SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE



SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

1126286

GENETICKÉ TRANSFORMÁCIE RASTLÍN A ICH APLIKÁKCIE

2010 Pavol Dubnický

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

GENETICKÉ TRANSFORMÁCIE RASTLÍN A ICH APLIKÁKCIE

Bakalárska práca

|Študijný program: |aplikovaná biológia |

|Študijný obor: |4.2.1 biológia |

|Školiace pracovisko: |Katedra biochémie a biotechnológie. FBP SPU v Nitre |

| |Ústav genetiky a biotechnológie rastlín SAV Nitra |

|Školiteľ: |prof. RNDr. Zdenka Gálová, CSc., FBP SPU v Nitre |

|Konzultant: |Ing. Jana Moravčíková, PhD., ÚGBR SAV Nitra |

Nitra 2010 Pavol Dubnický

Čestné vyhlásenie

Podpísaný Pavol Dubnický vyhlasujem, že som bakalársku prácu na tému „Genetické transformácie rastlín a ich aplikácie“ vypracoval samostatne s použitím uvedenej literatúry. Práca bola vypracovaná v rámci riešenia projektu podporovaného grantom z Islandu, Lichtenštajnska a Nórska prostredníctvom Finančného mechanizmu EHP a Nórskeho finančného mechanizmu SAV-FM-EHP-2008-02-01 a projektu VEGA č. 2/0011/08.

Som si vedomý zákonných dôsledkov v prípade, ak uvedené údaje nie sú pravdivé.

V Nitre 21. apríla 2010

.........................

Podpis

Poďakovanie:

Ďakujem prof. RNDr. Zdenke Gálovej, CSc a Ing. Jane Moravčíkovej, PhD. za odborné vedenie práce, za pomoc pri práci a za čas, ktorý mi venovali.

Abstrakt

Genetické inžinierstvo nám umožňuje vniesť gény do rastlín prostredníctvom mechanizmov, ktoré sú v mnohých pohľadoch odlišné od klasického šľachtenia. V posledných dvoch desaťročia sa dosiahol dramatický pokrok v manipulácii s génmi z rôznych zdrojov. Geneticky modifikované rastliny sa stali súčasťou nášho života. Táto práca prináša literárny prehľad o problematike transgenózy rastlín. Je rozdelená do troch hlavných častí. V prvej časti sú popísané metódy, ktoré sa v súčasnosti využívajú na prípravu geneticky modifikovaných rastlín, s podrobnejším zameraním na najviac využívanú metódu transformácie pomocou Agrobacterium tumefaciens. Práca prináša prehľad o typoch selekčných markerových a reportérových génov. Druhá časť práce je venovaná cielenej transgenóze rastlín so zameraním na genetické modifikácie, ktoré našli uplatnenie aj v praxi ako napr. odolnosť voči herbicídom, škodlivému hmyzu, vírusom alebo zlepšenie kvalitatívnych znakov. Tretia časť prináša v stručnosti prehľad platnej legislatívy týkajúcej sa GMO v EU a na Slovensku.

Klúčové slová: Agrobacterium tumefaciens, genetické transformácie, GM rastliny

Abstract

Genetic engineering gives the possibility to introduce genes into plants through mechanisms that are often different in many aspects from classical breeding. In the last two decades dramatic progress in the handling of the genes from different sources has been achieved. Genetically modified plants became a part of our life. This work brings literature overview about the problematic of plant transgenosis. It is divided into three main parts. In the first part, the present methods used for genetic modification of plants are described. Agrobacterium mediated transformation as the most frequently used method is written in more details. In addition, the work brings overview about the types of selectable marker and reporter genes. The second part of the work is devoted to the target transgenosis. It brings overview about genetic modifications that found practical use for an example herbicide tolerance, insect and virus resistance or improving of qualitative features. The third part briefly presents an overview of current legislation on GMOs in the EU and Slovakia.

Key words: Agrobacterium tumefaciens, genetic transformations, GM plants

Obsah

|Obsah.......................................................................................................................|6 |

|...... | |

|Zoznam ilustrácií.......................................................................................................... |8 |

|Zoznam tabuliek........................................................................................................... |9 |

|Zoznam skratiek........................................................................................................... |10 |

|Úvod........................................................................................................................|11 |

|....... | |

|1 |CIEĽ PRÁCE.................................................................................. |13 |

|2 |METODIKA PRÁCE..................................................................... |14 |

|3 |PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ |15 |

| |PROBLEMATIKY.......................................................................... | |

| 3.1 |Metódy transformácie rastlín......................................................... |15 |

| 3.1.1 |Transformácia protoplastov............................................................... |15 |

| 3.1.2 |Biolistická transformácia................................................................... |16 |

| 3.1.3 |Transformácia pomocou karbidu kremíka (SCMT).......................... |17 |

| 3.1.4 |Transformácia pomocou Agrobacterium.......................................... |18 |

| 3.1.4.1 |Agrobacterium tumefaciens - pôdny patogén.................................... |18 |

| 3.1.4.2 |Agrobacterium tumefaciens a moderné biotechnológie.................... |24 |

| 3.1.4.3 |Rastlinné transformačné vektory....................................................... |25 |

| 3.1.4.3.1 |Selekčné markérové gény.................................................................. |25 |

| 3.1.4.3.2 |Reportérové gény.............................................................................. |26 |

| 3.1.4.3.3 |Expresia transgénov v rastlinách....................................................... |27 |

| 3.1.5 |SAAT transformácia......................................................................... |28 |

| 3.2 |Cielená transgenóza rastlín........................................................... |28 |

| 3.2.1 |GM rastliny rezistentné voči herbicídom.......................................... |28 |

| 3.2.2 |GM rastliny odolné voči škodlivému hmyzu.................................... |30 |

| 3.2.3 |GM rastliny odolné voči vírusom...................................................... |33 |

| 3.2.4 |Zlepšenie kvalitatívnych vlastností................................................... |34 |

| 3.2.5 |GM rastliny ako továrne na proteínov............................................... |36 |

| 3.2.6 |GM rastliny a Slovensko.................................................................. |37 |

| 3.3 |Legislatíva EÚ týkajúca sa GMO.................................................. |38 |

| 3.3.1 |Legislatíva Slovenskej republiky týkajúca sa GMO......................... |39 |

|ZÁVER A NÁVRH NA VYUŽITIE POZNATKOV................................................ |41 |

|ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY..................................................................... |42 |

|PRÍLOHY.....................................................................................................................|48 |

Zoznam ilustrácií

|Obr. 1 |Zariadenie používané pri biolistickej transformácii |17 |

|Obr. 2 |Agrobacterium tumefaciens – pôdny patogén |20 |

|Obr. 3 |Symptómy ochorenia u rastlín spôsobené Agrobacterium tumefaciens |20 |

|Obr. 4 |Zloženie Ti plazmidu a T-DNA |21 |

Zoznam tabuliek

|Tab. 1 |Klasifikácia toxínových génov podľa sekvenčnej homológie a špecifického účinku na hmyz. | |

| | |31 |

|Tab. 2 |Zoznam geneticky modifikovaných organizmov, ktorých používanie v Slovenskej republike bolo povolené | |

| |podľa paragrafu 17 ods. 1 zákona č. 151/2002 Z.z. v znení neskorších predpisov - poľné pokusy | |

| | |37 |

Zoznam skratiek

|GFP |Zelený fluorescenčný proteín |

|µm |mikrometer |

|GMO |Geneticky modifikovaný organizmus |

|RB, LB |Pravá, ľavá hraničná sekvencia T-DNA |

|rDNA |Rekombinantná DNA |

|Ri plazmid |Plazmid indukujúci tvorbu koreňov |

|SAAT |Metóda transformácie pomocou A. tumefaciens a ultrazvuku |

|SCMT |Metóda transformácie pomocou karbidu kremíka |

|T-DNA |Prenášaná DNA |

|Ti plazmid | Plazmid indukujúci nádor |

|X-Gluc |5-bromo-chloro-3-indolyl glukuronid |

Úvod

Klasické biotechnológie, teda využívanie živých organizmov na produkciu potravín, prípadne iných užitočných látok pre človeka, sprevádzajú ľudskú spoločnosť už od jej vzniku. Od kvasených potravín (chlieb, víno, pivo, kyslé mlieko), cez šľachtené druhy hospodárskych rastlín a zvierat (prakticky všetky kultúrne plodiny a úžitkové zvieratá) až po využitie antimikrobiálnych účinkov niektorých metabolitov plesní (antibiotiká), išlo vždy o využitie procesov, ktoré ponúka príroda a človek sa ich naučil využívať vo svoj prospech, prípadne ich v obmedzenej miere zefektívnil.

Odhalenie mechanizmu genetiky rastlín v priebehu 20. storočia otvorilo nové možnosti pre modifikáciu rastlín. V tomto období sa začali využívať nové nástroje na zlepšenie kvality rastlín. Mutagenéza či už chemická alebo radiačná, ktorá sa začala aplikovať koncom 40-tich rokov. Ako jeden príklad z mnohých môže byť takto vyšľachtená odroda sladovníckeho jačmeňa Diamant, z ktorého sa dnes varí pivo a Írovia whisky. V roku 1965 boli náhodne ožiarené klasy sladovníckeho jačmeňa odrody Valtický röntgenom, ktorých semená sa neskôr vysiali a krížili čím, sa získala nová odroda Diamant. Napriek tomu, že v týchto rokoch neboli ešte dostatočné informácie o povahe mutácií, mutácie sa stali súčasťou šľachtiteľského procesu a doteraz bolo na trh uvedených viac ako 2 250 rastlín kukurice, pšenice, ryže a iných.

Objav štruktúry DNA Watsonom a Crickom v 50-tich rokoch 20. storočia sa stal základom pri hľadaní nových sofistikovanejších metód. O dvadsať rokov Cohen a Boyer (1973) ukázali možnosť práce s DNA mimo buniek (in vitro). Objavom bakteriálnych enzýmov, ktoré dokázali štiepiť DNA na fragmenty (restrikčné endonukleázy) alebo spájať poštiepené fragmenty DNA (DNA ligázy), získali génoví inžinieri nástroje pre tvorbu rekombinantnej DNA (rDNA). Základom génového inžinierstva sa stali techniky rDNA, ktoré umožnili prenos genetickej informácie z jedného organizmu do druhého. Nie dlho po objavení techniky rDNA, boli takouto technológiou pripravené baktérie, ktoré niesli gén pre ľudský inzulín. Takto pripravený inzulín ako prvé „rekombinantné“ liečivo bol v roku 1980 uvedený na trh pod názvom Humulín.

Následne techniky rDNA boli aplikované aj pri rastlinách a stali sa základom pre rozvoj moderných rastlinných biotechnológií. V 80 tých rokoch minulého storočia sa zistilo, že pôdny patogén Agrobacterium tumefaciens, vlastní mechanizmus, pomocou ktorého dokáže prenášať vlastné gény do genómu rastlín. Modifikáciou tohto mechanizmu v laboratórnych podmienkach sa otvorili možnosti na prenos cielených, technikami rekombinantnej DNA pripravených génov do rastlín. Následne boli vyvinuté aj ďalšie metódy prenosu ako napr. biolistická metóda. Bioinžinierstvo rastlín umožnilo prekonať limity klasického šľachtenia a cielene vniesť do genómu rastlín jeden alebo dva gény nielen z príbuzných, ale aj vzdialených druhov rastlín, baktérií alebo húb.

Rastlinné biotechnológie ponúkajú významné zlepšenie v takmer každej oblasti rastlinnej výroby a využitie, s možnými výhodami pre poľnohospodárov, potravinársky priemysel, spotrebiteľov a životné prostredie. Pri pestovaní GM rastlín rezistentným voči herbicídom, umožňujeme rásť rastlinám len takého druhu, ktoré sú súčasťou monokultúry. Znižuje sa počet zásahov potrebných na odburinenie, tým sa znižuje použitá pracovná sila, následkom čoho sa znižujú aj náklady. Pri pestovaní Bt-plodín sa odstráni nutnosť postrekov herbicídmi. To sa v konečnom dôsledku premietne do celkových nákladov, ale nesmieme zabudnúť aj na ekologickú záťaž, ktorá je spojená s používaním herbicídov. Dôležité sú aj geneticky modifikové plodiny, ktoré boli upravené na zvýšenie ich nutričnej kvality, čo umožnilo zlepšiť výživu ľudí v oblastiach, kde jedna plodina predstavuje hlavný zdroj potravy a ľudia tu trpia chorobami spôsobenými konzumáciou takto výživovo chudobnej stravy.

1 CIEĽ PRÁCE

Cieľom predloženej záverečnej práce bakalárskeho štúdia bolo na základe dostupnej vedeckej literatúry spracovať literárny prehľad z oblasti genetických transformácií rastlín venovaný predovšetkým charakteristike metód, ktoré sa využívajú pri tvorbe transgénnych rastlín so zameraním na transformáciu rastlín pomocou Agrobakterium tumefaciens. V ďalšej časti práce uviesť príklady cielenej transgenózy doteraz modifikovaných plodín.

2 METODIKA PRÁCE

Pri vypracovaní tejto bakalárskej práce bol zvolený nasledovný metodický postup:

• zhromažďovanie vedeckej literatúry, pri ktorej sa vychádzalo z domácich a zahraničných literárnych zdrojov, z vedeckých časopisov a internetových zdrojov,

• štúdium vedeckej literatúry a oboznámenie sa s problematikou, čím sa získal prehľad o súčasnom stave riešenej problematiky z oblasti transformácie rastlín,

• spracovanie získaných poznatkov a informácií do písomnej formy a záverečné vypracovanie kompilačnej práce do súčasnej podoby.

3 PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ PROBLEMATIKY

1. Metódy transformácie rastlín

Prenos génov do rastlinných buniek môžeme dosiahnuť rôznymi metódami, ktoré rozdeľujeme na priame alebo nepriame (Gálová, a i., 2008) . Priame metódy sú založené na chemických alebo fyzikálnych princípoch prenosu cudzej DNA do rastlinného genómu. K najčastejšie využívaným priamym metódam patrí transformácia protoplastov a biolistická transformácia. Nepriama metóda je založená na prirodzenej schopnosti niektorých druhov baktérií rodu Agrobacterium prenášať vlastné špecifické gény do rastlinnej bunky, ktoré po zabudovaní do rastlinnej DNA spôsobujú nádorovité ochorenia.

3.1.1 Transformácia protoplastov

V sérií štúdií zo začiatku 60-tych rokov Cocking opísal metódu na izoláciu rastlinných protoplastov inkubovaním surovej zmesi častí koreňov a iných tkanív s enzýmami hydrolyzovanými bunkovými stenami. Dve kľúčové vylepšenia v roku 1970 a 1971 poukázali na potenciálne využitie protoplastov na zlepšenie rastlín:

1. Indukovaná fúzia protoplastov z rôznych druhov, ako prostriedok produkovať somatické hybridné bunky a nové hybridné rastliny bez ohľadu na ich taxonomické vzťahy.

2. Regenerácie rastlín z kultúry protoplastov

(Gillian Turgeon, a i., 2009)

Bunková stena predstavuje prirodzenú bariéru pri prenášaní cudzích génov do bunky. Jednou z možností ako prekonať tento problém je použiť na transformáciu bunky, ktoré majú kompletne alebo čiastočne odstránenú bunkovú stenu (protoplasty). Podstatou metódy je inkubácia protoplastov v tlmivom roztoku s exogénnou DNA. Prijatie DNA môže prebiehať iba endocytózou. Existuje niekoľko spôsobov ako endocytózu dosiahnuť:

1. Chemicky dodaním pomocou polyetylénglykolu alebo iónov vápnika

2. Elektroporáciou pomocou pulzov elektrického náboja

(Ondřej a Drobník, 2002).

Ďalšou možnosťou je mikroinjekcia. Transformácia pomocou mikroinjekcie je založená na zavedení DNA do jadra alebo cytoplazmy pomocou sklenej kapiláry (mikro-injekcie pipety). Táto operácia vyžaduje prístroj takzvaný mikromanipulátor. Počas zavádzania DNA do jadra sú bunky imobilizované pomocou špeciálnej pipety. Mikroinjekcia sa používa predovšetkým na transformáciu veľkých živočíšnych buniek. Význam pre rastlinné transformácie je obmedzený so zreteľom na vlastnosti stien rastlinných buniek, ktoré obsahujú silné vrstvy lignínu a celulózy. Bunková stena rastlín je prekážkou pre sklenené mikronástroje (Rao a i., 2009).

3.1.2 Biolistická transformácia

Biolistická transformácia je univerzálna metóda na transformáciu rastlín, húb alebo živočíšnych organizmov. Bola vynájdená v roku 1999. Zahŕňa vysokú frekvenciu bombardovania, mikroprojektilmi potiahnutými povlakom DNA, intaktných buniek alebo pletiva. Názov biolistická je odvodený od „biological ballistic“.

Pri nastreľovaní (Obr. 1) sa malé kovové častice usmerňujú k rýchlemu pohybu smerom k vybranému objektu. Kovové častice pri svojom pohybe so sebou strhávajú pripravené plazmidy, ktoré nesú gény určené na transgenózu. Pri dopade na objekt kovové častice prenikajú cez bunku alebo sú v nej náhodne zachytené, čím v bunke ostáva plazmid s naklonovaným génom. Pri biolistickej metóde sa používajú zlaté alebo volfrámové mikroprojektily veľké 2 µm. Projektily sa zmiešajú z roztokom plazmidovej DNA. Voda ako rozpúšťadlo sa z roztoku vyparí pri laboratórnej teplote, pričom plazmidová DNA sa prichytí na projektiloch. Do pletív sa mikroprojektily nastrelujú pomocou génovej pušky, ktorá dáva impulzy pre výstrel napríklad rýchlym vyrovnaním pretlaku hélia. Objekt musí byť umiestnený vo vákuu. Tungstenové guličky vážia asi 50 µg. Vzdialenosť, ktorú musia preletieť je asi 10 cm a ich rozptyl činí cca. 2 cm. Pri klasickej metóde sa bombarduje pletivo a to sa potom umiestni na regeneračné médium. Nie všetky mikroprojektily sa dostanú do pletiva. Bolo zistené, že len 7-10 % projektilov prenikne aspoň do epidermy. Je však treba, aby prenikli do mezofilu, pretože bunky epidermy nie sú schopné vytvoriť kalus a potom diferencovať rastlinu. Pokiaľ sú bunky zasiahnuté, vo väčšine prípadoch (95%) sa mikroprojektil dostane len do cytoplazmy. V zostávajúcich 5% buniek zasiahnutých do jadra, väčšina buniek (98-99%) do 48 hodín odumiera (Ondřej a Drobník, 2002; Bežo, 2009; Khan a Liu, 2009).

Obr. 1 Zariadenie používané pri biolistickej transformácii (science.smith.edu/cmbs/Equipment%20photos/Large/biolistic.jpg)

3.1.3 Transformácia pomocou karbidu kremíka

Transformácia pomocou karbidu kremíka SiC (SCMT) je jedna z najmenej komplikovaných metód používaných pri transformácií rastlín. Vlákna karbidu kremíka sa jednoducho pridajú do suspenzie obsahujúcej rastlinné tkanivá a plazmid. Takto pripravená suspenzia sa dá do vortexu, alebo inej laboratórnej techniky ako trepačky, miešačky. DNA-potiahnuté vlákna preniknú cez bunkovú stenu za pomoci malých otvorov, vytvorených po zrážkach medzi rastlinnými bunkami a vláknami karbidu (Wang a i., 1995).

V tomto postupe sa najčastejšie používajú jednotlivé kryštály kremíka organických minerálov ako karbid kremíka, ktoré majú podlhovastý tvar s dĺžkou 10-80 mm, priemerom 0,6 mm a ktoré vykazujú vysokú odolnosťou proti rozštiepeniu. Veľkosť vlákien, parametre vortexovania, dodržanie postupov, rastlinný materiál, charakter rastlinných buniek a to najmä hrúbka bunkovej steny sú faktory, v závislosti od ktorých závisí efektívnosť SCMT. Hlavnou výhodou tejto metódy sú jednoduchosť a rýchlosť, nízke náklady a možnosť použitia na rôzne rastlinné materiály. Nevýhodou metódy sú nízka účinnosť transformácie buniek a nutnosť mimoriadne prísnych preventívnych opatrení pri laboratórnych prácach (Rao a i., 2009).

3.1.4 Transformácia pomocou Agrobacterium

Pri nepriamej metóde transformácie rastlín sa využívajú dva bakteriálne kmene a to Agrobacterium tumefaciens a Agrobacterium rhizogenes, ktorých mechanizmus infekcie je podobný a odlišuje sa len tým, že A. rhizogenes napáda korene. V súčasnosti sa najviac využíva transformácia pomocou A. tumefaciens, ktorá je v ďalších častiach podrobnejšie rozpísaná.

3.1.4.1 Agrobacterium tumefaciens - pôdny patogén

Agrobacterium tumefaciens je gram-negatívna pôdna baktéria (Obr. 2), ktorá patrí do čeľade Rhizobacteriaceae. Všetci členovia tejto čeľade sú pôdne baktérie, ktoré rozdeľujeme do dvoch rodov. Prvý rod je Rhizobium, sem patria zástupcovia Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium a Bradyrhizobium. Všetci sú symbiotický fixátory vzdušného dusíka s bôbovitými rastlinami. Druhý rod je Agrobacterium, kde patria zástupcovia Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium radiobacter a Agrobacterium rubi (Binns a Costantino, 1998).

Tieto baktérie, rastú aeróbne a nevytvárajú endospóry. Bunky sú pretiahnuté v tvare prútika, sú pohyblivé vďaka šiestim peritrichne umiestneným bičíkom. Bunky sú 0.6-1.0 µm široké a 1.5-3.0 µm dlhé, môžu existovať samostatne alebo vo dvojiciach. Na médiu obsahujúcom uhlohydráty bunky produkujú veľké množstvo extracelulárnych polysacharidov, čo dáva kolónií objemný a slizký vzhľad ().

Agrobacterium tumefaciens ako pôdny patogén bol intenzívne študovaný už od roku 1907. Baktéria infikuje poranené časti prednostne dvojklíčnolistých rastlín, pričom spôsobuje ochorenie známe ako tumory „crown galls“. Toto ochorenie je charakteristické tvorbou nádorov na pletivách poranených rastlín, čo je veľký problém pri kultivácií vinnej révy, kôstkovinách a stromoch produkujúcich orechy (Smith and Townsend, 1907) . Patogenitu tejto pôdnej baktérie zabezpečuje kruhová dvojvláknová molekula DNA tzv. „Tumor inducing“ Ti plazmid. Počas infekcie sa baktérie prichytia na poranenom mieste, kde dochádza k prenosu časti DNA z baktérie do bunky rastliny. Samotné A. tumefaciens do bunky nevstupuje. Do rastliny sa dostáva len časť DNA, ktorú nazývame T-DNA („Transfer DNA“), ktorá sa nachádza sa v  Ti plazmide. Táto časť plazmidu je zodpovedná za tvorbu nádorov.

Nádory sa spočiatku prejavujú ako malé opuchy v oblasti koreňa v blízkosti povrchu pôdy alebo na nadzemných častiach rastliny (Obr. 3). Mladé nádory často pripomínajú mozoľovité tkanivo, ktoré pochádza zo zranenia, sú mäkké mierne zaguľatené a majú bielu až smotanovú farbu. Čím sú nádory staršie ich tvar sa stáva veľmi nepravidelný a menia farbu na hnedú alebo čiernu. Nádor môže byť pripojený len kúskom tkaniva alebo sa javí ako opuch stonky, nie je zreteľne oddelený. Ďalšie symptómy zahŕňajú zakrpatenie a rastliny môžu byť náchylnejšie k nepriaznivým podmienkam životného prostredia a k sekundárnym infekciám ().

Patogénne kmene A. tumefaciens môžu žiť saprofyticky  v pôde viac ako dva roky. Keď sa objaví v blízkosti poranená hostiteľská bunka, baktérie sú na základe chemotaxie priťahované k tejto poranenej časti bunky. Baktérie potom stimulujú bunky rastliny, aby sa rýchlo a nekontrolovateľne množili a to tak, že vložia časť svojej DNA do rastlinného chromozómu. To má za následok nadprodukciu cytokinínov a auxínov čo sú rastlinné rastové regulátory, a opínov predstavujúcich živiny pre baktérie ().

Obr. 2 Agrobacterium tumefaciens – pôdny patogén (cals.ncsu.edu/course/pp728/Agrobacterium/cell.JPG)

Obr. 3 Symptómy ochorenia u rastlín spôsobené Agrobacterium tumefaciens (general82/agrobacterium.jpg)

Ti plazmid

Ti plazmid je definovaný ako mimojadrová DNA, ktorá je schopná samostatnej replikácie, bez ohľadu na delenie jadra. Plazmid tvorí dvojreťazcová, kruhová molekula DNA veľkosti viac ako 200 kb. Plazmid tvorí 3 – 8 % genetickej informácie baktérie a má rozhodujúci význam pri tvorbe nádorov rastlín (Bežo a i., 2009).

Na Ti plazmide (Obr. 4) rozpoznávame špecifické úseky DNA, ktoré majú v procese tumorizácie rôzne funkcie. Nachádza sa tu T-DNA, ktorá nesie gény pre syntézu opínov a fytohormónov. Tieto gény sú v bakteriálnej bunke transkripčne neaktívne. Majú charakter rastlinných génov, a preto sa prepisujú až po integrácii do DNA rastlinnej bunky (Ziemienowicz, 2001). Na obidvoch stranách je oddelená takzvanými 25 bp hraničnými sekvenciami označovanými LB a RB (ľavá a pravá)  hranica. Bázové páry, ktoré sa tu nachádzajú, majú rovnakú orientáciu na obidvoch stranách (Ondřej a Drobník , 2002).

Ďalej sa tu nachádza vir región, ktorý je zodpovedný za virulenciu baktérie, gény pre katabolizmus opínov,  taktiež úsek ori a gény pre konjugáciu. Podľa toho aký typ opínov sa po napadnutí rastliny syntetizuje, rozdeľujeme Ti plazmidy na nopalínový a oktopínový typ ( ).

[pic]

Obr. 4 Zloženie Ti plazmidu a T-DNA (bioweb.genezis.eu/molekularka/ti_plazmid.gif)

Celý proces tumorizácie môžeme rozdeliť do šiestich základných krokov:

1. Bakteriálna kolonizácia

2. Indukcia bakteriálneho virulentného systému

3. Tvorba T-DNA komplexu

4. Prenos T-DNA komplexu

5. Integrácia T-DNA do rastlinného genómu

6. Expresia integrovaných bakteriálnych génov v rastlinách

Bakteriálna kolonizácia

Bakteriálna kolonizácia je základný a prvý krok v procese tumorizácie. Začína sa prichytením A. tumefaciens na povrchu poranenej rastlinnej bunky (Matthysse, 1986). Dôležitú úlohu zohrávajú lipolysacharidy (LPS) a taktiež obalové polysacharidy, ktoré si baktérie vytvárajú na svojom povrchu. LPS sú neoddeliteľnou súčasťou vonkajšej membrány a kapsulárne polysacharidy bez lipidovej zložky majú silne aniónový charakter. Existujú dôkazy, že kapsulárne polysacharidy zohrávajú osobitú úlohu pri interakcií s hostiteľskou rastlinou (Bradley a i., 1997).

Bakteriálny chromozóm obsahuje gény, ktoré sú zodpovedné za správne prichytenie baktérie na rastlinnú bunku. Tieto gény sú priťahované fenolickými látkami, ktoré produkuje poranená rastlinná bunka. Medzi tieto látky patrí lignín a iné flavonoidné prekurzory. T-DNA prenos je sprostredkovaný produktami 30-40 kb dlhej vir oblasti umiestnenej na Ti plazmide. Vir oblasť sa skladá zo šiestich esenciálnych operónov (virA, virB, virC, virD, virE, virG) a dvoch neeseciálnych (virF, virH). Mnohé z vir operónov sú aktívne len v prítomnosti hostiteľa. Iba operóny virA a virG sú produkované konštitutívne na nízkej hladine a kódujú VirA-VirG dvojzložkový regulačný systém, ktorý riadi expresiu ostatných vir génov (Nixon, 1986).

VirA je transmembránový senzorický proteín, ktorý rozpoznáva signálne molekuly z poranených rastlín. VirG funguje ako transkripčný faktor vir génov, keď je fosforilovaný od VirA. C-terminalna oblasť je zodpovedná za DNA väzbovú aktivitu, pričom N-terminálna oblasť je oblasť fosforilacie a je tu určitá homológia s VirA (Turk a i., 1993). Na aktiváciu VirA je potrebné kyslé pH, fenolické látky a niektoré triedy monosacharidov, ktoré spolupôsobia s fenolickými látkami (Pan a i., 1993).

Tvorba, prenos a import T- komplexu do rastlinnej bunky

Tvorba T komplexu je tretí krok tumorizácie. DNA, ktorá je umiestnená medzi RB a  LB T-DNA hranicou sa vystrihne, prenesie do rastlinnej bunky a integruje do rastlinného genómu. Proteíny VirD1 a VirD2 hrajú kľúčovú v tomto kroku, rozpoznávajú 25 pb T-DNA hraničné RB a LB sekvencie a štiepia spodné vlákno. Po endonukleázovom štiepení zostáva VirD2 kovalentne pripojený na 5´ s čiarou konci jednovláknovej ss („single stranded“) T-DNA a dodáva mu polárny charakter. ssT-DNA-VirD2 komplex je potiahnutý 69 kDa VirE2 proteínom. Táto kooperácia slúži ako prevencia pred nukleázami a navyše znižuje veľkosť komplexu na asi 2 nm, čo uľahčuje prenos cez membránové kanáliky (Zupan a i., 1996).

Prenos nukleoproteínového komplexu do rastlinnej bunky má určitú homológiu s bakteriálnou konjugáciou. Je predpoklad, že medzi baktériou a rastlinou sa vytvorí kanál zložený z VirB proteínov, pričom VirD4 proteín napomáha interakcii medzi T-DNA komplexom a  VirB sekrečným aparátom. Tvorba VirB kanálu sa zdá byť evolučne podobná k bakteriálnej konjugácii. Väčšina VirB proteínov slúži ako kanál, ale niektoré z nich aj ako ATPázy, ktoré dodávajú energiu potrebnú na transport (Zupan a Zambryski, 1995).

Odhadovaná veľkosť T-komplexu je okolo 50 000 kDa, čo ďaleko prevyšuje veľkosť jadrového póru (60 kDa) (Sheng a Citovski, 1996). Z tohto vyplýva, že prenos T-komplexu vyžaduje aktívny transport a teda prítomnosť špecifického jadrového lokalizačného signálu NLS („Nuclear localisation signal“). Samotné T-DNA vlákno neobsahuje NLS. Predpokladá sa, že takýto signál sa nachádza u VirD2 a/alebo VirE2 proteínov, ktoré ho sprevádzajú a ochraňujú pred hostiteľskými (rastlinnými) nukleázami. VirE2 obsahuje dva NLS a VirD2 len jeden (Bravo Angel a i., 1998).

Napriek tomu, že VirE2 obsahuje dva NLS, funkcia tohto proteínu môže byť limitovaná len na ochranu T-vlákna (Rossi a i., 1996). Na druhej strane prítomnosť dvoch NLS v VirE2 navodzuje otázku, či NLS vo VirD2 nie je prebytočný a VirD2 zohráva unikátnu úlohu pri importe T-komplexu. Je však pravdepodobné, že VirD2 a VirE2 NLS signály sú potrebné na integráciu do jadra. (Guralnick a i., 1996).

Integrácia T-DNA do rastlinnej DNA

Posledným krokom je integrácia T-DNA do rastlinného genómu. Vo vnútri rastlinnej bunky je T-DNA komplex prenesený do jadra cez jadrovú membránu. Molekulárny mechanizmus integrácie nie celkom známy. Predpokladá sa, že významnú úlohu pri tom zohrávajú proteíny prenesené spolu s T-DNA vláknom z baktérie a/alebo proteíny kódované hostiteľskou rastlinou. Podľa modelu náhodnej rekombinácie musí existovať určitá mikro-homológia medzi sekvenciami T-DNA vlákna a rastlinnej DNA, aby došlo k prvému kontaktu T-DNA vlákna k rastlinnej DNA. Významnú úlohu zohráva VirD2 naviazaný na 5´ koniec T-DNA vlákna, ktorý riadi zostrih a integráciu T-DNA vlákna do rastlinnej DNA. Rastlinná DNA sa potom môže rozvinúť a vytvoriť medzeru a 3´koniec T-vlákna sa môže párovať s ďalšou oblasťou rastlinnej DNA (Zupan a Zamryski, 1995). Transkripčne aktívne oblasti sú favorizované pravdepodobne z dôvodu lepšej prístupnosti rastlinnej DNA v tejto oblasti.

Expresia integrovaných bakteriálnych génov v rastlinách

Gény, ktoré sa nachádzajú v T-DNA oblasti sú v bakteriálnej bunke transkripčne neaktívne. Majú charakter rastlinných génov, a preto sa prepisujú až po integrácii do DNA rastlinnej bunky (Ziemienowicz, 2001).

Po inkorporácií do rastlinného genómu, je divý typ T-DNA schopný indukovať tvorbu nádorov v transformovaných rastlinných bunkách. Na rozdiel od normálnych rastlinných buniek, tieto tumory sú schopné rásť in vitro v definovaných rastlinných regulátoroch. Je to spôsobené expresiou onc génov (gény onkogenity iaaM, iaaH a ipt) v rastlinných bunkách (Hooykaas and Schilperoort, 1992).

Gén iaaM (tms1) kóduje tryptofán monooxygenázu a gén iaaH (tms2) kóduje indolacetamid hydrolázu. Spolu sa podieľajú na syntéze rastlinného hormónu IAA a gén ipt (tmr) kóduje adenozín isopentenyl trasferázu (Thomashow a i., 1986).

Integrácia a expresia týchto génov vyúsťuje do nadprodukcie fytohormónov, čo spôsobuje nekontrolovateľný rast a transformáciu buniek. T-DNA obsahuje aj gény, ktoré kódujú enzýmy podieľajúce sa na syntéze špeciálnych metabolitov, takzvaných opínov. Opíny indukujú syntézu opin-katabolických enzýmov v agrobakériách, ale taktiež expresiu génov tra. Tieto gény podporujú prenos Ti plazmidu v bakteriálnej populácií (Dessaux a i., 1992).

3.1.4.2 Agrobacterium rhizogenes –pôdny patogén

Agrobacterium rhizogenes napáda korene, kde spôsobuje tvorbu vlásočnicových koreňov tzv. „hairy roots“. Tieto nádory sú charakteristické počiatočnými formáciami, takzvané kalusy a následnou rozsiahlou proliferáciou koreňového systému. Baktérie na rozdiel od A. tumefaciens obsahujú plazmid nazývaný Ri („Root inducing“). T-DNA Ri plazmidu obsahuje rol gény, ktoré sa podieľajú na tvorbe a vývine koreňov, gény pre biosyntézu opínov a gény neznámej funkcie (Chilton a i., 1982).

T-DNA oblasť môže existovať ako jedna súvislá oblasť (kukumopínový a manopínový typ) alebo môže byť rozdelená na dve oblasti TL a TR (agropínový typ) (Veena a Taylor, 2007). Na TR oblasti sa nachádzajú gény zúčastňujúce sa syntézy auxínov a gény neznámej funkcie. Gény pre syntézu auxínov vykazujú homológiu s génmi nachádzajúcimi sa na Ti plazmide (Huffman a i., 1984). Oblasť TL zohráva dôležitú úlohu pri indukcii ochorenia. Nenachádza sa na nej žiadna významná sekvenčná homológia s Ti plazmidom. Počas infekcie sú obe TL a TR oblasti prenesené do rastlinnej bunky, kde sa zúčastňujú procesu tumorizácie buď samostatne alebo vo vzájomnej závislosti od druhu rastlín alebo tkanív (Slightom, a i., 1986).

3.1.4.3 Agrobacterium tumefaciens a moderné biotechnológie

Pri genetickej transformácii rastlín sa využíva prirodzená vlastnosť agrobaktéria prenášať gény umiestnené na Ti plazmide do rastlinnej bunky. Pokroky v genetickom inžinierstve umožnili upraviť (odzbrojiť) divý typ Ti plazmidu a to tak, že sa odstránili sekvencie reprezentujúce gény, ktoré sa zúčastňujú srocesu tumorizácie a ponechali sa len sekvencie génov, ktoré boli nevyhnutné na samotný proces transformácie: hraničné T-DNA sekvencie, vir oblasť, ori oblasť. Do samotnej T-DNA oblasti medzi LB a RB hranice sa potom cielene mohli klonovať gény, ktoré boli určené na transgenózu rastlín. Takto upravený Ti pazmid sa stal základom pre prípravu rastlinných transformačných vektorov.

3.1.4.3.1 Rastlinné transformačné vektory

Prvým typom sú ko-integrálne vektory, obdoba divého typu Ti plazmidu (Shaw a i., 1983). T-DNA oblasť však už obsahuje gény určené na cielenú trangenózu rastlín. V súčasnosti sa najviac využívajú tzv. binárne vektory. Tento systém sa skladá z 2 plazmidov, prvý obsahuje DNA sekvencie potrebné na replikáciu, prenos a integráciu (ori a vir oblasti), zatiaľ čo druhý obsahuje T-DNA oblasť s hraničnými LB a RB sekvenciami (Hellens a i., 2000). T-DNA oblasť obsahuje viacnásobné klonovacie miesto, ktoré umožňuje pomocou unikátnych restrikčných endonukleáz technikami rekombinantnej DNA vnášať do T-DNA oblasti požadované gény. Vzhľadom na to, že len malá časť buniek môže prijať cudziu DNA, T-DNA oblasť obsahuje okrem génu určeného na cieleného transgenózu aj selekčný markerový gén, ktorý dáva určitú selektívnu výhodu pre transformované bunky. Pripravené binárne vektory sa transformujú do príslušného odzbrojeného rôzne virulentného kmeňa Agrobacterium tumefaciens. Najčastejšie sa používa LBA4404 (Bevan a i., 1984), C58 (Haissari a i. 1998), AGLO (Lazo a i. 1991) a iné.

Jedným z najpoužívanejších binárnych vektorov je pBIN19 (Bevan a i., 1984). Tento vektor je pomerne malý (11.7 kp), obsahuje niekoľko klonovacích miest z  pUC19 a má výhodný modro-biely preverovací systém pre rekombinantov. Nevýhodou pBIN19 je pozícia selekčného markerového génu, ktorý je blízko pravej T-DNA hraničnej sekvencie. Vzhľadom na polárny charakter T-DNA prenosu (Zambryski, 1992), umiestnenie selekčného markerového génu blízko RB hranice zvyšuje pravdepodobnosť získania transgénnych rastlín, ktoré obsahujú len selekčný markérový gén a nie gén záujmu.

Van Engelen a i. 1995 vytvoril vektor pBINPLUS, ktorý je derivát pBIN19. Tento vektor obsahuje okrem RK2 replikónu aj ColE1 replikón izolovaný z pBR322 a tiež selekčný markerový gén v blízkosti ľavej T-DNA hraničnej sekvencie.

Komari a i., 1996 zostrojil tzv. super binárne vektory, ktoré nesú dva oddelené úseky T-DNA. V tomto systéme selekčný markérový gén a gén záujmu sú umiestnené na oddelené DNA molekuly, ktoré sú integrované do rastlinného genómu ako nespojené fragmenty. Tieto super binárne vektory zohrávajú dôležitú úlohu pri vývoji technológií pre transformáciu jednoklíčnolistových rastlín.

3.1.4.3.2 Reportérové gény

Reportérovými génmi nazývame také gény, ktoré sú ľahko detekovateľné v pletivách transformovaných rastlín či už kvalitatívne alebo kvantitatívne. Pomocou nich môžeme monitorovať nielen úspešnosť transformácie, ale v prípade ak ich priradíme k rastlinným promótorom, môžeme sledovať procesy prebiehajúce v rastlinách, kedy a v akom vývinovom štádiu je daný promótor aktívny .

Jedným z prvých reportérových génov bol gén kódujúci chloramfenikolacetyltransferázu. Tento bakteriálny enzým nespôsobuje rezistenciu rastlín na chloamfenikol, pretože rastliny majú už majú dosť vysoký stupeň spontánnej rezistencie. Enzým spôsobuje acetyláciu chloramfenikolu na dvoch miestach molekuly. Po dodaní chloramfenikolu označeného rádioaktívnym izotopom C k proteínovým extraktom transgénnych rastlín sa táto značená zlúčenina premieňa na acetylované produkty. Tie možno od neacetylovaného chloramfenikolu oddeliť chromatografiou na tenkej vrstve. Výsledky možno vyhodnotiť kvantitatívne (Ondřej a Drobník, 2002).

V súčasnosti najpoužívanejším reportérovým génom je gén kódujúci β-glukuronidázu (uidA), ktorý bol izolovaný z E. coli (Jefferson a Wilson, 1991). Enzým je stabilný v širokom rozsahu pH (5,0-7,5) a je relatívne odolný voči vyšším teplotám. β-glukuronidáza je kyslá hydroláza, ktorá štiepi β-glukuronidy. V pletivách rastlín je ľahko detekovaľná kvalitatívne (histochemicky s X-Gluc ako substrátom), čo sa prejaví modrím sfarbením alebo kvantitatívne (spektrofotometricky alebo fluorimetricky).

Ďaľším reportérovým génom je gén kódujúci luciferázu izolovaný zo svetlušky (Photinus pyralis). Enzým luciferín-4-monooxigenáza katalyzuje oxidáciu luciferínu a jeho produkty po štiepení emitujú žlto-zelené fluoreskujúce svetlo (Ow a i., 1986)

Gén pre zeleno fluoreskujúci proteín (GFP) bol izolovaný z medúzy Aequoea Victoria (Haseloff a Amos, 1995). Tam sa vyskytuje spoločne s proteínom aequorinom, ktorý v prítomnosti iónov vápnika vydáva modré svetlo. GFP premieňa modré svetlo na zelené. Je to jediný známy proteín, ktorý fluoreskuje bez dodávania substrátov alebo kofaktorov. Je stabilný v širokom rozmedzí hodnôt pH, pri pôsobení denaturačných látok a je termostabilný do 65oC.

3.1.4.3.3 Expresia transgénov v rastlinách

Ku génom, ktoré sa vnášajú do rastlinného genómu sa priraďujú rastlinné regulačné sekvencie, ktoré zabezpečujú expresiu v rastlinnej bunke. Expresná jednotka musí obsahovať: promótor, vnášaný gén a terminátor, ktorý ukončí prepis sekvencie génu. Ako promótory sa pri transgenóze najviac využívajú tzv. konštitutívne, pri ktorých transkripcia beží stále. Najznámejším takým promótorom je CaMV 35S, ktorý pochádza z vírusu karfiolovej mozaiky (Odell a i., 1985).

Ďalšími sú pletivovo-špecifické promótory, ktoré sú aktívne len v určitom špecifickom čase (napr. počas vývinu semena). V niektorých prípadoch sa používajú aj indukovateľné promótory, ktoré sú aktívne za určitých podmienok akými sú napr. teplo, svetlo, sucho alebo sa aktivujú napr. pri poranení rastliny. Terminátory slúžia ako transkripčný stop signál pre RNA polymerázu. Terminátory obsahujú tzv. polyadenylačný signál. Na prípravu expresných jednotiek sa najčastejšie využíva terminátor vírusu karfiolovej mozaiky alebo terminátor nopalín syntetázového génu.

3.1.5 SAAT transformácia

„Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation“ (SAAT) je metóda založená na transformácií rastlinného pletiva pomocou A. tumefaciens, ktoré bolo predtým ošetrené ultrazvukom.

Metóda je založená na kavitácií ultrazvukom, čo má za následok tisíce malých rán na a pod povrchom rastlinných tkanív a umožňuje Agrobacterium prenikať hlbšie do tkanív. Toto zranenie niekoľko násobne zvyšuje pravdepodobnosť infikovania rastlinných buniek ležiacich hlbšie v tkanive (Hussain a i., 2007).

3.2 Cielená transformácia rastlín

Geneticky modifikované rastliny ako výsledok pokroku v biotechnologických metódach sa od roku 1983 stali realitou a neskôr aj uvedené do životného prostredia. Napriek tomu, že GM rastliny boli a sú prijímané širokou verejnosťou rozporuplne, tieto rastliny sa stali súčasťou poľnohospodárskej praxe. Pomocou génového inžinierstva je možné zlepšiť niektoré agronomické vlastnosti (rezistencia voči herbicídom, škodlivému hmyzu, alebo vírusom) alebo kvalitatívne vlastnosti (zlepšenie nutričnej kvality plodín, predĺženie dozrievania a konzumnej zrelosti plodín, modifikácia obsahu a zloženia rastlinných olejov, škrobu atď.).

3.2.1 Geneticky modifikované rastliny rezistentné voči herbicídom

Používanie GMR rezistentných voči herbicídom znižuje náklady pri produkcii, znižuje množstvá chemických prípravkou potrebných pri boji proti burine, je šetrnejšie k životnému prostrediu, k pracovníkom a neposlednej rade aj ku konzumentovi.

Rezistencia voči glyfosátu

Herbicíd glyfosát je neselektívny herbicíd. V rastline sa rýchlo prenáša z listov do meristematických zón a do plodov, kvetov a koreňov. Chemicky je to terciálny amín, N-(fosfonometyl)glycin, ktorý blokuje syntézu aromatických aminokyselín tým, že inhibuje 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntázu (EPSPS), enzým, ktorý zohráva dôležitú úlohu v syntéze aromatických aminokyselín. Obchodne je distribuovaný pod názvom Roundup firmou Monsanto. EPS sprostredkúva väzbu medzi fosfoenolpyruvátom (PEP) a šikiminát-3-fosfátom za vzniku 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátu (EPSP). Glyfosát zabraňuje väzbe PEP na aktívne miesto enzýmu EPSPS, výsledkom čoho je zablokovanie tvorby EPSP a následne aromatických aminokyselín. Rastlina odumrie, pretože nedokáže syntetizovať aromatické aminokyselín. Glyfosát je vysokoúčinný herbicíd, je ľahko odbúrateľný v pôde (dobre metabolizovaný mikroorganizmami) a je neškodný pre živočíchy. Živočíchy na rozdiel od rastlín získavajú aromatické aminokyseliny z potravy (Ondřej a Drobník, 2002). V súčasnosti existuje niekoľko stratégií ako zvýšiť rezistenciu voči glyfosátu:

a) Zvýšiť expresiu génu pre EPSPS.

Takto boli využité rastlinné gény pre EPSPS izolované z petúnie alebo arábkovky. Cieľom je, aby bolo v bunke toľko molekúl EPSP, že aj keď bude v bunke všetok glyfozát viazaný na EPSP, zostane v bunke voľný EPSP, ktorý bude vykazovať dostatočnú katalytickú aktivitu (Horsch a i.,1988) ( Shah a i., 1986).

b) Využiť gén pre EPSPS so zníženou citlivosťou ku glyfosfátu.

Zmenou jednej aminokyseliny dochádza k necitlivosti ku glyfosátu. Zdrojom boli gény izolované z Salmonella typhimurium, Escherichia coli alebo Agrobacterium tumefaciens. Bakteriálny gén bol označený ako aroA, pretože riadi syntézu aromatických aminokyselín (Comai a i.,1985).

c) Využiť gén kódujúci enzým, ktorý daný herbicíd metabolizuje.

Gény pre degradáciu glyfosátu sú prítomné v mnohých mikroorganizmoch. K odbúravaniu glyfosátu dochádza dvomi odlišnými cestami. Jedna z nich vedie cez aminometylfosfonát a druhá cez sarkozín. V obidvoch sa glyfosát rozkladá na netoxické zlúčeniny. Zatiaľ bol izolovaný gén pre glyfozátooxidoreduktázu (GOX) z baktérie Achromobacter. Daný gén kóduje glyfosátoxidoreduktázu, podieľajúcu sa na aminometylfoxfonálovej biodegradačnej dráhe (Ondřej a Drobník, 2002).

V roku 1995 bola do životného prostredia uvoľnená prvá glyfosát tolerantná sója. V súčasnosti GM Crop databáza eviduje 87 záznamov o genetickej modifikácii rastlín (repka, sója kukurica, bavlník, jačmeň, atď.) s rezistenciou voči herbicídom.

3.2.2 GM rastliny odolné voči škodlivému hmyzu

Odolnosť rastliny v najširšom slova zmysle je definovaná ako "dôsledok dedičných vlastností rastlín, ktoré vedú k tomu, že rastliny obsahujú danú vlastnosť, sú relatívne menej poškodzované ako rastliny bez vlastnosti." Z poľnohospodárskeho hľadiska, hmyzu odolné kultivary plodín prinášajú viac úrody než náchylné odrody, aj keď sa stretávajú s inváziami hmyzích škodcov ().

Škodlivý hmyz môže spôsobiť škody na rastlinách v období klíčenia, vegetatívneho rastu a počas tvorby plodov a semien. V súčasnosti sa najčastejšie ako ochrana používa chemický postrek insekticídmi, čo má svoje výhody a nevýhody. Opakovaným postrekom sa môže získať rezistencia hmyzu na insekticíd, dochádza k usmrteniu aj necieleného hmyzu a navyše postrek sa nemusí dostať k poškodenej časti rastliny.

V súčasnosti sa na prípravu GM rastlín odolných voči škodlivému hmyzu používajú stratégie:

a) Vnesenie génov, ktorých expresia zabezpečí inhibíciu enzýmov tráviaceho traktu hmyzu

b) Vnesenie bakteriálnych génov kódujúcich insekticídne proteíny

Vnesenie génov, ktorých expresia zabezpečí inhibíciu enzýmov tráviaceho traktu hmyzu

Ako obrannú stratégiu obranu voči škodlivému hmyzu rastliny využívajú tzv. antimetabolické proteíny, ktoré narušujú proces trávenia hmyzu. Takéto proteíny môžu byť syntetizované konštitutívne, zvlášť v pletivách, ktoré sú často napádané hmyzom. Ich syntéza môže byť tiež indukovaná mechanickým poškodením, ku ktorému dochádza pri požieraní hmyzom. Enzýmová výbava tráviaceho ústrojenstva lariev musí obsahovať proteázy a alfa amylázy, ktoré dokážu štiepiť proteíny a škrob. Obrana rastliny spočíva v tvorbe tzv. proteázových a alfa amylázových inhibítorov. Rastlinné inhibitory proteáz sú malé proteíny, ktoré môžeme rozdeliť do štyroch skupín: inhibitory serínových proteáz, inhibitory cysteínových proteáz, inhibitory metaloproteáz a nhibitory aspartoproteáz. Inhibítor alfa amylázy bol izolovaný z fazule obyčajnej (Phaseolus vulgaris). Táto bielkovina blokuje zásobovanie larvy živinami. Larva produkuje črevný enzým alfa-amylázu štiepiacu škrob. Pridanie bielkoviny, ktorá inhibuje tvorbu alfa-amylázy v čreve larvy, dochádza k vyhladovaniu a úhynu lariev (Bežo a i., 2009).

K perspektívnym, odolnosť podporujúcim bielkovinám voči hmyzu patrí aj inhibítor trypsínu pankreasu hovädzieho dobytka (BPTI), α-antitrypsín (α1AT), inhibítor funkcie sleziny (SI, spleen inhibitor), ktoré boli prenesené aj do viacerých druhov rastlín. Proteázové inhibítory (anti-chymotrypsín, anti-elastáza) pochádzajú z lišaja tabakového (Manduca sexta) a sú aktívne v bavlníku (Gossypium sp.) a chitináza v tabaku (Nicotiana sp.), kde sú efektívne pri znižovaní výskytu molice tabakovej (Bemisia tabaci) (Bežo a i., 2009).

Ďalšiu možnosť predstavuje využitie lektínov. Sú to proteíny, ktoré viažu sacharidy. Je o nich známe, že sú toxické pre cicavce a vtáky. Väčšina z nich má antinutričný vplyv. Príkladom môže byť transgénny tabak obsahujúci  lektín izolovaný z hrachu, ktorý bol toxický pre motýľa Heliotus virescens alebo tabak obsahujúci lektín zo snežienky toxický pre motýľa Lacanobia oleracea. Avšak väčšina experimentov s lektínmi sa sústreďuje na získanie rastlín rezistentných voči voškám. Napr. prítomnosť lektínu zo snežienky v trangénnom tabaku viedla k čiastočnej ochrane proti voškám Myzus persicae a Aulacorthum solani. Súčasne sa však zistilo, že vošky, ktoré sa živia transgénnymi rastlinami, sú čiastočne toxické pre svojich predátorov ako lienky Adalia bipunctata (Birch a i., 1999).

Vnesenie bakteriálnych génov kódujúcich insekticídne proteíny

Zdrojom génov, ktoré môžu zabezpečiť rezistenciu rastlín voči hmyzu je Bacillus thuringiensis, pôdna baktéria, ktorá v nepriaznivých podmienkach tvorí spóry kryštalickej štruktúry s insekticídnymi vlastnosťami. Počas sporulácie sa syntetizujú endotoxínové proteíny kódované génmi, ktoré sa na základe ich kryštalického tvaru označujú ako Cry gény. Tieto proteíny sa nazývajú Bt toxíny a nachádzajú sa v neaktívnej forme (pro-toxíny). V tráviacom trakte hmyzu sa v alkalickom pH a za prítomnosti proteáz mení pro-toxín na aktívny toxín. Tieto sa viažu na špecifické receptory epitelu čreva a spôsobujú tvorbu pórov a následné uhynutie hmyzu (Bežo a i., 2009).

V boji proti škodcom sa Bt toxíny ako také používajú viac ako 30 rokov. Baktérie rastú vo fermentačných zariadeniach, kde produkujú spóry, ktorými sa poprašujú rastliny. Nevýhodou je, že účinkujú len krátkodobo, v závislosti od počasia. Bt proteín nie je toxický pre ľudí a je ľahko degradovateľný v tráviacom ústrojenstve stavovcov.

Prvé transgénne rastliny s Bt génom boli pripravené v roku 1987. Tieto rastliny obsahovali Cry1a gén, avšak expresia bola veľmi nízka. Z tohto dôvodu došlo k modifikácii bakteriálneho génu, aby sa zabezpečila jeho vysoká expresia v rastlinných bunkách. Bt toxíny sa líšia spektrom svojho pôsobenia. Väčšina Bt toxínov je aktívna voči larvám motýľov (Lepidoptera), iné sú špecifické pre dvojkrídlovce (Diptera) a chrobáky (Celeoptera) (Tabuľka 1). GM Crop databáza eviduje 56 genetických modifikácií rastlín (bavlník, zemiak, kukurica a rajčiak) za účelom zvýšenia rezistencie voči škodcom.

Mikroorganizmy môžu byť zdrojom aj ďalších génov. Napr. cholesterol oxidázový gén pochádzajúci zo Streptomyces, ktorý kóduje bielkovinu aktívnu voči húseniciam morovitých (Spodoptera litura) bol vnesený do rastlín tabaku alebo  izopentyl transferázový gén pochádzajúci z Agrobacterium tumefaciens, kódujúci bielkovinu aktívnu voči lišaju tabakovému (Manduca sexta) a voške broskyňovej (Myzus persicae) v rastlinách tabaku a paradajok (Bežo a i., 2009).

Tab. 1. Klasifikácia toxínových génov podľa sekvenčnej homológie a špecifického účinku na hmyz ().

|Názov Cry génu |Toxicita ku škodcom radu: |

|CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c) |Lepidoptera (motýle) |

|Cry1B, Cry1C, Cry1D |Lepidoptera |

|CryII |Lepidoptera, Diptera (dvojkrídlovce) |

|CryIII |Coleoptera (chrobáky) |

|CryIV |Diptera |

|CryV |Lepidoptera, Coleoptera |

3.2.3 GM rastliny odolné voči vírusom

Vírusy, ktoré napádajú rastliny majú jednoduchú štruktúru. Vírusová častica sa skladá z proteínového obalu a RNA alebo DNA genómu, podľa toho, či ide o  RNA alebo DNA vírus. Proteínový obal pozostáva z proteínov CP („coat proteins“). V prípade, že vírus infikuje rastlinnú bunku, tieto proteíny uvoľnia vírusovú RNA alebo DNA. Genóm vírusu sa replikuje, syntetizujú sa nové obalové proteíny a vznikajú nové vírusové častice v infikovaných bunkách. Prenos vírusových častíc z bunky do bunky je umožnený pomocou tzv. pohybových MP proteínov („movement proteins“).

Experimentálne bolo dokázané, že ak je rastlina vystavená slabej vírusovej infekcii, symptómy prejavu infekcie po vystavení takejto rastliny vysokej dávke vírusu sú slabšie ako za normálnych podmienok. Na prípravu trangénnych rastlín s rezistenciou na vírusové ochorenia sa využívajú nasledovné stratégie:

a) Rezistencia sprostredkovaná pomocou CP proteínov

b) Rezistencia sprostredkovaná pomocou vírusovej replikázy.

c) Rezistencia sprostredkovaná pomocou MP proteínov

Rezistencia sprostredkovaná pomocou CP proteínov

Napriek extenzívnemu štúdiu, molekulárny mechanizmus takejto rezistencie nie je plne objasnený a navyše je odlišný v rôznych vírusoch. Predpokladá sa, že získanie rezistencie je výsledok interakcie medzi vírusovými CP proteínmi a CP proteínu v transgénnej rastline, čo zabraňuje vírusu zbaviť sa svojho obalu a spôsobiť infekciu (Koo a i. 2004).

Prvé transgénne rastliny s expresiou CP proteínu, ktorý pochádzal z vírusu tabakovej mozaiky (TMV) boli v laboratórnych podmienkach pripravené v roku 1986 (Powell-Abel a i., 1986). Od roku 1994 boli postupne doživotného prostredia uvoľnené takto pripravené transgénne rastliny papáje (gén kódujúci CP proteín z PRSV „ringspot“ vírus), cukiny (gény kódujúce CP proteíny z mozaikového vírusu uhorky CMV, zo žltého mozaikového vírusu cukiny ZYMV a a mozaikového vírusu melónu WMV), slivky (gén kódujúci CP proteín z „plum pox“ vírusu) a zemiaka (gén kódujúci CP proteín zo zemiakového vírusu Y, PVY).

Rezistencia sprostredkovaná pomocou vírusovej replikázy

Rezistencia voči vírusu TMV založená na inhibícii vírusovej replikácie bola prvý krát popísaná Golemboski a i. (1990). Napriek tomu, že takáto replikázou získaná rezistencia predstavuje sľubný zdroj rezistencie, úloha replikázových proteínov je celkom objasnená (Prins a i., 2008). V roku 1998 bol do životného prostredia v USA uvedený transgénny zemiak obsahujúci gén kódujúci replikázu z PLRV („Potato leafroll virus“) vírusu, ktorý je rezistentný na PLRV vírus.

Rezistencia sprostredkovaná pomocou MP proteínov

Na prenos vírusu z jednej bunky do druhej sa vyžaduje prítomnosť špecifických MP proteínov. V prípade znefunkčnenia MP proteínov sa vírus nemôže šíriť ďalej. Prvé na takomto princípe založené transgénne rastliny (v laboratórnych podmienkach) boli pripravené v roku (Lapidot a i, 1993). Disfunkčné MP proteíny sa ukázali byť ako negatívne mutanty, ktoré interferovali s miestnym a systematickým pohybom vírusu spôsobujúceho infekciu. Rezistencia bola takisto efektívna aj k taxonomicky odlišným druhom vírusu. Expresia divého typu MP prispela naopak k zvýšeniu vírusovej infekcie. Napriek sľubným výsledkom v laboratórnych podmienkach, takto pripravené transgénne rastliny neboli zatiaľ uvedené do životného prostredia.

3.2.4 Zlepšenie kvalitatívnych vlastností

Genetická modifikácia rastlín ponúka možnosť aj zvýšenia nutričných vlastností poľnohospodársky významných plodín. Ako príklad môže slúžiť zlatá ryža („Golden Rice“). Štúdie ukázali, že rastlinný endogénny enzymatický proces premeny lykopénu na β-karotén v endosperme dáva rastlinám typickú žltú farbu, podľa ktorej bola ryža aj nazvaná. (Hirschberg, 2001).

Beta-karotén je prekurzor provitamínu A. Zlatá ryža bola vytvorená Ingom Potrykusom z Ústavu rastlinných vied vo Švajčiarskom federálnom technologickom inštitúte v spolupráci s Petrom Bayerom z Univerzity vo Freiburgu. Bola vyvinutá pre oblasti, kde sa ľudia živia stravou chudobnou na vitamín A. Projekt bol zahájený v roku 1992 a v roku jeho publikácie 2000 bol považovaný za významný prelom v oblasti biotechnológií ().

V rastlinách sú karotenoidy syntetizované z geranylgerynyldifosfátu (GGPP) v plastidoch. Fytoén syntáza katalyzuje tvorbu fytoénu z dvoch molekúl GGPP, ktorý sa mení  fytoén desaturázou na lykopén a následne lykopén cyklázou (LCY) na β-karotén . Prvá zlatá ryža bola vytvorená vnesením fytoén syntázy (PSY) génu z narcisu Narcissus pseudonarcissus a bakteriálneho génu pre fytoén desaturázu (CrtI) z Erwinia uredovora (Ye a i., 2000).

PSY gén bol pod kontrolou špecifického glutenínového promótora, ktorý je aktívny v endosperme a CrtI gén bol pod kontrolou konštitutívneho CaMV 35S promótora s lokalizáciou v plastidoch. Ko-transformáciou s dvoma plazmidmi: jeden obsahoval PSY a CrtI gény a druhy gén pre LCY pod kontrolou glutenínového promótora sa zvýšil obsah karotenoidov v endosperme ryže. V roku 2005 bola pripravená Zlata ryža 2 s 23-krát zvýšeným obsahom karotenoidov oproti Zlatej ryži 1 a to tým, že bol použitý PSY gén z kukurice (Paine a i., 2005).

Ďalším príkladom môže byť využitie „antisense“ technológie na spomalenie dozrievania plodov a tým predĺženie ich trvanlivosti po zbere. Princípom takejto technológie je vniesť gén do genómu rastlín tak, aby po transkripcii v rastlinách vznikla nezmyselná („antisense“) RNA a tým sa potlačila expresia endogénneho génu. Rajčiak nazvaný FlavrSavr sa stal jedným z prvých takýchto produktov, ktorý bol v roku 1994 uvedený na trh v USA. Zníženie expresie endogénneho génu pre polygalakturonázu (PG) v rajčiaku sa dosiahlo vnesením ďalšieho PG génu (v „antisense“ orientácii) izolovaného z  rajčiaka. Redukovaná expresia PG génu viedla k zníženiu degradácie pektínu, k pomalšiemu rozpadu bunkovej steny, k lepšej viskozite a k spomaleniu procesu mäknutia plodov rajčiaka. V súčasnosti okrem transgénnych rajčiakov s potlačeným dozrievaním plodov je od roku 1999 na trhu aj takto modifikovaný melón. Stratégia potlačenia expresie endogéneho génu pre aminocyklopropán cyklázu bola využitá aj pri príprave geneticky modifikovaného klinčeka (uvedený v na trh v roku 1998 v USA) a to vnesením skráteného génu pre aminocyklopropán cyklázu, čím sa potlačila expresia endogénneho génu a tým spomalila senescencia. V roku 2002 bol do životného prostredia uvoľnený trangénny tabak so níženým obsahom nikotínu, ktorý bol takisto pripravený „antisense“ technológiou.

Transgenóza ponúka možnosť ovplyvniť aj obsah a zloženie mastných kyselín v rastlinách, ktoré sa využívajú ako producenti olejov. Takto bola v roku 1994 uvedená na trh repka olejka s vysokým obsahom kyseliny laurovej, ktorý bol dosiahnutý vnesením  tioesterázového génu z Umbellularia californica. V roku 2008 bola uvedená na trh geneticky modifikovaná sója s nízkym obsahom kyseliny linolénovej, do ktorej sa vniesla ďalšia kópia génu pre omega-6 desaturázu, čím sa potlačila expresia endogénneho pre omega-6 desaturázu.

Genetickou modifikáciou je možné dosiahnuť aj zmenu v zložení obsahu aminokyselín. Príkladom môže byť geneticky modifikovaná kukurica so zvýšeným obsahom lyzínu. Modifikácia bola dosiahnutá vnesením génu kódujúceho dihydrodipikolinát syntázu Corynebacterium glutamicum.

3.2.5 GM rastliny ako továrne na proteíny

Rastliny majú vysoký potenciál byť využité a zdroj na produkciu vakcín, protilátok alebo iných biofarmateutík. GM rastliny produkujúce takéto látky sa pripravujú buď pomocou štandardných transformačných metód (A. tumefaciens, bombardovanie) alebo infikovaním netransgénnej rastliny s rekombinovaným vírusom, ktorý počas jeho replikácie u hostiteľa (rastlina) exprimuje transgén. Najčastejšie sa na tento účel používa ako hostiteľ tabak a ako vírus mozaikový vírus tabaku (TMV) alebo mozaikový vírus vigny (CPMV) (Giddings a i., 2000).

Problémom pri produkcii biofarmaceutických látok je, že už pri nízkej koncentrácii vyvolávajú odpoveď, pričom v otvorených pôdnych podmienkach sa môžu v prírode bio-akumulovať aj v necielených organizmoch. Takýmto príkladom sú neúspešné pôdne testy spoločnosti ProdiGene v USA (rok 2001), ktorá testovala transgénnu kukuricu produkujúcu trypsín pre diabetes a vakcínu pre hepatitídu B. Počas týchto testov došlo ku kontaminácii pol milióna bušelov sóje. V súčasnosti komerciálna produkcia rastlín, ktoré by produkovali látky využiteľné vo farmaceutickom priemysle síce zatiaľ nebola povolená v žiadnom štáte, ale pôdne testy prebiehajú.

3.2.6 GM rastliny a Slovensko

V roku 2006 sa na Slovensku po prvýkrát oficiálne pestovala GM kukurica MON810. Pestovanie tejto kukurice je v EÚ povolené od septembra 2004, kedy sa odrody tejto kukurice dostali do európskeho katalógu osív. Voči tomuto povoleniu vyhlásili niektoré krajiny zákaz na ich území – teda pestovanie GM kukurice MON810 je zakázané v Maďarsku, Rakúsku, Poľsku a Grécku. Na Slovensku je pokusné pestovanie tejto kukurice približne na 30 hektároch. (). Zoznam GM rastlín, ktoré dostali povolenie na zavedenie do ŽP alebo na dovoz je zhrnutý v Tab. 2.

Tab. 2  Zoznam geneticky modifikovaných organizmov, ktorých používanie v Slovenskej republike bolo povolené podľa paragrafu 17 ods. 1 zákona č. 151/2002 Z.z. v znení neskorších predpisov - poľné pokusy ()

[pic]

3.3. Legislatíva EU týkajúca sa GMO

EÚ má pravdepodobne najprísnejšie predpisy na svete pre prítomnosť GMO v potravinách a krmivách. Komerčné pestovanie GM plodín v EU je zatiaľ obmedzené. Na európskom trhu sa však vyskytujú GMO produkty. Podľa smernice EÚ musia byť označené všetky potraviny obsahujúce viac ako 0,9% GMO a to isté sa týka aj krmív pre zvieratá. Živočíšne produkty ako mlieko, mäso alebo vajcia získané zo zvierat kŕmených GM krmivom už označené byť nemusia ().

Legislatíva EÚ týkajúca sa GMO vznikala od začiatku 90-tych rokov. EÚ pripravila špecifickú legislatívu o GMO za účelom ochrany zdravia svojich obyvateľov a životného prostredia a súčasne vytvorila zjednotený trh pre biotechnológie.

1. Smernica 2001/18 o zámernom uvoľňovaní geneticky modifikovaných organizmov do životného prostredia je “horizontálnou” smernicou, ktorá reguluje experimentálne uvoľňovanie geneticky modifikovaných organizmov a umiestňovanie GMO na trhu.

2. Nariadenie 1829/2003 o geneticky modifikovaných potravinách a krmivách reguluje umiestňovanie potravín a krmív obsahujúcich GMO alebo pozostávajúcich z GMO na trhu a tiež upravuje označovanie takýchto produktov pre finálneho spotrebiteľa.

3. Nariadenie 1830/2003 predstavuje harmonizovaný systém EÚ pre vysledovateľnosť a označovanie geneticky modifikovaných organizmov a krmív vyrobených z GMO

4. Nariadenie 641/2004 o podrobných pravidlách implementácie nariadenia 1829/2003.

5. Smernica 90/219/EHS, zmenená a doplnená smernicou 98/81/ES o používaní geneticky modifikovaných mikroorganizmov (GMM) v uzavretých priestoroch reguluje výskumné a priemyselné aktivity zaoberajúce sa GMM v uzavretých priestoroch. Patria sem aj pracovné aktivity v laboratóriách ().

3.3.1 Legislatíva Slovenskej republiky týkajúca sa GMO

Všetky prípady súvisiace s používaním genetických technológií a GMO t.j., používanie v uzavretých priestoroch a zámerné uvoľnenie, podliehajú podľa platných právnych predpisov schvaľovaciemu konaniu. Znamená to, že každá právnická a fyzická osoba, ktorá chce na území SR používať genetické technológie a GMO, môže tieto používať len na základe súhlasu príslušného orgánu. Príslušnými orgánmi vo veciach povoľovania narábania s genetickými technológiami a GMO na Slovensku sú: Ministerstvo životného prostredia SR a Ministerstvo pôdohospodárstva SR (ivvl.sk/stmat/gmo.ppt; ). Platná legislatíva týkajúca sa GMO:

1. Novela zákona 151/2002 Z.z.. Od 1. mája 2010 je účinný zákon č. 117/2010 Z.z., ktorý článkom IV. mení a dopĺňa zákon č. 151/2002 Z. z. o používaní genetických technológií a geneticky modifikovaných organizmov v znení neskorších predpisov.

2. Národný rámec regulácie používania GMO a výrobkov z nich. Tento dokument informuje o tom, ako Slovensko implementovalo medzinárodnú a európsku legislatívu. Na tieto účely tento dokument:

• predstavuje genetické modifikácie, potenciálne aplikácie geneticky modifikovaných organizmov, možné prínosy a obavy

• poskytuje prehľad o medzinárodnom kontexte regulácie biologickej bezpečnosti

• sumarizuje existujúcu európsku a národnú legislatívu a vysvetľuje ako vzájomne nadväzujú

• predstavuje rôzne orgány štátnej správy a ich kompetencie ku legislatívnym dokumentom

• popisuje ako štátne orgány v praxi vykonávajú štátnu správu, s ohľadom na ich spoluprácu v konkrétnych konaniach.

3. Vyhláška č. 312/2008. Dňa 15. augusta 2008 nadobudla účinnosť vyhláška MŽP SR č. 312/2008 Z.z., ktorou sa mení a dopĺňa vyhláška MZP SR č. 399/2005 Z. z., ktorou sa vykonáva zákon č. 151/2002 Z. z. o používaní genetických technológií a geneticky modifikovaných organizmov v znení neskorších predpisov

4. Novela zákona č. 151/2002 Z.z. Dňa 1. júla 2008 nadobudol účinnosť zákon NR SR č. 100/2008 Z.z., ktorým sa mení a dopĺňa zákon č. 151/2002 Z. z. o používaní genetických technológií a geneticky modifikovaných organizmov v znení neskorších predpisov

5. Novela zákona č. 151/2002 Z.z. Dňa 3. februára 2005 vstúpil do platnosti zákon č. 77/2005 Z.z., ktorým sa mení a dopĺňa zákon č. 151/2002 Z.z. o používaní genetických technológií a geneticky modifikovaných organizmov s účinnosťou od 1. apríla 2005.

6. Zákon č. 184/2006 Z.z. o pestovaní GM rastlín v poľnohospodárskej výrobe účinný od 1.07.2006

• stanovuje podmienky nakladania s geneticky modifikovanými rastlinami

• stanovuje opatrenia na ochranu rastlín pestovaných konvenčným spôsobov hospodárenia

• ekologickým spôsobom hospodárenia

• stanovuje opatrenia na zamedzenie nežiadúcej prítomnosti geneticky modifikovaných organizmov

7. Vyhláška č. 69/2007 Z.z., ktorou sa vykonáva zákon č. 184/2006 Z.z. o pestovaní GM rastlín v poľnohospodárskej výrobe a upravuje podrobnosti:

• technických opatreniach súvisiacich s GM rastlinami

• odbornom pláne pestovania modifikovaných rastlín

• najmenších izolačných vzdialenostiach

• školení, o nakladaní s modifikovanými rastlinami

ZÁVER A NÁVRH NA VYUŽITIE POZNATKOV

Napriek tomu, že prvé rastlinné transformačné technológie boli vyvinuté v roku 1983, prvá geneticky modifikovaná plodina vstúpila na trh až v polovici 90-tich rokov minulého storočia. Genetické modifikácie boli zamerané na zlepšenie agronomických vlastností ako tolerancia voči herbicídom, insekticídom, rezistencia voči vírusom alebo potlačenie dozrievania plodov. Tieto modifikácie priniesli benefit pre pestovateľov a spoločnosti zaoberajúce sa predajom semien. Nazývame ich aj GM rastliny prvej generácie. Medzi najznámejšie patrí rajčiak FlavrSavrTM s potlačeným dozrievaním plodov. V poslednej dekáde sa pozornosť sústredila na prípravu druhej generácie GM rastlín s vylepšenými vlastnosťami, ktoré sú benefitom už aj pre konzumentov ako vysoká nutričná kvalita, nižšia alergicita atď. Druhú generáciu reprezentuje napr. sója s vysokým obsahom mastných kyselín alebo kyseliny laurovej; ryža s vysokým obsahom vitamínu A. Napriek tomu, že GM rastliny sú širokou verejnosťou stále prijímané rozporuplne, vývoj technológie transgenózy v posledných desaťročiach prudko stúpol a v súčasnosti nastupuje tretia generácia GM rastlín ako tovární na produkciu proteínov (vakcíny, protilátky, farmaceutické proteíny). Kombinácia tradičného šľachtenia a moderných biotechnologických techník môže významne prispieť k vyriešeniu problematiky týkajúcej nedostatku potravy pre ľudstvo ako také. Avšak, úspešná aplikácia GM rastlín v komerčnom prostredí závisí hlavne od akceptácie takýchto rastlín širokou verejnosťou.

Zoznam použitej literatúry

BEVAN, M. 1984. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. In Nucl. Acids Res. vol. 12, 1984, s. 8711-8721.

BEŽO, MILAN – HRUBÍKOVÁ, KATARÍNA – ŽIAROVSKÁ, JANA – KUTIŠOVÁ, JANA. 2009. Geneticky modifikované rastliny – prínosy a nástrahy. 1. vyd. Nitra: SPU, 2009. s. 26-27 ISBN 978-80-552-0314-0

BINNS, A.N. - COSTANTINO, P. 1998. The Agrobacterium oncogenes. In The Rhizobiaceae (Ed. Spaink, H., Kondorosi, A., Hooykaas, P.J.J. ), 1998, s. 251-66.

BIRCH, A.N.E. – GEOGHEGAN, I.E. – MAJURUS, M.E.N. – MCNICOL, J.W. – HACKETT, C.A. – GATEHOUSE, M.R. – GATEHOUSE, J.A. 1999. Tri-tropic interactions involving pest aphids, predatory 2-spot ladybirds and transgenic potatoes expressing snowdrop lectin for aphid resistance. In Mol. Breeding, vol. 5, 1999, s. 75-83.

BRADLEY, L.R. - KIM, J.S. - MATTHYSSE, A.G. 1997. Attachment of Agrobacterium tumefaciens to Carrot Cells and Arabidopsis wound sites is correlated with the presence of a cell-associated, acidic polysaccharide. In Journal of Bacteriology, vol. 179, 1997, s. 5372-5379.

BRAVO ANGEL, A.M. - HOHN, B. - TINLAND, B. 1998. The omega sequence of VirD2 is important but not essential for efficient transfer of the T-DNA by Agrobacterium tumefaciens. In Molecular Plant-Microbe Interactions, vol. 11, 1998, s. 57-63.

COMAIN, L. – FACCIOTTI, D. – HIATT, W.R. – THOMPSON, R.W.E. – STALKER, D. M. 1985. Expression in plants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosate- In Nature, vol. 317, 1985, s. 741-744.

DESSAUX, Y. - PETIT, A. - TEMPE, J. 1992 Opines in Agrobacteriumbiology. In Molecular Signals. In Plant–Microbe Communications. Verma, D.P.S. (ed.). Boca Raton: CRC Press, s. 109–136.

GÁLOVÁ, ZDENKA – BALÁŽOVÁ, ŽELMÍRA – MICHALÍK, IVAN- LIBANTOVÁ JANA – MORAVČÍKOVÁ JANA – HRICOVÁ ANDREA – MATUŠÍKOVÁ ILDIKÓ. 2008. Biotechnológie v rastlinnej produkcii. SPU Nitra, 2008, 149s. ISBN 978-80-552-0146-7.

GIDDINGS, G. – ALLISON, G. – BROOKS, D. – CARTER, A. 2000. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. In Nature biotechnology, vol. 18, 2000, s. 1151-1155.

GILLIAN TURGEON, B. – BRADFORD, C. - LIU, J. - ZHANG, N. 2009. Protoplast Transformation of Filamentous Fungi. In Methods in Molecular Biology, vol. 638, 2009, s. 3-19.

GOLEMBOSKI, D.B. – LOMONOSSOFF, G.P. – ZAITLIN, M. 1990. Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus. In Proc. Natl Acad. Sci. USA, vol. 87, s. 6311-6315 .

GURALNICK, B. - THOMSEN, G. - CITOVSKI, V. 1996. Transport of DNA into the nuclei of Xenopusoocytes by a modified VirE2 protein of Agrobacterium. In Plant Cell, vol. 8, 1996, s. 363-373.

HASELOFF, J. - AMOS, B. 1995. GFP in plants. In Trends Genet. vol. 11, 1995, s. 328-329.

HASSAIRI, A. - MASMOUDI, K. - ALBOUY, J. - ROBAGLIA, CH. - JULLIEN, M., ELLOUZ, R. 1998. Transformation of two potato cultivars “Spunta” and “Claustar” (Solanum tuberosum) with lettuce mosaic virus coat protein gene and heterogolous immunity to potato virus Y. In Plant Science, vol. 136, 1998, s. 31-42.

HELLENS, R. - MULLINEAUX, P. - KLEE, H. 2000. A guide for Agrobacterium binary Ti vectors. In Trends Plant Sci. vol. 10, s . 446-451.

HIRSCHBERG, J. 2001. Carotenoid biosynthesis in flowering plants. Current Opinion. In Plant Biology, vol. 4, 2001, s. 210-218.

HOOYKAAS, P.J.J. - SHILPEROORT, R.A. 1992. Agrobacterium and plant genetic engineering. In Plant Molecular Biology, vol. 19, 1992, s. 15-38.

HORSCH, R.H. – FRALEY, R.T. – ROGER, S.G. – KLEE, H.J. – FRY, J. – HINCHEE, M.A.W. – SHAH, D. S. 1988. Agrobacterium-mediated gene transfer to plants: engineefing tolerance to glyphosate. In J. Sci., vol. 62, 1988, s. 487-502.

HUFFMAN, G.A. – WHITE, F.F. – GORDON, M.P. – NESTER, E.W. 1984. Hairv root inducing plasmid: physical map and homology to tumor inducing plasmids. In J Bacteriol, vol. 157, 1984, s. 269-276.

HUSSAIN, S.S. – HUSNAIN, T. – RIAZUDDIN, S. 2007. Sonicated assisted Agrobacterium mediated transformation (SAAT): an alternative method for cotton transformation. In Pak J Bot, vol. 39, 2007, s. 223–30.

CHILTON, M.D. – TEPFER, D.A. – PETIT, A. – DAVID, C. - CASSE-DELBART, F. – TEMPE, J. 1982. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of host plant root cells. I. Nature, vol. 295, 1982, s. 432-434.

JEFFERSON, R.A. - WILSON, K. 1991. The GUS gene fusion system. In Gelvin, S.G., Schilperoort, R.A., Verma, D.P.S. (eds.), Plant molecular biology Manual, 1991, s. 387-405.

KHAN, E.U. – LIU, J.H. 2009. Plant biotechnological approaches for the production and commercialization of transgenic crops. In Biotechnol. and Biotechnol., vol. 23, 2009, s. 1281-1288.

KOMARI, T. - HIEI, Y. - SAITO, Y. - MURAI, N. - KUMASHIRO, T. 1996. Vector carrying two separate T-DNA for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. In Plant J., vol. 10, 1996, s. 165-174.

KOO, J.C. – ASURMENDI, S. – BICK, J. – WOODFORD-THOMAS, T. – BEACHY, R.N. 2004. Ecdysone agonist-inducible expression of a coat protein gene from tobacco mosaic virus confers viral resistance in transgenic Arabidospis. In Plant Journal, vol 37, s. 439-448.

LAPIDOT, M. - GAFNY, R. - DING, B. - WOLF, S. - LUCAS, W. J. - BEACHY, R. N. 1993. A dysfunctional movement protein of tobacco mosaic virus that partially modifies the plasmodesmata and limits virus spread in transgenic plants. In Plant Journal, vol. 4, 1993, s. 959-970.

LAZO, G.R. - STEIN, P.A. - LUDWIG, R.A. 1991. A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. In Bio/Tech. vol. 9, 1991, s. 963-967.

MATTHYSSE, A.G. 1986. Initial interactions of Agrobacterium tumefaciens with plant host cells. In Microbiology, vol. 13, 1986, s. 281-307.

NIXON, B.T. - RONSON, C.W. – AUSUBEL, F.M. 1986. Two-component regulatory systems responsive to environmental stimuli share strongly conserved domains with the nitrogen assimilation regulatory genes ntrB and ntrC. In Proceedings of National Academy of Sciences USA, vol. 83, 1986, s. 7850-7854.

ODELL, J.T. - NAGY, F. – CHUA, N.H. 1985. Identification of DNA sequences required for activity of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter. In Nature, vol. 313, 1985, s. 810–812.

ONDŘEJ, M. – DROBNÍK, J. 2002. Transgenoze rostlin. 1. vyd. Praha: Academia, 2002. 484 s. ISBN 80-200-0958-2

OW, D.W. - WOOD, K.V. - DELUCA, M. - DEWET, J.R. - HELINSKI, D.R. - HOWELL, S.H. 1986. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. In Science, vol. 234, 1986, s. 856-859.

PAINE, J.A. – SHIPTON, C.A. – CHAGGAR, S. 2005. Improving the nutritional value of golden rice through increased provitamin A content. In Nature Biotechnology, vol. 23, 2005, s. 482-487.

PAN, S.Q. - CHARLES, T. - JIN, S. - WU, Z.L. - NESTER, E.W. 1993. Preformed dimeric state of the sensor protein VirA is involved in plant-Agrobacterium signal transduction. In Proceedings of the National Academy of Sciences USA, vol. 90, 1993, s. 9939-9943.

POTRYKUS, I. 2000. Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. In Science, vol. 287, 2000, s. 303-305.

POWELL-ABEL, P. – NELSON, R.S. DE, B. – HOFFMAN, S.G. – ROGERS, R.T. – FRALEY, R.T. – BEACHY, R.N. 1986. Delay of disease development in transgenic plants that express the tabacco mosaic virus coat protein gene. In Sciense, vol. 232, 1986, s. 738-743.

PRINS, M. – LAIMER, M. – NORIS, E. – SCHUBERT, J. – WASSENEGGER, M. – TEPFER, M. 2008. Strategies for antiviral resistance in transgenic plants. In Molecular plant pathology, vol. 9, 2008, s. 73-83.

RAO, A.Q. – BAKHSH, A. – KIANI, S. – SHAHZAD, K. - SHAHID, A.A. - HUSNAIN T. – RIAZUDDIN, S. 2009. The myth of plant transformation. In Biotechnology Advances, vol. 27, 2009, s. 753–763.

ROSSI, L. - HOHN, B. - TINLAND, B. 1996. Integration of complete T-DNA units is dependent on the activity of VirE2 protein of Agrobacterium tumefaciens. In Proceedings of the National Academy of Sciences USA, vol. 93, 1996, s. 126-130.

SHAH, D.M. – HORSCH, R.B. – KLEE, H.J. – KISHORE, G.M. – WINTER, J.A. – AYKENTZ, J.A. – SIEGEL, N.R. – ROGERS, S.G. – FRALEY, R.T. 1986. Engineering herbicide tolerance in ransgenic plants. In Science, vol. 233, 1986, s. 478-481.

SHAW, C.H. - LEEMANS, J. - VAN MONTAGU, M. - CHELL, J. 1983. A general method for the transfer of cloned genes to plant cells. In Gene, vol. 23, s. 315.

SHENG, J. – CITOVSKI, V. 1996. Agrobacterium-plant cell. DNA transport: Have virulence proteins, will travel.In The Plant Cell, vol. 8, 1996, s. 1699-1710.

SLIGHTOM, J.L. - DURAND-TARDIF, M. – JOUANIN, L. – TEPFER, D. 1986. Nucleotide sequence analysis of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenesagropine type plasmid. In J Biol Chem, vol. 261, 1986, s. 108-121.

SMITH, E.F. – TOWNSEND, C.O. 1907. A plant tumour of bacterial origin. In Science, vol. 25, 1907, s. 671-673.

THOMASHOW, M. – HUGLY, S. – BUCHHOLZ, W. – THOMASHOW, L. 1986. Molecular basis for the auxin-independent phenotype of crown gall tumor tissues. In Science, vol. 231, 1986, s. 616-618.

TURK, S.CH.J. – VAN LANGE, R.P. - SONNEVELD, E. - HOOYKAAS, P.J.J. 1993. The chimeric VirA-Tar receptor protein is locked into highly responsive state. In Journal of Bacteriology, vol. 175, 1993, s. 5706-5709.

VAN ENGELEN A. - MOLTHOFF, J.W. - CONNER A.J. - NAP, J.P. - PEREIRA, A., -STIEKEMA, W.J. 1995. pBINPLUS: an improved plant transformation vector based on pBIN19. In Transg. Res., vol. 4, 1995, s. 288-290.

VEENA, V. – TAYLOR, CH.G. 2007. Agrobacterium rhizogenes: recent developments and promising applications.In In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, vol. 43, 2007, s. 383-403.

WANG, K. – DRAYTON, P. – FRAME, B. – DUNWELL, J. – THOMPON, J.A. 1995. Whisker mediated planttransformation: an alternative technology. In In Vitro Cell Dev. Biol., vol. 31, 1995, s. 101-104.

ZAMBRYSKI, P.C. 1992. Chronicles from the Agrobacterium - plant cell DNA story. Annu. Rev. Plant Physiol. In Plant Mol. Biol., vol. 43, 1992, s. 465-490.

Ziemienowicz, A. 2001. Odyssey of Agrobacterium T-DNA. In: Acta Biochimica Polonica, vol. 48, 2001, s. 623 – 635.

ZUPAN, J.R. - CITOVSKI, V. - ZAMBRYSKI, P.C. 1996. Agrobacterium VirE2 protein mediates nuclear uptake of single-stranded DNA in plant cells. In Proceedings of the National Academy of Sciences USA, vol. 93, 1996, s. 2392-2397.

ZUPAN, J.R. - ZAMBRYSKI, P.C. 1995. Transfer of TDNA from Agrobacterium to the plant cell. In Plant hysiology, vol. 107, 1995, s. 1041-1047.

POTRYKUS, I. 2000. Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathwayinto (carotenoid-free) rice endosperm. In Science, vol. 287, 2000, s. 303-305.

bioweb.genezis.eu/molekularka/ti_plazmid.gif

students/agrobacterium/characteristics.html

orion.sci.muni.cz/kgmb/student/7120/plazmidy.pdf 19.2.2010

cals.ncsu.edu/course/pp728/Agrobacterium/Alyssa_Collins_profile.htm

cals.ncsu.edu/course/pp728/Agrobacterium/cell.JPG

general82/agrobacterium.jpg

science.smith.edu/cmbs/Equipment%20photos/Large/biolistic.jpg

.sk/index/go.php?id=1224

agroporadenstvo.sk/potraviny/clanky/gmo.htm

ivvl.sk/stmat/gmo.ppt

gmo.sk

gmo.sk/sk/?page=38

Prílohy

Príloha A: CD médium – bakalárska práca v elektronickej podobe

................
................

In order to avoid copyright disputes, this page is only a partial summary.

Google Online Preview   Download