l’elaborazione dei dati grezzi raccolti e per la creazione dei file di sequenza.

2 Usare il software Invitrogen uTYPE® SBT per l’elaborazione dei file di sequenza e la creazione di un rapporto HLA.

Nota: si consiglia vivamente di attivare la più recente banca dati degli alleli European Bioinformatics IMGT/HLA (ebi.ac.uk/imgt/hla) per l’analisi dei dati di sequenziamento eseguita con uTYPE®.

I dati ricavati dal kit GSSP sono analizzati insieme ai dati originali ricavati dal kit di sequenziamento SeCore® .

Restrizioni e precauzioni

8.1 Per garantire la miglior performance dei kit di sequenziamento GSSP SeCore® , usare i prodotti con i materiali, i reagenti e le apparecchiature raccomandati nella Sezione 2 del presente documento.

1 La tipizzazione dell’HLA per mezzo dei kit di sequenziamento dell’HLA SeCore® deve essere eseguita alla presenza di un Direttore di laboratorio HLA, di un Supervisore tecnico e/o di un Supervisore generale attenendosi agli standard di accreditamento dei laboratori comunemente accettati (ASHI e EFI). È opportuno sottolineare che i prodotti qui descritti sono riservati al solo ed esclusivo uso professionale.

2 I primer di reazione GSSP possono rilevare siti polimorfici di alleli non target. Gli eventuali picchi rilevati da alleli non target evidenziano generalmente altezze pari a meno del 33% dell’altezza dei picchi prodotti dagli alleli target.

3 I primer di reazione GSSP possono rilevare siti polimorfici di alleli non target

4 Si raccomanda di verificare mediante altre tecniche di tipizzazione tutti i risultati omozigoti

Risoluzione dei problemi

|Problemi |Cause possibili |Soluzioni |

|Sottofondo eccessivo (rumore di |Matrice scarsa o scorretta |ABI 3100: ripetere la calibrazione |

|baseline) | |spettrale e reiniettare i campioni. |

| |Iniezione insufficiente (ABI 3100) |Reiniettare i campioni. |

| |ABI 3100: il tempo di iniezione è eccessivo. |ABI 3100: abbreviare il tempo di iniezione,|

| | |quindi reiniettare. Le potenze del segnale |

| | |di 300-3000 sono ottimali (pur potendo |

| | |presentare delle potenze del segnale |

| | |inferiori, i campioni di qualità scarsa |

| | |possono comunque essere analizzati e |

| | |tipizzati.). |

| |Scarsa reazione di sequenziamento dovuta ad un |Accertarsi che entrambi il prodotto della |

| |errore nel pipettamento. |PCR trattato con l’ExoSAP-IT( e la miscela |

| | |di sequenziamento corretta vengano aggiunti|

| | |e debitamente miscelati. |

| |È stato selezionato il file di mobilità scorretto;|Selezionare il file di mobilità corretto. |

| |i picchi si spostano o si sovrappongono gli uni | |

| |sugli altri. | |

| |È stato aggiunto un quantitativo eccessivo di EtOH|Risequenziamento. Controllare la pipetta |

| |al 100%. |per accertarsi che sia impostata sul volume|

| | |corretto. |

|Segnale debole |Le reazioni di sequenziamento non sono state |Ripetere le reazioni di sequenziamento. |

| |vorticate accuratamente dopo l’aggiunta del |Vorticare accuratamente (50-60 secondi) |

| |tampone di sequenziamento PPT e dell’EtOH. |dopo aver aggiunto l’EtOH. Accertarsi che |

| | |tutte le reazioni vengano debitamente |

| | |miscelate. |

| |Occorre aumentare il tempo di iniezione. |Ripetere la reazione o le reazioni di |

| | |sequenziamento ed aumentare il tempo di |

| | |iniezione. |

|Macchie di colorante eccessive |Il tampone di sequenziamento PPT non è stato |Ripetere la reazione di sequenziamento. |

| |aggiunto nelle reazioni di sequenziamento prima |Aggiungere il tampone di sequenziamento PPT|

| |dell’aggiunta dell’EtOH. |prima dell’aggiunta dell’EtOH. |

| |Le reazioni di sequenziamento non sono state |Ripetere le reazioni di sequenziamento |

| |lavate con EtOH al 70%. |senza omettere il passaggio del lavaggio |

| | |con EtOH al 70%. |

| |Scarsa reazione di sequenziamento dovuta ad un |Accertarsi che entrambi il prodotto della |

| |errore nel pipettamento o prodotto di |PCR trattato con l’ExoSAP-IT( e la miscela |

| |amplificazione debole. |di sequenziamento corretta vengano aggiunti|

| | |e debitamente miscelati. In caso di |

| | |amplificazione debole, confermare |

| | |l’intensità del prodotto di amplificazione |

| | |eseguendo l’elettroforesi su gel di |

| | |agarosio. |

| |Durante la precipitazione non è stato rimosso |Ripetere le reazioni di sequenziamento. Il |

| |tutto l’EtOH residuo. |passaggio della centrifugazione a 500 x g è|

| | |estremamente importante ai fini della |

| | |rimozione di tutto l’etanolo residuo dalle |

| | |provette di reazione. |

| |L’EtOH utilizzato nel passaggio del lavaggio era |Ripetere le reazioni di sequenziamento ed |

| |eccessivamente diluito. |accertarsi di eseguire il lavaggio usando |

| | |EtOH al 70%. |

|Potenza del segnale eccessiva |ABI 3100: il tempo di iniezione è eccessivo. |ABI 3100: abbreviare il tempo di iniezione,|

| | |quindi reiniettare. Le potenze del segnale |

| | |di 300-3000 sono ottimali (pur potendo |

| | |presentare delle potenze del segnale |

| | |inferiori, i campioni di qualità scarsa |

| | |possono comunque essere analizzati e |

| | |tipizzati.). |

|Sequenze non riuscite casuali |Scarsa reazione di sequenziamento dovuta ad un |Accertarsi che entrambi il prodotto della |

| |errore nel pipettamento. |PCR trattato con l’ExoSAP-IT( e la miscela |

| | |di sequenziamento corretta vengano aggiunti|

| | |e debitamente miscelati. |

Licenze e marchi

AVVISO RIVOLTO ALL’ACQUIRENTE: LICENZA LIMITATA

Una licenza ai sensi delle rivendicazioni su brevetti statunitensi; 151.507; 5.171.534; 5.332.666; 5.242.796; 5.306.618; 5.366.860; 5.821.058 e/o delle rispettive rivendicazioni in altri paesi implica sia il pagamento anticipato di una tassa una tantum sia il pagamento rateizzato di royalty. Il prezzo di acquisto di questo kit include la concessione di diritti limitati non trasferibili ai sensi del pagamento rateizzato di royalty per l’utilizzo solo di questa quantità del prodotto per l’esecuzione del processo di sequenziamento del DNA descritto in tali brevetti, quando questo prodotto è usato in concomitanza con uno strumento autorizzato per l’Analisi delle sequenze DNA il cui uso sia coperto dal pagamento anticipato dell’onere una tantum per tali brevetti. Non si concede nessun altro diritto espresso, implicito o per estoppel (principio di inopponibilità del common law), o ai sensi di qualsiasi altro diritto di brevetto di proprietà o regolato da licenza di Life Technologies Corporation (Invitrogen Corporation).

Per ulteriori informazioni sull’acquisto delle licenze per l’esecuzione di sequenziamenti di DNA, rivolgersi al Direttore del Reparto Licenze (Director of Licensing) di Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way Carlsbad CA 92008, USA

AVVISO RIVOLTO ALL’ACQUIRENTE: LICENZA LIMITATA

Il prezzo di acquisto di questo kit include la concessione di una licenza limitata, non trasferibile, non esclusiva (senza il diritto di rivendita, reimballaggio o altre sottolicenze) ai sensi delle rivendicazioni su uno o più brevetti statunitensi 5.800.996, 5.863.727, e 5.945.526, e rivendicazioni corrispondenti sui rispettivi brevetti esteri ed altri brevetti in corso di omologazione, per l’uso di questo prodotto esclusivamente con una macchina commerciale per il sequenziamento automatico del DNA prodotta da Life Technologies (Applied Biosystems LLC) e autorizzata ai sensi di questi brevetti da Life Technologies. Non si rilascia nessuna licenza per l’uso di questo kit o dei reagenti in esso contenuti in nessuna altra macchina per il sequenziamento automatico. Per informazioni in merito alla disponibilità di licenze aggiuntive per l’adozione delle metodologie brevettate, rivolgersi al Direttore del Reparto Licenze all’indirizzo: Director of Licensing, Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way Carlsbad CA 92008, USA

AVVISO RIVOLTO ALL’ACQUIRENTE IN MERITO ALLA LICENZA LIMITATA

Questo kit è altresì venduto in conformità a una sottolicenza limitata concessa da Amersham International plc ai sensi di uno o più brevetti statunitensi N. 5.498.523 e 5.614.365; e brevetti esteri corrispondenti ed altri brevetti in corso di omologazione. Il prezzo di acquisto di questo kit include la concessione di una sottolicenza limitata non esclusiva (senza il diritto di rivendita, reimballaggio o altre sottolicenze) ai sensi dei diritti di brevetto per l’utilizzo di questo reagente per il sequenziamento del DNA esclusivamente con una macchina commerciale per il sequenziamento automatico del DNA prodotta da Life Technologies (Applied Biosystems LLC). Non si rilascia nessuna licenza per l’uso di questo kit o dei reagenti in esso contenuti in nessuna altra macchina per il sequenziamento automatico. Non si rilascia nessun’altra licenza espressa, implicita o per estoppel. Per informazioni in merito alla disponibilità di licenze aggiuntive per l’adozione delle metodologie brevettate, rivolgersi al Direttore del Reparto Licenze di Life Technologies Corporation

Marchi commerciali

SeCore è un marchio commerciale di proprietà di Life Technologies Corporation

Invitrogen è un marchio commerciale di proprietà di Life Technologies Corporation

ABI PRISM, Applied Biosystems, BigDye sono marchi commerciali di proprietà di Applied Biosystems LLC o delle sue consociate negli USA  e in alcuni altri paesi.

FastStart™ è un marchio commerciale di proprietà di Roche Molecular Biochemicals

ExoSap-IT è un marchio commerciale di proprietà di USB Corporation

uTYPE è un marchio commerciale di proprietà di Life Technologies Corporation

Tutti gli altri marchi commerciali sono di proprietà esclusiva dei rispettivi proprietari.

PR043I

Revisione 06

Stampa 6/09

|Rappresentante per l’Europa: |

|Invitrogen Ltd. |

|11 Bassendale Road |

|Croft Business Park |

|Bromborough, Wirral |

|CH62 3QL, U.K. |

|Tel: +44 (151) 346 1234 |

| |

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|[pic] |

| |

| [pic] | Invitrogen Corporation |

| |9099 North Deerbrook Trail |

| |Brown Deer, Wisconsin 53223 USA |

| |Tel: 1 (800) 955-6288 |

| |Fax: 1 (800) 331-2286 |

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Per ottenere informazioni specifiche di contatto per il proprio paese si invita a visitare il sito Web



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9099 N. Deerbrook Trail

Brown Deer, Wisconsin 53223 USA

Tel. 1-800-955-6288

Fax 1-800-331-2286

E-mail: catalog@

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