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Equipos GSSP SeCore®

Instrucciones de uso

Equipos GSSP SeCore®

Instrucciones de uso

Los GSSP (Productos para secuenciación específicos de grupo) SeCore® de Invitrogen han sido diseñados para resolver combinaciones ambiguas del HLA en heterozigosis, y se usan conjuntamente con los equipos para secuenciación SeCore® . Los reactivos son para uso exclusivo en la secuenciación postamplificación. Para conocer las instrucciones acerca de cómo preparar la amplificación del ADN genómico de locus específico, los usuarios deberán consultar las secciones 1 a 6 de las Instrucciones de uso del equipo para secuenciación SeCore® .

Cada equipo GSSP SeCore® contiene un vial con cebador para la secuenciación específica de grupo, un vial con el BigDye® y un vial con tampón de PPT de secuenciación. El amplicón tratado ExoSAP-IT™, preparado con el equipo para secuenciación SeCore® , sirve de plantilla para las reacciones de los GSSP. Los datos generados a partir de los GSSP se analizan junto con los datos originales del equipo para secuenciación SeCore® correspondiente para determinar el resultado de la secuencia.

Contenido del manual:

|Sección |Descripción |Página |

|1. |Componentes del equipo |3 |

|2. |Materiales, reactivos y equipo no suministrado |3 |

|3. |Preparación de la muestra |4 |

|4. |Reacción de secuenciación |5 |

|5. |Precipitación de etanol de productos de reacción de secuenciación |5 |

|6. |Electroforesis de los productos de reacción de secuenciación |6 |

|7. |Análisis de datos |7 |

|8. |Limitaciones y precauciones |7 |

|9. |Solución de problemas |8 |

|10. |Licencias y marcas comerciales |10 |

Componentes del equipo:

Los equipos de GSSP SeCore® de Invitrogen se suministran como locus y/o grupos independientes. Los productos de clase I se designan por un número “Z” y los equipos de clase II se designan por los locus/grupos “DR”. Consulte los equipos específicos para identificar los locus/el grupo.

|Descripción |Cantidad |Almacenamiento |

|Cebador para secuenciación |Depende del equipo |A -20 °C en un congelador que no forme escarcha |

| BigDye® |Depende del equipo |A -20 °C en un congelador que no forme escarcha |

|Tampón de PPT de secuenciación |Depende del equipo |A -20 °C en un congelador que no forme escarcha |

| |

|Nota: la mezcla con el terminador colorante es fotosensible y deberá protegerse de la luz mientras permanezca almacenado y |

|cuando se esté utilizando. |

Materiales, reactivos y equipo no incluido:

1 Termociclador de 96 pocillos con tapa térmica:

1 Los equipos para secuenciación SeCore® se han probado en los siguientes termocicladores:

Tétrada del motor de ADN PTC 225 de MJ Research, Amplificador Genético 9600, Amplificador Genético 2700 y Amplificador Genético 9700 de Applied Biosystems.

2 Secuenciador de ADN automático y accesorios:

1 Los equipos para secuenciación SeCore® han sido probados con el secuenciador ABI Prism® 3100 de Applied Biosystems. El uso de otros secuenciadores de ADN necesita ser validado por cada usuario.

1 Usuarios de ABI 3100: Matriz capilar 3100 de 36 cm para ABI 3100, código de producto de Applied Biosystems 4315931.

3 Juego de dispositivo de retención/bandeja de 96 pocillos MicroAmp®, código de producto de Applied Biosystems 403081.

4 Tubos de reacción de 0,2 ml, tubos de reacción (8 tubos/franja) y tapas (8 tapas/franja) MicroAmp®, códigos de producto de Applied Biosystems N801-0533, N801-0580 y N801-0535.

5 Bandeja óptica de 96 pocillos y tapa de bandeja completa 9600 MicroAmp®, código de producto de Applied Biosystems N801-0560 y N801-0550.

6 Centrifugador de sobremesa con adaptadores para bandejas de 96 pocillos. El centrifugador debe alcanzar una fuerza de 2.500 x g.

7 Pipetas y puntas de pipetas: 1-10 µl, 10-200 µl, 100-1.000 µl.

8 Pipetas electrónicas para dispensación: con capacidad para dispensar alícuotas de 1 a 125 µl.

9 Pipetas multicanal (8 o 12 canales): volumen ajustable de 1 a 100 µl.

10 Sistema CoolSafe de ajuste de tubos de 0,2 ml, código de producto de Diversified Biotech CSAF-1000.

11 Reactivos para secuenciador capilar ABI 3100:

1 Polímero POP-6, código de producto de Applied Biosystems 4316357 . El uso de los polímeros POP-4 y POP-7 deberá ser validado por cada usuario.

2 Tampón para análisis genético 10X, código de producto de Applied Biosystems 402824.

3 Formamida Hi-Di™, código de producto de Applied Biosystems 4311320.

12 Etanol absoluto, código de producto de Sigma Aldrich 270741-1L.

13 Software del secuenciador:

1 Para usar con ABI 3100.

Software de recogida de datos ABI Prism® v1.1 o superior (Win NT).

Software para análisis de secuencias v3.7 o superior (Win NT).

14 Software para análisis.

1 Software uTYPE® SBT de Invitrogen, código de producto 539991 or 539992 (CE).

Preparación de la muestra:

1 Las amplificaciones de ADN genómico de locus específico purificadas con ExoSAP-IT™ a partir de los equipos para secuenciación SeCore® pueden utilizarse con este equipo.

Nota: los amplicones tratados con ExoSap-IT™ se pueden almacenar a –20 ºC hasta una semana.

Nota: Cambie las puntas de las pipetas en cada toma de muestra y mezclas o reactivos diferentes para evitar la contaminación cruzada. La misma punta de pipeta se puede utilizar para administrar la misma mezcla o reactivo en varios tubos, siempre que no entre en contacto con el ADN genómico o el producto de PCR. Si existe alguna duda al respecto, cambie la punta para evitar cualquier contaminación.

Reacción de secuenciación:

1 Preparación de las reacciones de secuenciación:

Nota: las mezclas de reacción de secuenciación se deben conservar tan frías como sea posible, utilizando el sistema CoolSafe recomendado o hielo.

1 Para las muestras de clase II, si los amplicones tratados con ExoSap-It™ son utilizados, ellos han sido diluídos durante la secuenciación inicial, por lo tanto, no seran necesarias mas diluciones; pero si la muestra no fue diluída al comienzo, entonces diluya al doble el volumen del amplicón.

2 Para las reacciones de clase I y clase II, añada al tubo o al pocillo correspondiente 2 µl de amplicones de PCR tratados con ExoSAP-IT™.

3 Mezcle el contenido de los viales que contienen el terminador BigDye® y la mezcla del cebador para secuenciación.

Nota: después de mezclar, el vial con el cebador/ BigDye® deberá almacenarse a -20 ºC hasta la fecha de caducidad que consta en la etiqueta del equipo.

4 Añada 8 µl de cada mezcla cebador de secuenciación/ BigDye® al tubo o pocillo correspondiente.

5 Cubra los tubos o la bandeja, agite en vórtice brevemente hasta mezclar y centrifugue los tubos o la bandeja para llevar el líquido al fondo de los pocillos.

6 Coloque los tubos o la bandeja en el termociclador y ejecute el perfil descrito en la sección 4.2.

3 Perfil de secuenciación para las clases I y II:

|Paso |Número de ciclos |Temperatura |Duración |

|Ciclo |25 |95 °C |20 s |

| | |50 °C |15 s |

| | |60 °C |60 s |

|Remojo |1 |4 °C |Infinita |

La duración total de la reacción es ~1,5 horas.

Precipitación en etanol de los productos de la reacción de secuenciación:

Después de la secuenciación, se realiza una precipitación de etanol para eliminar los terminadores sobrantes. Las instrucciones son similares para las reacciones de secuenciación de clase I y clase II.

2 Añada 2 µl de tampón de PPT de secuenciación a cada mezcla de reacción de secuenciación.

3 Centrifugue brevemente para asegurarse de que todo el contenido se mezcle y se deposite en el fondo del pocillo.

4 Añada 40 µl de etanol al 100% a cada mezcla.

5 Cubra la bandeja y agite bien en vórtice durante unos 60 segundos.

Nota: asegúrese de que el contenido de todos los tubos o pocillos está bien mezclado.

7 Centrifugue la bandeja en un centrifugador provisto de un adaptador para bandejas durante 30 minutos a 2.000 g más.

8 Retire la tapa, cúbrala con una toallita de papel y déle la vuelta. Centrifúguela por poco tiempo con la toallita de papel (< 1 min a 500 x g) en la posición invertida para eliminar la mayor cantidad de líquido posible.

9 Añada 100 µl de etanol al 70% a los sedimentos de ADN. NO agite en vórtice la bandeja.

10 Centrifugue la bandeja durante 5 minutos a 2.000 g o más.

11 Elimine el sobrenadante mediante un giro invertido al igual que en el paso 8.6.

Nota: si se utilizan tubos independientes, centrifúguelos durante 15 minutos para la precipitación inicial y durante 5 minutos para el lavado a ~12.000 rpm. Elimine el sobrenadante mediante un breve giro invertido o por aspiración.

Nota: los sedimentos de ADN se pueden almacenar a –20 °C durante un máximo de 7 días.

Electroforesis de los productos de la reacción de secuenciación.

1 Preparación de las muestras que se van a cargar.

1 Añada 15 µl de formamida Hi-Di™ (código de producto de Applied Biosystems 4311320) a cada sedimento de ADN.

Nota: si se utilizan tubos individuales hasta este paso, cambie las muestras a una bandeja óptica de 96 pocillos (código de producto de ABI N801-0560). Utilice la distribución de muestras propuesta en la sección 7.1.4.2.

3 Cubra la bandeja y centrifúguela brevemente.

4 Desnaturalice las muestras a 95 °C durante 2 minutos en un termociclador.

5 Centrifugue brevemente para eliminar cualquier posible burbuja de aire de las muestras.

Nota: si las burbujas de aire se introducen en el dispositivo capilar, provocarán daños en el mismo.

7 Coloque la bandeja en el inyector automático del secuenciador.

2 Condiciones para la electroforesis en un secuenciador capilar ABI Prism® 3100.

|Parámetros |Valores |

|Dye Set |E |

|Mobility File |KB_3100_POP6_BDTv1.mob |

|Basecaller |Kb.bcp |

|Run Module |RapidSeq36_POP6 |

|Injection Time |10 seconds |

|Default Run Time |1800 seconds |

Análisis de los datos:

1 Utilice el software para análisis de secuencias para procesar los datos sin procesar recopilados y crear archivos de secuencias.

2 Utilice el software uTYPE® SBT de Invitrogen para procesar los ficheros de secuencias y crear un informe del HLA.

Nota: se recomienda encarecidamente aplicar la base de alelos más reciente de la base de datos IMGT/HLA del Instituto Europeo de Bioinformática (ebi.ac.uk/imgt/hla) para efectuar el análisis de los datos de secuencias por medio de uTYPE®.

Los datos generados a partir del equipo de GSSP se analizan conjuntamente con los datos originales del equipo para secuenciación SeCore® .

Limitaciones y precauciones:

1 Para garantizar un rendimiento óptimo de los equipos de GSSP SeCore® , utilice los productos con los materiales, reactivos y equipos recomendados en la sección 2 de este documento.

2 El tipado de HLA con los equipos SeCore® para la secuenciación del HLA se debe realizar en presencia del director del laboratorio de HLA, un supervisor técnico u otro supervisor general, siguiendo los estándares oficiales de homologación de laboratorio aceptados (ASHI y EFI). Volvemos a hacer hincapié en que estos productos están destinados a un uso exclusivamente profesional.

3 Los cebadores para los GSSP pueden detectar sitios polimórficos a partir de alelos a los que no se accedía. Algunos de los picos detectados a partir de alelos a los que no se accedía muestran generalmente amplitudes menores al 33% de los picos producidos por los alelos a los que se tenía acceso.

4 La mejor alineación de los datos de secuenciación en la biblioteca se consigue con menos de 300 bases por secuencia.

8.5 Se recomienda que todos los resultados homozigóticos sean verificados por otro método.

Solución de problemas:

|Problemas |Causas posibles |Soluciones |

|Fondo excesivo (ruido de línea de |Matriz insuficiente o incorrecta |ABI 3100: Repita la calibración de espectro|

|referencia) | |y vuelva a inyectar las muestras. |

| |Inyección escasa (ABI 3100) |Vuelva a inyectar las muestras. |

| |ABI 3100: Se ha establecido un tiempo de |ABI 3100: Reduzca el tiempo de inyección y |

| |inyección demasiado largo. |vuelva a efectuar la inyección. Las |

| | |potencias de señal comprendidas entre 300 y|

| | |3.000 son óptimas. (Es posible que las |

| | |muestras de poca calidad presenten una |

| | |potencia de señal inferior, aunque se |

| | |pueden analizar y efectuar un tipado de |

| | |ellas.). |

| |Reacción de secuenciación insuficiente |Asegúrese de que tanto el producto de PCR |

| |debido a un error de pipeta |tratado con ExoSAP-IT( como la mezcla de |

| | |secuenciación correspondiente se añaden y |

| | |se combinan. |

| |Se ha seleccionado un archivo de movilidad |Seleccione el archivo de movilidad |

| |incorrecto; los picos aparecerán |correcto. |

| |trasladados o superpuestos. | |

| |Se ha añadido EtOH 100% en exceso. |Resecuenciación. Compruebe que la pipeta |

| | |tiene el volumen correcto. |

|Señal débil |Las reacciones de secuenciación no se han |Repita las reacciones de secuenciación. |

| |agitado en vórtice correctamente tras la |Agite en vórtice (de 50 a 60 segundos) tras|

| |adición del tampón de PPT de secuenciación |la adición de EtOH. Asegúrese de que las |

| |y EtOH. |reacciones están mezcladas. |

| |Se debe aumentar el tiempo de inyección. |Repita las reacciones de secuenciación e |

| | |incremente el tiempo de inyección. |

|Manchas de coloración excesivas |El tampón de PPT de secuenciación no se ha |Repita la reacción de secuenciación. Añada |

| |agregado a las reacciones de secuenciación |el tampón de PPT de secuenciación antes que|

| |antes de la adición de EtOH. |el EtOH. |

| |Fallo al lavar las reacciones de |Repita las reacciones de secuenciación sin |

| |secuenciación con EtOH 70%. |omitir el paso de lavado con EtOH 70%. |

| |Reacción de secuenciación insuficiente |Asegúrese de que tanto el producto de PCR |

| |debido a un error de pipeta o a un producto|tratado con ExoSAP-IT( como la mezcla de |

| |de amplificación poco consistente. |secuenciación correspondiente se añaden y |

| | |se combinan. En caso de amplificación |

| | |débil, confirme la intensidad del producto |

| | |de amplificación utilizando gel de agarosa.|

| |Fallo al eliminar los restos de EtOH |Repita las reacciones de secuenciación. El |

| |durante la precipitación. |paso de centrifugado de 500 x g es muy |

| | |importante a la hora de eliminar el etanol |

| | |sobrante de los tubos de reacción. |

| |El EtOH utilizado en el paso de lavado |Repita las reacciones de secuenciación y |

| |estaba demasiado diluido. |confirme que se utiliza EtOH 70% en el paso|

| | |de lavado. |

|Potencia de señal excesiva |ABI 3100: Se ha establecido un tiempo de |ABI 3100: Reduzca el tiempo de inyección y |

| |inyección demasiado largo. |vuelva a efectuar la inyección. Las |

| | |potencias de señal comprendidas entre 300 y|

| | |3.000 son óptimas. (Es posible que las |

| | |muestras de poca calidad presenten una |

| | |potencia de señal inferior, aunque se |

| | |pueden analizar y efectuar un tipado de |

| | |ellas.). |

|Fallos aleatorios de secuencia |Reacción de secuenciación insuficiente |Asegúrese de que tanto el producto de PCR |

| |debido a un error de pipeta |tratado con ExoSAP-IT( como la mezcla de |

| | |secuenciación correspondiente se añaden y |

| | |se combinan. |

Licencias y marcas comerciales

AVISO AL COMPRADOR; LICENCIA LIMITADA

Toda licencia sujeta a las reivindicaciones sobre procesos de las Patentes estadounidenses: 151.507;5.171.534; 5.332.666; 5.242.796; 5.306.618; 5.366.860; 5.821.058 y/o de sus correspondientes extranjeras, tiene un componente de tarifa por adelantado y un componente de pago recurrente. El precio de compra de este equipo incluye derechos limitados no transferibles dentro del componente de pago recurrente para usar solo esta cantidad del producto para llevar a cabo el proceso de secuenciación del ADN descrito en las citadas patentes cuando este producto se utilice junto con un instrumento de Análisis de Secuencia de ADN Autorizado cuya utilización esté cubierta por el componente de tarifa por adelantado de estas patentes. No se otorga ningún otro derecho de manera expresa, por implicación, o por preclusión, o bajo ningún otro derecho de patente propiedad de Life Technologies Corporation (Invitrogen Corporation) o susceptible de ser entregado como licencia por esta empresa.

Para obtener más información sobre la compra de licencias para la realización de la secuenciación de ADN, pueden ponerse en contacto con el Director de Licencias de Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way Carlsbad CA 92008 EE. UU.

AVISO AL COMPRADOR; LICENCIA LIMITADA

El precio de compra de este equipo incluye una licencia de derecho limitado, no transferible, no exclusiva (sin derecho de reventa, reembalaje, o sub-licencia) dentro del proceso de solicitud de una o más de las Patentes estadounidenses 5.800.996, 5.863.727, y 5.945.526, y las reivindicaciones correspondientes en patentes y solicitudes de patentes extranjeras homólogas, para utilizar este producto únicamente con una máquina de secuenciación de ADN automatizada comercial de Life Technologies (Applied Biosystems LLC) que haya sido autorizada dentro de estas patentes por Life Technologies. Por la presente, no se otorga ninguna licencia para el uso de este equipo ni de los reactivos contenidos en cualquier otra máquina de secuenciación automática. Para obtener información relativa a la disponibilidad de licencias adicionales para la práctica de las metodologías patentadas, pueden ponerse en contacto con: Director de Licencias, Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way Carlsbad CA 92008 EE. UU.

AVISO AL COMPRADOR: SOBRE LA LICENCIA LIMITADA

Este equipo también se vende de conformidad con una sub-licencia limitada de Amersham International plc bajo una o más patentes estadounidenses con los números 5.498.523 y 5.614.365; y sus correspondientes patentes extranjeras y solicitudes de patentes. La compra de este equipo incluye una sub-licencia limitada no exclusiva (sin derecho de reventa, reembalaje, o sub-licencia) dentro de los derechos de esas patentes para usar este reactivo para la secuenciación del ADN únicamente con una máquina comercial automática de Secuenciación de ADN de Life Technologies (Applied Biosystems LLC). Por la presente, no se otorga ninguna licencia para el uso de este equipo ni de los reactivos contenidos en cualquier otra máquina de secuenciación automática. No se concede ninguna otra licencia de manera explícita, implícita o por preclusión. Para obtener información sobre la disponibilidad de licencias adicionales para la práctica de las metodologías patentadas, pueden ponerse en contacto con: Director de Licencias de Life Technologies Corporation

Marcas comerciales

SeCore es una marca comercial registrada de Life Technologies Corporation

Invitrogen es una marca comercial de Life Technologies Corporation

ABI PRISM, Applied Biosystems, BigDye son marcas comerciales registradas de Applied Biosystems LLC o sus filiales en Estados Unidos y otros países.

FastStart es una marca comercial de Roche Molecular Biochemicals.

ExoSap-IT es una marca comercial de USB Corporation

uTYPE es una marca comercial registrada de Life Technologies Corporation

Las demás marcas comerciales son propiedad exclusiva de sus respectivos propietarios.

PR043S

Revisión 06

Impreso el 6/09

|Representante en Europa: |

|Invitrogen Ltd. |

|11 Bassendale Road |

|Croft Business Park |

|Bromborough, Wirral |

|CH62 3QL, U.K. |

|Tel: 44 151 346 1234 |

| |

| |

|[pic] |

| |

| [pic] | Invitrogen Corporation |

| |9099 North Deerbrook Trail |

| |Brown Deer, Wisconsin 53223, USA |

| |Tel: (800) 955-6288 |

| |Fax: (800) 331-2286 |

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Para obtener los datos de contacto específicos de cada país, visite nuestro sitio web en



Invitrogen Corporation

9099 N. Deerbrook Trail

Brown Deer, Wisconsin 53223, USA

Tel. 1-800-955-6288

Fax 1-800-331-2286

Email: catalog@

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