UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO



CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA

DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA

Prof. Alexandra

Enzimas (esquema de aula)

PARTE I

1 CONCEITO - catalisadores biológicos

2 IMPORTÂNCIA - responsável pelas reações que ocorrem nas células

3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA

Enzimas Simples quando são formadas por proteínas de estruturas terciárias ou quaternárias

Enzimas Conjugadas quando além das proteínas contêm:

• Grupamentos químicos denominados de COENZIMAS; ex: vitaminas

• Metais - denominados de COFATORES; ex: Na+, Mn++, Mg++, Zn++, Fe++,...

GRUPO PROSTÉTICO – quando os cofatores estão fortemente ligados à enzima, não se dissociando da mesma.

APOENZIMA + COENZIMA HOLOENZIMA

(forma inativa) (forma ativa)

4 PROPRIEDADES

• ALTA EFICIÊNCIA CATALÍTICA

( aumenta a velocidade da reação - as reações enzimáticas são cerca de 100 a 1000 vezes mais rápidas

Atenção: Atividade enzimática x Constante de equilíbrio

Ex: A B Keq ( 1 As concentrações de A e B são iguais no equilíbrio, com ou sem enzima

( diminui a energia de ativação da reação

• ESPECIFICIDADE ( Absoluta quando a enzima atua sobre um único substrato

← Relativa quando a enzima atua sobre compostos relacionados

← Estereoespecificidade quando a enzima atua sobre um isômero ótico d/l não reconhecendo o outro isômero

Centro Ativo - região da enzima onde ocorre a reação enzimática, podendo ser subdividida em:

Sítio catalítico ou ativo ( onde há conversão do substrato em produto devido a interações fortes entre os aminoácidos do sítio e o substrato

Sítio estérico ou de posicionamento ( tem forma complementar ao substrato, favorecendo a estabilização do estado de transição, e consequentemente, a reação enzimática.

Características dos sítios:

➢ São fendas na estrutura da enzima

➢ São tridimensionais

➢ Ocupam pequena região da enzima

• DESNATURAÇÃO PELO CALOR

• PRECIPITAÇÃO COM ETANOL OU (NH4)2SO4

• NÃO DIALIZAM POR MEMBRANAS SEMI-PERMEÁVEIS

• PESO MOLECULAR – 10 a 1.000 KDa

5 MODELO MATEMÁTICO DAS REAÇÕES ENZIMÁTICAS

E + S ( (ES( E + P

Mecanismos Físicos

Químicos

Etapas:

• Ativação do Substrato ( complexo ES

• Ativação da Enzima ( ligações

• Liberação do Produto (o produto tem pouca afinidade pelo sítio)

• Regeneração da Enzima

Enzimas

PARTE II – CINÉTICA ENZIMÁTICA

Fatores que influenciam a atividade enzimática

• Temperatura

( 100 oC por mais de 1 min ( desnaturação total

( < O oC ( perda parcial de atividade em função do tempo

Classificação das enzimas em função da temperatura ótima: criofílicas, mesofílicas e termofílicas.

• pH

pH ótimo ( faixa de pH / valor de pH em que a atividade enzimática é máxima

ATENÇÃO: O processo tecnológico deve ser desenvolvido em pH afastado do ponto isoelétrico da proteína

• Radiação Ultravioleta

• Estruturas Químicas – ATIVADOR

- INIBIDOR

• Concentração de Enzima

• Concentração do Substrato

Equação de Michaelis-Menten

v =

Considerando:

- T e pH ótimos

- Concentração da enzima constante

Sendo:

- v - velocidade da reação

- VMAX - velocidade máxima

- [ S ] - concentração do substrato

- KM - Constante de Michaelis

SIGNIFICADO: KM = [ S ] quando v = VMAX / 2

Equação de Lineweaver – Burk

1 / v = 1 / V + KM / VMAX . 1 / [ S ]

INTERCEPTOS

INCLINAÇÃO

Atividade:

Determinar KM e VMAX para uma enzima a partir dos seguintes dados de concentração de substrato e velocidade da reação:

|[ S ] (mM) |v ((M.s-1) |

|1 |2,5 |

|2 |4,0 |

|5 |6,3 |

|10 |7,6 |

|20 |9,0 |

Enzimas

PARTE III - REGULAÇÃO ENZIMÁTICA

Tipos de regulação metabólica:

As vias metabólicas são auto-controladas

(i) Controle direto da catálise a nível cinético

Ex: alterações da concentração do substrato, coenzimas ou cofatores;

variações de pH e de temperatura

(ii) Controle da disponibilidade da enzima - está relacionado às taxas de síntese e de degradação da enzima

controle genético ( genes

• Indução ( é necessário uma específica substância (substrato) para síntese da enzima

• Repressão ( uma substância previne a síntese da enzima

Ex: Escherichia coli lactose LACTASE

Enzimas constitutivas: são produzidas independentes da composição do meio

Enzimas induzidas: são sintetizadas em função da presença de uma substância específica (substrato)

(iii) Controle da atividade da enzima - está relacionado a alterações conformacionais ou estruturais da molécula protéica

Agente: Enzimas alostéricas ( enzimas constituídas de muitas sub-unidades que além do sítio catalítico apresentam um sítio específico: sítio alostérico

Sítio alostérico - regula a atividade da enzima dependendo da ação do ligante

Ligantes - são estruturas ou substâncias químicas que têm afinidade pelo sítio alostérico, inibindo ou ativando a enzima por alteração da conformação nativa

Efeito homotrópico - ligante idêntico ao substrato

Efeito heterotrópico - ligante diferente do substrato

Positivo ( ativador

Negativo ( inibidor

TIPOS DE REGULAÇÃO ALOSTÉRICA

• Inibição por retroalimentação (feedback): quando um dos produtos ao atingir uma determinada concentração, atua como ligante inibidor da enzima;

• Ativação precursora: quando a presença de uma substância (dependendo da concentração) atua como ativador de uma enzima;

• Controle energético: quando o ATP (por exemplo) é responsável pela regulação da reação;

• Controle hormonal: quando um hormônio atua como ligante de uma enzima alostérica.

(iv) Regulação por modificação covalente ( síntese de enzimas numa forma inativa

( precursor é ativado no tempo e lugar fisiologicamente apropriado

Ex: proteases

Enzimas

PARTE IV - INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

Tipos de inibição enzimática:

Irreversível - o inibidor liga-se fortemente à enzima, modificando o grupamento funcional do centro ativo e consequentemente, inativando a enzima.

Ex:

…-aa-aa-aa - CH2SH + ICH2 - CO- NH2 …-aa-aa-aa - CH2 - SCH2 - CO - NH2 + HI

Onde: …-aa-aa-aa = cadeia polipeptídica

- CH2SH = sítio catalítico

Reversível - rápida dissociação do complexo formado com o inibidor.

A inibição reversível pode ser:

a) Competitiva - inibidor tem estrutura semelhante ao substrato;

pode ser suprimida pelo aumento da concentração do substrato

E + S ( ES ( E + P

+

I

(

EI + S (não reagem)

Representar graficamente por Lineweaver-Burk:

Não-competitiva - quando o substrato e o inibidor podem ligar-se à enzima simultaneamente

- o inibidor não compete com o substrato pelo sítio ativo

E + S ( ES ( P + E

+ +

I I

( (

EI + S ( ESI

Atenção: - os sítios de ligação não se sobrepõem

- diminui a concentração da enzima disponível para se complexar com o substrato

Representar graficamente por Lineweaver-Burk:

Ex: …-aa-aa-aa ( Fe + 2 CN- ( …-aa-aa-aa - Fe ( CN

CN

…-aa-aa-aa ( Ca + 2 F- ( …-aa-aa-aa – Ca ( F

F

c) Incompetitiva - o inibidor liga-se a um sítio diferente do centro ativo,

especificamente ao complexo ES

E + S ( ES ( E + P

+

I

(

ESI

d) Inibição mista - inibidor modifica ligação do substrato, alterando o número de moléculas de enzimas

Enzimas

PARTE V - ATIVIDADE ENZIMÁTICA INTERNACIONAL

Condições

▪ co-fatores e/ou coenzimas em excesso

▪ concentração do substrato acima do nível de saturação

▪ pH e temperatura ótimos

Fundamento

▪ consumo do substrato

▪ aparecimento do produto

▪ variação da concentração de qualquer componente da reação

▪ condição - velocidade de ordem zero para o substrato

[ E ] FATOR LIMITANTE

V & [ E ]

Técnicas

(i) Espectrofotometria

CONDIÇÃO - Espectro de absorção característico para S, P ou complexo colorido resultante

Ex: S + REATIVOS COMPLEXO / COMPOSTO COLORIDO

VANTAGENS - específico, sensível, rápido

DESVANTAGEM - Interferências por componentes metabólicos na densidade ótica / absorção de luz

ETAPAS ( Reação Enzimática

← Parar a reação

← Reação Colorimétrica

(ii) Cromatografia

(iii) Titulometria

(iv) Uso de radioisótopos

Enzimas

PARTE VI - NOMENCLATURA E CLASSIFICAÇÃO

Nomenclaturas

1 Oficial – sistemática

terminação: ase

• palavra sistema para conjunto de enzimas

• nomes de substrato/ produto, cofatores, ...

classificação da reação segundo a comissão de enzimas

ATENÇÃO - ISOENZIMAS / ISOZIMAS são enzimas que apresentam estruturas químicas diferentes e que catalizam a mesma reação.

2 Usual / vulgar - não tem regras específicas

3 Recomendada - para algumas enzimas

nomenclatura oficial simplificada

nomenclatura usual

Número de código - EC (Enzyme Comission)

EC - CÓDIGO DA ENZIMA FORMADO POR ALGARISMOS SEPARADOS POR PONTOS

1o ALGARISMO – classe da enzima

2o ALGARISMO – subclasse

3o ALGARISMO – subsubclasse

4o ALGARISMO – ordenação da enzima na classificação

Ex: E. C. 3.2.1.2 1,4-(-D-GLUCANO-MALTOHIDROLASE

MALTASE

GLUCOMALTASE

Classificação das enzimas segundo a comissão de enzimas

1 ÓXIDOREDUTASES – catalisam reação de oxidação-redução

Subclasses:

1.1 atuando no grupo CH OH

1.2 atuando na carbonila

1.3 atuando em C O-

1.4 atuando em CH NH2

1.5 atuando em CH NH2-

1.6 atuando em NADH, NADPH

Exemplos de subclasses de aplicação tecnológica:

• desidrogenases - transferem hidrogênio para estrutura diferente do oxigênio

• oxidases - quando o oxigênio é o acceptor de hidrogênio

2 TRANSFERASES - catalizam a transferência de grupo funcional

Subclasses:

2.1 grupos com um carbono

2.2 grupos aldeído ou cetona

2.3 grupo acil

2.4 grupo glicosil

2.7 grupo fosfato

2.8 grupo contendo enxofre

Exemplos de subclasses de aplicação tecnológica:

• QUINASES – ENVOLVEM GRUPO FOSFATO

• TRANSAMINASES – TRANSFEREM GRUPO AMINO

Ex: glicoquinase

frutoquinase

transaminase

3 HIDROLASES - catalizam reações de hidrólise

Exemplos de subclasses:

3.1 reação de ésteres - ESTERASES

3.2 reação em ligação glicosídica - GLICOSIDASES

3.4 reação em ligação peptídica – PEPTIDASES

(EC) 3.4.21 SERINA

(EC) 3.4.22 CISTEÍNA

(EC) 3.4.23 ENDOPEPTIDASE

(EC) 3.4.24 METALOENDOPEPTIDASE

(EC) 3.4.99 ENZIMAS CUJOS METABOLISMOS NÃO ESTÃO ELUCIDADOS

3.5 em outras ligações C N

3.6 hidrólise de anidridos ácidos

Exemplos de aplicação tecnológica: proteases, amilases, celulases, lipases, ...

4 LIASES - catalizam quebra de ligações covalentes e remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico

Exemplos de subclasses:

4.1 C C

4.2 C O

4.3 C N

Exemplos de aplicação tecnológica:

DEHIDRATASES – perda de água

DESCARBOXILASES – eliminação de CO2

Ex: descarboxilase pirúvica (via glicolítica)

5 ISOMERASES - catalizam reações de interconversão entre isômeros

Exemplos de subclasses:

5.1 racemases

5.2 epimerases

Exemplos de aplicação tecnológica: glicose-isomerase/xilose-isomerase

6 LIGASES / SINTETASES – catalizam síntese de compostos a partir de moléculas pequenas envolvendo consumo de energia

Exemplos de subclasses:

6.1

Enzimas

PARTE VII - PRODUÇÃO DE ENZIMAS

FONTES ( vegetal - ex: papaina

animal - ex: renina

microbiana - ex: invertase, amilases, celulases

(

VANTAGENS ( facilidade de manipulação genética e de produção - tempo, espaço, quantidade

ETAPAS

1. SELEÇÃO DO MICRORGANISMO (LINHAGEM/CEPA)

( isolamento (screening) ( novas linhagens

( modificação genética ( maior produtividade

atividade específica

( manutenção da cultura ( reprodutibilidade de produção

2. INOCULAÇÃO

( culturas novas EVITAR LAG FASE

( mesmas condições físico-químicas

( volume: 5 a 20%

( otimização da idade do inóculo ( maior produtividade

3. PRODUÇÃO

3.1 CONDIÇÕES NUTRITIVAS ( fonte de carbono resíduos

fonte de nitrogênio industriais

← outros nutrientes

MEIO DE CULTURA água

3.2 CONDIÇÕES FÍSICAS ( temperatura

pH otimização do

agitação processo

aeração

3.3 FERMENTAÇÃO

( estacionária / de superfície – em bandejas

( submersa – com agitação

Técnicas de Operação de Cultivo

• DESCONTÍNUA - batelada

batelada alimentada

• CONTÍNUA

4 EXTRAÇÃO

• CENTRIFUGAÇÃO ( CÉLULAS - enzimas intracelulares

( SOBRENADANTE - extrato bruto contendo enzimas extracelulares

• LIBERAÇÃO DE ENZIMAS INTRACELULARES – proteases

Técnicas:

• AQUECIMENTO ( autólise sem desnaturação de proteínas

• ULTRA-SOM ( quantidade mínimas

• ABRASIVOS

CENTRIFUGAÇÃO ( restos celulares

( extrato bruto com enzimas intracelulares

5 PURIFICAÇÃO

( PRECIPITAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

( FRACIONAMENTO PROTEICO - sulfato de amônio

( CROMATOGRAFIA

6. IMOBILIZAÇÃO

1. CONCEITO ( fixação de enzimas / células* a um material

inerte insolúvel (suporte)

(

eficiência depende de fatores ambietais

2. VANTAGENS ( reutilização em sucessivos ciclos

produtos mais puros

maior estabilidade operacional

uso contínuo

maior produtividade

reatores menores

* regeneração de cofator

* não afeta a conformação da enzima

3. MÉTODOS

(i) Adsorção ( interaçãode caráter físico entre célula / enzima e suporte ex: carvão ativado

cerâmica

diatomácea

vidro poroso

DESVANTAGENS – deadsorção / lixiviação por diferença d temperatura, de força iônica, pelo próprio produto

(ii) Troca iônica ( interação entre cargas eletrosáicas na parede celular e no suporte

SUPORTE ( resignas trocadoras de íons CM-celulose

DEAE-celulose

DESVANTAGEM – enzimas / células são arrastadas principalmente por variação de pH

(iii) Ligação Covalente ( seletividade

retenção de atividade > 100%

( SUPORTES – dracron

nylon-poliacrilamida

( REAGENTES BIFUNCIONAIS – glutaraldeido

( s-triazina

FORMAR “BRAÇOS” (SPACER)

iv) Enclausuramento ou Inclusão ( envolvimento da enzima célula pelo suporte

• CONDIÇÃO - poros do suporte permite apenas passagem do substrato e do produto

• SUPORTE - Ex: gel de poliacrilamida cujos poros dependem da concentração dos

manômeros

• ESTABILIZADOR - Ex: detergente.

7 FORMULAÇÃO

• Conservantes: formol, sorbatos

• Inibidores de proteases – ex: PMSF, pepstatin, benzamidina, fenantrolina, chemostatin

• Detergentes – nonifenol, Tween-80, Triton X-100

• Quelantes – EDTA, EGTA, ATNB

• Estabilizadores – albumina, polietilenoglicol (ATPEG), glicerol, sacarose, CMC

Obs: (i) Benzamidina – Ki = 0,01 – 1 mM – é efetivo apenas a 10 mM – 1 M.

(ii) SDS a 1 % ativa

8 COMERCIALIZAÇÃO

• EXTRATO BRUTO OU PARCIALMENTE PURIFICADO

SECO - em secadores a vácuo ou atmosféricos, liofilizador

( MOÍDO ( partículas de tamanho adequado

LÍQUIDO

( CONCENTRADO - por evaporação ou ultrafiltração em membranas

• IMOBILIZADO

Enzimas

PARTE VIII - ENZIMAS DE IMPORTÂNCIA INDUSTRIAL

ENZIMA ORIGEM APLICAÇÃO

(, ( amilases cereais germinados cerveja, panificação

(-amilase fungos panificação, confeitaria

(-amilase bactérias têxtil, cerveja, confeitaria

glucoamilase fungos cerveja

pectinase fungos sucos de fruta, doces

celulases fungos farmacêutica, alimentos

lactase fungo e levedura produtos lácteos

invertase levedura confeitaria

papaína mamão cerveja, farmacêutica

bromelina abacaxi farmacêutica

pepsina estômago do bezerro farmacêutica, panificação

protease fúngica fungo panificação

protease alcalina bactéria detergentes

lipase bactéria, fungo farmacêutica, detergente, alimentos

glucose oxidase fungo alimentos conservados, bebidas

glucose isomerase bactéria corantes

oxidases fungos filamentosos descontaminação de poluentes da indústria

petrolífera, de papel e têxtil

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Eat = Energia de ativação da reação

Enzima substrato complexo produto

VMAX . S

KM + S

Tempo

Energia

Condição 1: sem inibição

Condição 2: inibição não-competitiva

Sendo: Vmax 1 > Vmax 2

Km - constante

Condição 1: sem inibidor

Condição 2: com inibidor

Sendo: Vmax - constante

Km 1 < Km 2

Energia mínima necessária para ocorrer reação

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