UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA
Prof. Alexandra
Enzimas (esquema de aula)
PARTE I
1 CONCEITO - catalisadores biológicos
2 IMPORTÂNCIA - responsável pelas reações que ocorrem nas células
3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA
Enzimas Simples quando são formadas por proteínas de estruturas terciárias ou quaternárias
Enzimas Conjugadas quando além das proteínas contêm:
• Grupamentos químicos denominados de COENZIMAS; ex: vitaminas
• Metais - denominados de COFATORES; ex: Na+, Mn++, Mg++, Zn++, Fe++,...
GRUPO PROSTÉTICO – quando os cofatores estão fortemente ligados à enzima, não se dissociando da mesma.
APOENZIMA + COENZIMA HOLOENZIMA
(forma inativa) (forma ativa)
4 PROPRIEDADES
• ALTA EFICIÊNCIA CATALÍTICA
( aumenta a velocidade da reação - as reações enzimáticas são cerca de 100 a 1000 vezes mais rápidas
Atenção: Atividade enzimática x Constante de equilíbrio
Ex: A B Keq ( 1 As concentrações de A e B são iguais no equilíbrio, com ou sem enzima
( diminui a energia de ativação da reação
• ESPECIFICIDADE ( Absoluta quando a enzima atua sobre um único substrato
← Relativa quando a enzima atua sobre compostos relacionados
← Estereoespecificidade quando a enzima atua sobre um isômero ótico d/l não reconhecendo o outro isômero
Centro Ativo - região da enzima onde ocorre a reação enzimática, podendo ser subdividida em:
Sítio catalítico ou ativo ( onde há conversão do substrato em produto devido a interações fortes entre os aminoácidos do sítio e o substrato
Sítio estérico ou de posicionamento ( tem forma complementar ao substrato, favorecendo a estabilização do estado de transição, e consequentemente, a reação enzimática.
Características dos sítios:
➢ São fendas na estrutura da enzima
➢ São tridimensionais
➢ Ocupam pequena região da enzima
• DESNATURAÇÃO PELO CALOR
• PRECIPITAÇÃO COM ETANOL OU (NH4)2SO4
• NÃO DIALIZAM POR MEMBRANAS SEMI-PERMEÁVEIS
• PESO MOLECULAR – 10 a 1.000 KDa
5 MODELO MATEMÁTICO DAS REAÇÕES ENZIMÁTICAS
E + S ( (ES( E + P
Mecanismos Físicos
Químicos
Etapas:
• Ativação do Substrato ( complexo ES
• Ativação da Enzima ( ligações
• Liberação do Produto (o produto tem pouca afinidade pelo sítio)
• Regeneração da Enzima
Enzimas
PARTE II – CINÉTICA ENZIMÁTICA
Fatores que influenciam a atividade enzimática
• Temperatura
( 100 oC por mais de 1 min ( desnaturação total
( < O oC ( perda parcial de atividade em função do tempo
Classificação das enzimas em função da temperatura ótima: criofílicas, mesofílicas e termofílicas.
• pH
pH ótimo ( faixa de pH / valor de pH em que a atividade enzimática é máxima
ATENÇÃO: O processo tecnológico deve ser desenvolvido em pH afastado do ponto isoelétrico da proteína
• Radiação Ultravioleta
• Estruturas Químicas – ATIVADOR
- INIBIDOR
• Concentração de Enzima
• Concentração do Substrato
Equação de Michaelis-Menten
v =
Considerando:
- T e pH ótimos
- Concentração da enzima constante
Sendo:
- v - velocidade da reação
- VMAX - velocidade máxima
- [ S ] - concentração do substrato
- KM - Constante de Michaelis
SIGNIFICADO: KM = [ S ] quando v = VMAX / 2
Equação de Lineweaver – Burk
1 / v = 1 / V + KM / VMAX . 1 / [ S ]
INTERCEPTOS
INCLINAÇÃO
Atividade:
Determinar KM e VMAX para uma enzima a partir dos seguintes dados de concentração de substrato e velocidade da reação:
|[ S ] (mM) |v ((M.s-1) |
|1 |2,5 |
|2 |4,0 |
|5 |6,3 |
|10 |7,6 |
|20 |9,0 |
Enzimas
PARTE III - REGULAÇÃO ENZIMÁTICA
Tipos de regulação metabólica:
As vias metabólicas são auto-controladas
(i) Controle direto da catálise a nível cinético
Ex: alterações da concentração do substrato, coenzimas ou cofatores;
variações de pH e de temperatura
(ii) Controle da disponibilidade da enzima - está relacionado às taxas de síntese e de degradação da enzima
controle genético ( genes
• Indução ( é necessário uma específica substância (substrato) para síntese da enzima
• Repressão ( uma substância previne a síntese da enzima
Ex: Escherichia coli lactose LACTASE
Enzimas constitutivas: são produzidas independentes da composição do meio
Enzimas induzidas: são sintetizadas em função da presença de uma substância específica (substrato)
(iii) Controle da atividade da enzima - está relacionado a alterações conformacionais ou estruturais da molécula protéica
Agente: Enzimas alostéricas ( enzimas constituídas de muitas sub-unidades que além do sítio catalítico apresentam um sítio específico: sítio alostérico
Sítio alostérico - regula a atividade da enzima dependendo da ação do ligante
Ligantes - são estruturas ou substâncias químicas que têm afinidade pelo sítio alostérico, inibindo ou ativando a enzima por alteração da conformação nativa
Efeito homotrópico - ligante idêntico ao substrato
Efeito heterotrópico - ligante diferente do substrato
Positivo ( ativador
Negativo ( inibidor
TIPOS DE REGULAÇÃO ALOSTÉRICA
• Inibição por retroalimentação (feedback): quando um dos produtos ao atingir uma determinada concentração, atua como ligante inibidor da enzima;
• Ativação precursora: quando a presença de uma substância (dependendo da concentração) atua como ativador de uma enzima;
• Controle energético: quando o ATP (por exemplo) é responsável pela regulação da reação;
• Controle hormonal: quando um hormônio atua como ligante de uma enzima alostérica.
(iv) Regulação por modificação covalente ( síntese de enzimas numa forma inativa
( precursor é ativado no tempo e lugar fisiologicamente apropriado
Ex: proteases
Enzimas
PARTE IV - INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
Tipos de inibição enzimática:
Irreversível - o inibidor liga-se fortemente à enzima, modificando o grupamento funcional do centro ativo e consequentemente, inativando a enzima.
Ex:
…-aa-aa-aa - CH2SH + ICH2 - CO- NH2 …-aa-aa-aa - CH2 - SCH2 - CO - NH2 + HI
Onde: …-aa-aa-aa = cadeia polipeptídica
- CH2SH = sítio catalítico
Reversível - rápida dissociação do complexo formado com o inibidor.
A inibição reversível pode ser:
a) Competitiva - inibidor tem estrutura semelhante ao substrato;
pode ser suprimida pelo aumento da concentração do substrato
E + S ( ES ( E + P
+
I
(
EI + S (não reagem)
Representar graficamente por Lineweaver-Burk:
Não-competitiva - quando o substrato e o inibidor podem ligar-se à enzima simultaneamente
- o inibidor não compete com o substrato pelo sítio ativo
E + S ( ES ( P + E
+ +
I I
( (
EI + S ( ESI
Atenção: - os sítios de ligação não se sobrepõem
- diminui a concentração da enzima disponível para se complexar com o substrato
Representar graficamente por Lineweaver-Burk:
Ex: …-aa-aa-aa ( Fe + 2 CN- ( …-aa-aa-aa - Fe ( CN
CN
…-aa-aa-aa ( Ca + 2 F- ( …-aa-aa-aa – Ca ( F
F
c) Incompetitiva - o inibidor liga-se a um sítio diferente do centro ativo,
especificamente ao complexo ES
E + S ( ES ( E + P
+
I
(
ESI
d) Inibição mista - inibidor modifica ligação do substrato, alterando o número de moléculas de enzimas
Enzimas
PARTE V - ATIVIDADE ENZIMÁTICA INTERNACIONAL
Condições
▪ co-fatores e/ou coenzimas em excesso
▪ concentração do substrato acima do nível de saturação
▪ pH e temperatura ótimos
Fundamento
▪ consumo do substrato
▪ aparecimento do produto
▪ variação da concentração de qualquer componente da reação
▪ condição - velocidade de ordem zero para o substrato
[ E ] FATOR LIMITANTE
V & [ E ]
Técnicas
(i) Espectrofotometria
CONDIÇÃO - Espectro de absorção característico para S, P ou complexo colorido resultante
Ex: S + REATIVOS COMPLEXO / COMPOSTO COLORIDO
VANTAGENS - específico, sensível, rápido
DESVANTAGEM - Interferências por componentes metabólicos na densidade ótica / absorção de luz
ETAPAS ( Reação Enzimática
← Parar a reação
← Reação Colorimétrica
(ii) Cromatografia
(iii) Titulometria
(iv) Uso de radioisótopos
Enzimas
PARTE VI - NOMENCLATURA E CLASSIFICAÇÃO
Nomenclaturas
1 Oficial – sistemática
terminação: ase
• palavra sistema para conjunto de enzimas
• nomes de substrato/ produto, cofatores, ...
classificação da reação segundo a comissão de enzimas
ATENÇÃO - ISOENZIMAS / ISOZIMAS são enzimas que apresentam estruturas químicas diferentes e que catalizam a mesma reação.
2 Usual / vulgar - não tem regras específicas
3 Recomendada - para algumas enzimas
nomenclatura oficial simplificada
nomenclatura usual
Número de código - EC (Enzyme Comission)
EC - CÓDIGO DA ENZIMA FORMADO POR ALGARISMOS SEPARADOS POR PONTOS
1o ALGARISMO – classe da enzima
2o ALGARISMO – subclasse
3o ALGARISMO – subsubclasse
4o ALGARISMO – ordenação da enzima na classificação
Ex: E. C. 3.2.1.2 1,4-(-D-GLUCANO-MALTOHIDROLASE
MALTASE
GLUCOMALTASE
Classificação das enzimas segundo a comissão de enzimas
1 ÓXIDOREDUTASES – catalisam reação de oxidação-redução
Subclasses:
1.1 atuando no grupo CH OH
1.2 atuando na carbonila
1.3 atuando em C O-
1.4 atuando em CH NH2
1.5 atuando em CH NH2-
1.6 atuando em NADH, NADPH
Exemplos de subclasses de aplicação tecnológica:
• desidrogenases - transferem hidrogênio para estrutura diferente do oxigênio
• oxidases - quando o oxigênio é o acceptor de hidrogênio
2 TRANSFERASES - catalizam a transferência de grupo funcional
Subclasses:
2.1 grupos com um carbono
2.2 grupos aldeído ou cetona
2.3 grupo acil
2.4 grupo glicosil
2.7 grupo fosfato
2.8 grupo contendo enxofre
Exemplos de subclasses de aplicação tecnológica:
• QUINASES – ENVOLVEM GRUPO FOSFATO
• TRANSAMINASES – TRANSFEREM GRUPO AMINO
Ex: glicoquinase
frutoquinase
transaminase
3 HIDROLASES - catalizam reações de hidrólise
Exemplos de subclasses:
3.1 reação de ésteres - ESTERASES
3.2 reação em ligação glicosídica - GLICOSIDASES
3.4 reação em ligação peptídica – PEPTIDASES
(EC) 3.4.21 SERINA
(EC) 3.4.22 CISTEÍNA
(EC) 3.4.23 ENDOPEPTIDASE
(EC) 3.4.24 METALOENDOPEPTIDASE
(EC) 3.4.99 ENZIMAS CUJOS METABOLISMOS NÃO ESTÃO ELUCIDADOS
3.5 em outras ligações C N
3.6 hidrólise de anidridos ácidos
Exemplos de aplicação tecnológica: proteases, amilases, celulases, lipases, ...
4 LIASES - catalizam quebra de ligações covalentes e remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico
Exemplos de subclasses:
4.1 C C
4.2 C O
4.3 C N
Exemplos de aplicação tecnológica:
DEHIDRATASES – perda de água
DESCARBOXILASES – eliminação de CO2
Ex: descarboxilase pirúvica (via glicolítica)
5 ISOMERASES - catalizam reações de interconversão entre isômeros
Exemplos de subclasses:
5.1 racemases
5.2 epimerases
Exemplos de aplicação tecnológica: glicose-isomerase/xilose-isomerase
6 LIGASES / SINTETASES – catalizam síntese de compostos a partir de moléculas pequenas envolvendo consumo de energia
Exemplos de subclasses:
6.1
Enzimas
PARTE VII - PRODUÇÃO DE ENZIMAS
FONTES ( vegetal - ex: papaina
animal - ex: renina
microbiana - ex: invertase, amilases, celulases
(
VANTAGENS ( facilidade de manipulação genética e de produção - tempo, espaço, quantidade
ETAPAS
1. SELEÇÃO DO MICRORGANISMO (LINHAGEM/CEPA)
( isolamento (screening) ( novas linhagens
( modificação genética ( maior produtividade
atividade específica
( manutenção da cultura ( reprodutibilidade de produção
2. INOCULAÇÃO
( culturas novas EVITAR LAG FASE
( mesmas condições físico-químicas
( volume: 5 a 20%
( otimização da idade do inóculo ( maior produtividade
3. PRODUÇÃO
3.1 CONDIÇÕES NUTRITIVAS ( fonte de carbono resíduos
fonte de nitrogênio industriais
← outros nutrientes
MEIO DE CULTURA água
3.2 CONDIÇÕES FÍSICAS ( temperatura
pH otimização do
agitação processo
aeração
3.3 FERMENTAÇÃO
( estacionária / de superfície – em bandejas
( submersa – com agitação
Técnicas de Operação de Cultivo
• DESCONTÍNUA - batelada
batelada alimentada
• CONTÍNUA
4 EXTRAÇÃO
• CENTRIFUGAÇÃO ( CÉLULAS - enzimas intracelulares
( SOBRENADANTE - extrato bruto contendo enzimas extracelulares
• LIBERAÇÃO DE ENZIMAS INTRACELULARES – proteases
Técnicas:
• AQUECIMENTO ( autólise sem desnaturação de proteínas
• ULTRA-SOM ( quantidade mínimas
• ABRASIVOS
CENTRIFUGAÇÃO ( restos celulares
( extrato bruto com enzimas intracelulares
5 PURIFICAÇÃO
( PRECIPITAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
( FRACIONAMENTO PROTEICO - sulfato de amônio
( CROMATOGRAFIA
6. IMOBILIZAÇÃO
1. CONCEITO ( fixação de enzimas / células* a um material
inerte insolúvel (suporte)
(
eficiência depende de fatores ambietais
2. VANTAGENS ( reutilização em sucessivos ciclos
produtos mais puros
maior estabilidade operacional
uso contínuo
maior produtividade
reatores menores
* regeneração de cofator
* não afeta a conformação da enzima
3. MÉTODOS
(i) Adsorção ( interaçãode caráter físico entre célula / enzima e suporte ex: carvão ativado
cerâmica
diatomácea
vidro poroso
DESVANTAGENS – deadsorção / lixiviação por diferença d temperatura, de força iônica, pelo próprio produto
(ii) Troca iônica ( interação entre cargas eletrosáicas na parede celular e no suporte
SUPORTE ( resignas trocadoras de íons CM-celulose
DEAE-celulose
DESVANTAGEM – enzimas / células são arrastadas principalmente por variação de pH
(iii) Ligação Covalente ( seletividade
retenção de atividade > 100%
( SUPORTES – dracron
nylon-poliacrilamida
( REAGENTES BIFUNCIONAIS – glutaraldeido
( s-triazina
FORMAR “BRAÇOS” (SPACER)
iv) Enclausuramento ou Inclusão ( envolvimento da enzima célula pelo suporte
• CONDIÇÃO - poros do suporte permite apenas passagem do substrato e do produto
• SUPORTE - Ex: gel de poliacrilamida cujos poros dependem da concentração dos
manômeros
• ESTABILIZADOR - Ex: detergente.
7 FORMULAÇÃO
• Conservantes: formol, sorbatos
• Inibidores de proteases – ex: PMSF, pepstatin, benzamidina, fenantrolina, chemostatin
• Detergentes – nonifenol, Tween-80, Triton X-100
• Quelantes – EDTA, EGTA, ATNB
• Estabilizadores – albumina, polietilenoglicol (ATPEG), glicerol, sacarose, CMC
Obs: (i) Benzamidina – Ki = 0,01 – 1 mM – é efetivo apenas a 10 mM – 1 M.
(ii) SDS a 1 % ativa
8 COMERCIALIZAÇÃO
• EXTRATO BRUTO OU PARCIALMENTE PURIFICADO
SECO - em secadores a vácuo ou atmosféricos, liofilizador
( MOÍDO ( partículas de tamanho adequado
LÍQUIDO
( CONCENTRADO - por evaporação ou ultrafiltração em membranas
• IMOBILIZADO
Enzimas
PARTE VIII - ENZIMAS DE IMPORTÂNCIA INDUSTRIAL
ENZIMA ORIGEM APLICAÇÃO
(, ( amilases cereais germinados cerveja, panificação
(-amilase fungos panificação, confeitaria
(-amilase bactérias têxtil, cerveja, confeitaria
glucoamilase fungos cerveja
pectinase fungos sucos de fruta, doces
celulases fungos farmacêutica, alimentos
lactase fungo e levedura produtos lácteos
invertase levedura confeitaria
papaína mamão cerveja, farmacêutica
bromelina abacaxi farmacêutica
pepsina estômago do bezerro farmacêutica, panificação
protease fúngica fungo panificação
protease alcalina bactéria detergentes
lipase bactéria, fungo farmacêutica, detergente, alimentos
glucose oxidase fungo alimentos conservados, bebidas
glucose isomerase bactéria corantes
oxidases fungos filamentosos descontaminação de poluentes da indústria
petrolífera, de papel e têxtil
-----------------------
Eat = Energia de ativação da reação
Enzima substrato complexo produto
VMAX . S
KM + S
Tempo
Energia
Condição 1: sem inibição
Condição 2: inibição não-competitiva
Sendo: Vmax 1 > Vmax 2
Km - constante
Condição 1: sem inibidor
Condição 2: com inibidor
Sendo: Vmax - constante
Km 1 < Km 2
Energia mínima necessária para ocorrer reação
................
................
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