Bárbara Filipa Santos Ramos - Repositório Aberto
Mestrado em Controlo de Qualidade
Área de Especialização em Água e Alimentos
Bárbara Filipa Santos Ramos
Porto
Março de 2008
Bárbara Filipa Santos Ramos
Licenciada em Microbiologia
Gema de ovo.
Composição em aminas biogénicas.
Influência da gema na fracção volátil de cremes de pasteleiro
Orientador:
Professora Doutora Isabel Maria Pinto Leite Viegas Oliveira Ferreira
Co-Orientador:
Professora Doutora Olívia Pinho
Março de 2008
Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre em Controlo de Qualidade de Água e Alimentos
Apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto
Este trabalho foi realizado na
Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto,
no Serviço de Bromatologia da Universidade do Porto
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS x
RESUMO xii
ABREVIATURAS xvii
INTRODUÇÃO 1
1- Características do Ovo 3
1.1- Estrutura e Composição do Ovo 4
1.1.1 Casca 5
1.1.2. Clara 6
1.1.3. Gema 8
1.2- Valor Nutricional 10
1.3 Proteínas com função antimicrobiana 14
1.3.1 Lisozima 15
1.3.2 Ovotransferrina 16
1.3.3 Ovoglobulina IgY 17
1.3.4 Avidina 17
1.4 Proteínas Antiaderentes 18
1.5 Aminas biogénicas – Diaminas e Poliaminas 18
2- Modificações na composição do Ovo durante o armazenamento 20
2.1 Conservação 21
2.2 Contaminação 21
2.2.1 Salmonella spp. 23
2.3 Modificações ao longo do armazenamento 24
3- Propriedades Funcionais do Ovo 27
3.1 Coagulação ou floculação 29
3.2 Propriedades emulsionantes 29
3.3 Capacidade espumante 30
3.4 Capacidade aromática e corante 31
Objectivos da Tese 33
A. Composição em Aminas Biogénicas da gema de ovo: Influência do tempo e da temperatura de armazenamento 35
A.1. Introdução 36
A.1.1. Aminas Biogénicas 36
A.1.2. Metodologias analíticas para doseamento de aminas biogénicas 39
A.2. Parte experimental 41
A.2.1 Amostragem 41
A.2.2. Material e métodos 42
A.2.3 Análise estatística 46
A.3. Resultados e Discussão 47
A.3.1. Optimização do método de HLPC e do processo extractivo 47
A.3.2. Composição em aminas biogénicas da gema de ovo 48
A.3.3. Influência da temperatura e tempo de armazenamento dos ovos na composição em aminas biogénicas da gema 52
A.3.4. Previsão do tempo de armazenamento do ovo 54
B. Influência da Gema de Ovo/Aromatizantes no Perfil de Voláteis e nas Características Sensoriais dos cremes de pasteleiro 56
B.1. Introdução 57
B.1.1. Compostos aromatizantes da gema de ovo 57
B.1.2. Métodos Analíticos para caracterização da fracção volátil 59
B.2. Parte experimental 61
B.2.1 Amostragem 61
B.2.2. Análise da Fracção Volátil dos Cremes de Pasteleiro 62
B.2.3. Determinação da Composição Nutricional dos Cremes de Pasteleiro 64
B.2.4. Análise Sensorial dos Cremes de Pasteleiro 65
B.2.5. Análise estatística 68
B.3 Resultados e Discussão 69
B.3.1. Composição da fracção Volátil dos Cremes de Pasteleiro 69
B.3.2. Aplicação da análise discriminante para prever a origem dos cremes de pasteleiro 79
B.3.3. Perfil Sensorial dos Cremes de Pasteleiro 81
B.3.4. Comparação entre o perfil de voláteis e o perfil sensorial dos cremes de pasteleiro 83
CONCLUSÕES GLOBAIS 85
A. Composição em aminas biogénicas da gema de ovo 86
B. Influência da gema na fracção volátil de cremes de pasteleiro 87
BIBLIOGRAFIA 89
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Características físico-químicas das proteínas presentes na clara de ovo 7
Tabela 2. Composição em proteínas da gema de ovo 9
Tabela 3. Composição em carotenóides da gema de ovo 9
Tabela 4. Composição nutricional do ovo bruto inteiro (por 100g) 10
Tabela 5. Composição em amino ácidos do ovo comestível (por 100g) 11
Tabela 6. Componentes lipídicos do ovo comestível (por 100g) 12
Tabela 7. Vitaminas presentes no ovo comestível (por 100g) 13
Tabela 8. Composição em minerais do ovo comestível (por 100g) 14
Tabela 9. Composição de aminas e poliaminas em ovos 19
Tabela 10. Vantagens e limitações à utilização dos principais ovoprodutos 28
Tabela 11. Potentes aromatizantes da gema de ovo 32
Tabela 12. Esquema do gradiente de eluição usado na separação das aminas biogénicas em estudo. 45
Tabela 13. Parâmetros das curvas de calibração determinados pelo método do padrão externo 47
Tabela 14. Composição em aminas biogénicas doseadas na gema dos ovos caseiros 48
Tabela 15. Composição em aminas biogénicas doseadas na gema dos ovos comerciais 50
Tabela 16. Aldeídos identificados após extracção dos compostos voláteis, nas amostras de cremes de pasteleiro 72
Tabela 17. Cetonas identificadas após extracção dos compostos voláteis, nas amostras de cremes de pasteleiro 73
Tabela 18. Hidrocarbonetos aromáticos identificados após extracção dos compostos voláteis, nas amostras de cremes de pasteleiro 74
Tabela 19. Furanos identificados após extracção dos compostos voláteis, nas amostras de cremes de pasteleiro 75
Tabela 20. Ésteres identificados após extracção dos compostos voláteis, nas amostras de cremes de pasteleiro 75
Tabela 21. Hidrocarbonetos identificados após extracção dos compostos voláteis, nas amostras de cremes de pasteleiro 76
Tabela 22. Álcoois identificados após extracção dos compostos voláteis, nas amostras de cremes de pasteleiro 77
Tabela 23. Ácidos identificados após extracção dos compostos voláteis, nas amostras de cremes de pasteleiro 77
Tabela 24. Principais componentes dos cremes de pasteleiro das bolas de Berlim 79
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura seccional do ovo de galinha (Laghi et al., 2005). 4
Figura 2. Esquema da secção radial da casca de ovo (Larrañaga et al., 1999) 5
Figura 3. Micromapeamento electrónico de sondagem da casca de ovo. a) Cutícula com uma superfície homogénea, a1) superfície da cutícula corroída, a2) secção radial da casca mostrando a cutícula; b) superfície externa da casca; b1) superfície externa da casca com irregularidades, b2) superfície externa com aspecto granular; c) superfície interna com estrias e poros normais, c1) superfície interna com pequenas fissuras, c2) superfície interna com fissuras e poros (Favier et al., 2000). 22
Figura 4. Aspecto dos ovos frescos e dos ovos envelhecidos (baseado em Larrañaga et al., 1999). 24
Figura 5. Circuitos da formação das aminas biogénicas e das poliaminas (Mariné-Font et al., 1995). 38
Figura 6. Esquema da amostragem para os ovos caseiros 41
Figura 7. Esquema da amostragem para os ovos comerciais 42
Figura 8. Esquema resumido da extracção e derivatização das aminas biogénicas. 44
Figura 10. Conteúdo em aminas biogénicas do ovo caseiro armazenado a 5ºC………..49
Figura 11. Conteúdo em aminas biogénicas do ovo caseiro armazenado a 25ºC……….49
Figura 12. Evolução do teor de etanolamina, etilamina, propilamina, cadaverina e putrescina ao longo do prazo de validade dos ovos, armazenados a 25 e a 5 ºC………51
Figura 13. Previsão do tempo de armazenamento dos ovos ao longo do prazo de validade………………………………………………………………………………....55
Figura 14. Esquema do processo de extracção dos voláteis do creme de pasteleiro…...64
Figura 15. Modelo de ficha usado pelos provadores na análise sensorial dos cremes de pasteleiro………………………………………………………………………..………67
Figura 16. Distribuição dos compostos voláteis, agrupados em famílias, nas amostras de creme de pasteleiro………………………………………………...…………………...70
Figura 17. Detalhe da distribuição das famílias de compostos voláteis, nas amostras de creme de pasteleiro CPO1, CPO2 e SB…………………………………………..…….70
Figura 18. Detalhe da distribuição das famílias de compostos voláteis, nas amostras de creme de pasteleiro das bolas de Berlim (CP1, CP2, CP3 e CP4)………………..……71
Figura 19. Representação gráfica da Função 1 e da Função 2 da análise de componentes principais realizada os resultados obtidos por HS-SPME-GC/MS na análise da fracção volátil das amostras de creme de pasteleiro das bolas de Berlim………………………78
Figura 20 – Funções canónicas discriminates para os cremes de pasteleiro (CPO1, CPO2, SB, CP1, CP2, CP3, CP4)……………………………………………...……….80
Figura 21. Perfil sensorial das amostras dos cremes de pasteleiro, CPO1, CPO2 e SB..81
Figura 22. Perfil sensorial das amostras dos cremes de pasteleiro, CP1, CP2, CP3 e CP4……………………………………………………………………………………..82
Figura 23. Perfil sensorial de todas as amostras dos cremes de pasteleiro analisadas…83
AGRADECIMENTOS
Este trabalho pretende ser um acto, sobretudo, de gratidão ao Departamento de Bromatologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, onde encontrei um ambiente de consideração, amizade e excelência académica que me permitiram realizar esta pesquisa.
Começando pela minha Orientadora, Doutora Isabel Ferreira, agradeço a sua simpatia, disponibilidade, confiança e entusiasmo. À Professora Olívia Pinho, Co- Orientadora, agradeço a forma simpática, dinâmica, prestável e sobretudo humilde de demonstrar seu grande valor, não só nas horas de trabalho, bem como nas de convívio, também fundamentais, e que fazem toda a diferença.
Às Licenciadas Sofia Silva e Francisca Menezes agradeço a ajuda técnica, prestada de forma rápida e eficaz.
A todos os elementos do Laboratório de Bromatologia, colegas e funcionários (também agora amigos) aprecio a forma como me integraram no grupo, de forma calorosa. Agradeço à Engenheira Elisa Soares a palavra amiga e experiente nos momentos de desânimo. Agradeço também a todo o grupo do Laboratório de Optimização de Processos Alimentares da ESB, onde integrei uma bolsa de investigação desde 2005, com especial destaque para a Professora Cristina Silva e a Doutora Teresa Brandão, que sempre demonstraram simpatia e compreensão, dando-me autonomia de horários de forma a eu concluir o mestrado.
Quero ainda salientar todas as minhas amigas que em momentos de desânimo e frustração, me tentaram animar com palavras e gestos de carinho, destacando as minhas amigas Fátima Miller, Joana Fundo e Patrícia Almeida. Agradeço aos amigos que criei no Serviço de Bromatologia, particularmente à Olga Viegas e ao Armindo Melo que me incentivaram a escrever a tese nos momentos de menor inspiração. Não me posso esquecer da minha amiga e colega de mestrado, Elisângela Costa que esteve presente em todos os momentos desde o início até ao fim do mestrado e que sempre me fez companhia nas noites que passei a trabalhar no laboratório.
Agradeço ao Nuno pelo amor e dedicação, que com carinho e muita paciência me animou nos momentos mais difíceis, e pelos fins-de-semana que me fez companhia enquanto eu estudava.
Agradeço aos meus restantes amigos, sem salientar ninguém, por todo o apoio e compreensão demonstrada quando eu continuamente desmarquei encontros com eles por causa do mestrado.
Por último, não poderia deixar de agradecer profundamente aos meus pais, irmã e sobrinho pelo apoio incondicional que sempre me deram. À minha mãe agradeço o carinho e a presença constantes, fundamentais em todo o meu percurso de vida. Agradeço ao meu sobrinho que com o seu amor, carinho e alegria, foi dos únicos capazes de me animar e fazer esquecer momentos de maior adversidade. À minha irmã pelo incentivo constante. Ao meu pai agradeço, por toda apoio e confiança demonstrados.
RESUMO
O trabalho experimental realizado nesta dissertação divide-se em duas partes. Na primeira, avaliou-se a influência da temperatura e do tempo de armazenamento na composição em aminas biogénicas da gema de ovo, na segunda estudou-se a influência da gema de ovo na fracção volátil e nas características sensoriais de creme de pasteleiro.
A metodologia de RP-HPLC/UV, com derivatização por dabsilo, optimizada para a quantificação de aminas biogénicas na gema de ovo, revelou-se adequada para o doseamento de putrescina, cadaverina, histamina, etilamina, propilamina, etanolamina, tiramina, triptamina, espermina, espermidina, feniletilamina. Foi possível estudar o efeito da temperatura e do tempo de armazenamento no teor de aminas biogénicas da gema, ao longo do prazo de validade do ovo. Nas gemas de ovo só foram detectadas cinco das onze aminas biogénicas em estudo: putrescina, cadaverina, propilamina, etilamina e etanolamina. O tempo de armazenamento ao longo do prazo de validade tem efeito significativo no teor das cinco aminas (p0.01. A diminuição significativa do teor de aminas biogénicas ao longo do prazo de validade justificou a aplicação de uma regressão linear múltipla em stepwise para estimar o tempo de armazenamento.
Um método de microextracção em fase sólida no “headspace” acoplado a GC/MS foi optimizado para caracterizar a fracção volátil dos cremes de pasteleiro. O perfil de voláteis de cremes de pasteleiro contendo gemas de ovo foi comparado com o perfil de voláteis de creme de pasteleiro com substituto e com a fracção volátil de cremes de pasteleiro comerciais recolhidos de bolas de Berlim. Um total de 92 compostos voláteis foi identificado no presente estudo. As famílias de compostos voláteis detectados incluíram hidrocarbonetos alifáticos e alicíclicos (26), aldeídos (10), cetonas (10), hidrocarbonetos aromáticos (20), furanos (6), álcoois (12), ésteres (3) e ácidos (5). A análise discriminante dos resultados dos voláteis foi aplicada para prever a origem do creme de pasteleiro. A função obtida permitiu classificar correctamente todas as amostras de acordo com o tipo e origem do creme de pasteleiro. Adicionalmente, efectuou-se a análise descritiva para avaliar o perfil sensorial dos diferentes tipos de creme de pasteleiro. Obtiveram-se diferentes perfis sensoriais para os cremes de pasteleiro de diferentes origens.
Abstract
The experimental work of this thesis is divided in two parts. The first, evaluates the influence of temperature and storage time in the composition of biogenic amines in egg yolk, the second studied the influence of egg yolk in the volatile fraction and sensory characteristics of bakery creams.
The RP-HPLC/UV method, using dabsil derivatization, optimized for the determination of biogenic amines in egg yolk, was appropriate quantification putrescine, cadaverine, histamine, etilamine, propilamine, etanolamine, tiramine, triptamine, espermine, espermidine, feniletilamine. The effect of temperature and time of storage in the levels of biogenic amines during egg shelf-life was evaluated. Only five of the eleven biogenic amines under study were detected: putrescine, cadaverine, propilamine, etilamine e etanolamine. Storage time during shelf-life presented a significant effect on the levels of the five amines (p0.01. The significant reduction of biogenic amines during the shelf-life justified the application of a multiple linear regression using stepwise method to estimate the storage time.
A headspace solid phase microextraction method coupled to GC/MS was optimized to caracterize the volatile fraction of bakery creams. Volatile profiles of egg bakery creams were compared with the volatile profiles of a bakery cream substitute and with the volatile fraction of commercially available bakery creams collected from “bolas de Berlim”. A total of 92 volatile compounds were identified in the present study. The groups of detected volatiles were aliphatic and alicyclic hydrocarbons (26), aldehydes (10), ketones (10), aromatic hydrocarbons (20), furans (6), alcohols (12), esters (3) and acids (5). Discriminante analysis of the volatile data was also applied to predict bakery cream origin. The function obtained was able to correctly classify all the samples according to type and origin of bakery cream. Additionally, the sensory descriptive profile of the different types of bakery creams was elaborated. Different sensory descriptive profiles were obtained for bakery creams of different origin.
Publicações e comunicações:
Da realização deste trabalho resultaram as seguintes publicações e comunicações:
• Bárbara Ramos, Olívia Pinho, I.M.P.L.V.O. Ferreira. Influence of egg yolk and aromatizing compounds on the volatile profile and on sensory characteristics of bakery cream. European Food Research and Technology (submetido).
• Bárbara Ramos, Olívia Pinho, I.M.P.L.V.O. Ferreira. Effect of storage conditions during hen eggs shelf-life on the contents of yolk biogenic amines (em elaboração).
• Sofia Silva, Francisca Menezes, Bárbara Ramos, Olívia Pinho, I.M.P.L.V.O. Ferreira. Segurança, qualidade e genuinidade de cremes de ovos. Posters apresentado na Sessão Pública de divulgação dos resultados dos Projectos de Investigação na Pré-graduação da Universidade do Porto, 20 de Setembro de 2006, Reitoria da UP.
• Bárbara Ramos, Olívia Pinho, I.M.P.L.V.O. Ferreira. Influence of egg yolk and aromatizing compounds on the volatile profile and on sensory characteristics of bakery cream. Poster apresentado no I Encontro de Jovens Investigadores da Universidade do Porto, Porto, 20 - 22 Fevereiro de 2008.
• Bárbara Ramos, Olívia Pinho, I.M.P.L.V.O. Ferreira. Sensory characteristics and volatile profile on of bakery cream containing egg yolk / aromatizing compounds. Comunicação aceite para apresentar na forma de poster no Third European Conference on Sensory and Consumer Research: A Sense of Innovation. University of Applied Sciences, Hamburg, Germany • 7-10 September 2008.
ABREVIATURAS
ADC – Arginina descarboxilase
AOAC – American Official of Analytical Chemists
AdoMetDC – S-adenosimetionina descarboxilase
CAR – Carboxen
CE – Electroforese capilar
CP – creme de pasteleiro
CPs – Cremes de pasteleiro das pastelarias
CP1 – creme de pasteleiro proveniente das bolas de Berlim da pastelaria 1
CP2 – creme de pasteleiro proveniente das bolas de Berlim da pastelaria 2
CP3 – creme de pasteleiro proveniente das bolas de Berlim da pastelaria 3
CP4 – creme de pasteleiro proveniente das bolas de Berlim da pastelaria 4
CPO – Creme de pasteleiro com ovo
CPO1 – Creme de pasteleiro com ovos 1
CPO2 – Creme de pasteleiro com ovos 2
GC – Cromatografia Gasosa
ELISA – Enzyme Linked Immuno Sorbente Assay
ELSD - Evaporative light scattering detector
FID – Detector por ionização em chama
HDL – Lipoproteinas com elevada densidade
HPLC – Cromatografia Líquida de alta eficiência
HS - “headspace”
IgY – Imunoglobulina Y
LDL – Lipoproteinas com baixa densidade
MAO – Monoamino-oxidase
MS – Espectrometria de massa
NAG – N-acetilglucosamina
NAM – Ácido N-acetilmurâmico
ODC – Ornitina descarboxilase
OPA – Oftaldeído
OTAP-92 – Péptido antimicrobiano da ovotransferrina que consiste num fragmento catiónico de 92 amino ácidos
OTf – Ovotransferrina
RP – Fase Reversa (Reverse Phase)
RT – Tempo de Retenção (Retention Time)
SB – Substituto do ovo
SDE – Destilação e extracção simultâneas
SPME – Micro-extracção em fase sólida (Solid Phase Microextraction)
S-ovalbumina – ovalbumina estável
TCA – Ácido Tricloroacético
TEA – Trietilamina
TLC – Cromatografia de camada fina
UV – Ultra violeta
INTRODUÇÃO
O ovo é uma célula reprodutiva complexa onde ocorre o desenvolvimento extra-uterino do embrião, utilizando a reserva natural dos componentes do ovo. O seu papel original como uma câmara embrionária permite supor que contém inúmeros compostos essenciais para a vida. Existem várias fontes de ovos, mas os únicos com interesse comercial são os ovos de galinha, assim todas as menções a “ovos” referem-se à espécie Gallus domesticus.
O ovo é usado como padrão de qualidade nutricional para outros alimentos (Sakanaka et al., 2000; Campbell et al., 2005). Na verdade, o ovo constitui uma óptima fonte de nutrientes para o Homem (Gautron et al., 2007), para além de ser uma importante fonte de proteínas, lípidos, vitaminas e sais minerais, o ovo contém várias moléculas que promovem a saúde e com propriedades biotecnológicas (Belitz & Grosh, 1987, Anton et al., 2006, Gautron et al., 2007). É uma fonte importante de moléculas activas para a indústria farmacêutica, cosmética e alimentar. Contém moléculas com actividade antimicrobiana, antiviral, anti-aderentes, antihipertensivas, antineoplásticos, antioxidantes, antigénicas, crioprotectivas e imunomodeladoras (Anton et al., 2006). Além disso, possui ainda moléculas com funções fisiológicas importantes que são essenciais no desenvolvimento do embrião da galinha e também no desenvolvimento embrionário de inúmeras espécies, como as aminas biogénicas, particularmente as poliaminas e diaminas (Pegg & McCann, 1982).
A composição do ovo varia com a idade, estirpe e linhagem das galinhas, variações individuais entre galinhas, dieta, temperatura do ambiente, condições e tempo de armazenamento (Turnbull, 1998). O período para o consumo de ovos frescos tem sido definido como cerca de três semanas, no entanto, o período de tempo de armazenamento em temperatura ambiente e sob refrigeração são motivos de debate permanente (Cepero et al., 1995).
Na literatura existem diversos estudos sobre as modificações que ocorrem durante o armazenamento dos ovos, focando principalmente a difusão de CO2 através dos poros da casca, o aumento do pH, da câmara de ar e do peso da gema e a diminuição da densidade, do peso do ovo e do peso do albúmen (Silversides & Villeneuve, 1994, Silversides & Scott, 2001, Silversides & Budgell, 2004, Jones, 2007).
O ovo inteiro ou os seus constituintes (clara e gema) representam um ingrediente essencial em muitos produtos alimentares, pois combinam propriedades nutricionais, organolépticas e funcionais (Martinet et al., 2003, Guérin-Dubiard et al., 2005). A gema de ovo crua tem um odor suave, contudo com o aquecimento desenvolve um aroma agradável característico. Os compostos aromatizantes responsáveis pelo seu aroma característico provêm da oxidação lipídica e das reacções de Maillard, visto a gema possuir proteínas e lípidos em elevadas quantidades. Deste modo, é muito utilizada em produtos alimentares processados, nomeadamente produtos de pastelaria.
1- Características do Ovo
1.1- Estrutura e Composição do Ovo
O ovo é uma célula reprodutiva complexa e altamente diferenciada. A estrutura do ovo é apresentada na Fig.1, começando do exterior para o interior, os principais elementos do ovo são: a casca; as membranas da casca (interna e externa); clara ou albúmen, e a gema ou vitelo (Laghi et al., 2005). O peso médio de um ovo é 60g. A casca representa cerca de 9,5% do peso do ovo, enquanto que a clara representa 61,5% do seu peso total e a gema representa 29% do ovo inteiro (Belitz & Grosh, 1987, Kovacs-Nolan, 2005).
[pic]
Figura 1. Estrutura seccional do ovo de galinha (Laghi et al., 2005).
1.1.1 Casca
A casca consiste em cristais de carbonato de cálcio embebidos numa matriz orgânica de fibras proteicas e complexos proteínas-mucopolissacarideos numa proporção de 50:1 (Belitz & Grosh, 1987).
A superfície da casca está envolvida pela cutícula que numa porção esponjosa proteica (Figura 2). Numerosos micro-poros em forma de funil (7,000-17,000 por ovo) estendem-se pela casca, formando passagens entre a membrana da casca e a cutícula. A cutícula proteica sela parcialmente os poros, mas mantém-se permeável aos gases enquanto restringe a penetração de microrganismos (Fennema, 1976, Belitz & Grosh, 1987, Larrañaga et al., 1999).
[pic]
Figura 2. Esquema da secção radial da casca de ovo (Larrañaga et al., 1999)
Existem duas membranas com a espessura de 48 µm e 22 µm entre a superfície interna da casca e o albúmen. Uma membrana mais espessa (externa) denominada esponjosa, próxima à casca; e outra mais fina (interna) designada região mamilar (ver Figura 2). Ambas as membranas são compostas por fibras proteicas do tipo queratina e por polissacarídeos (Fennema, 1976).
A membrana externa da casca está firmemente ligada à casca através de numerosos cones na superfície da membrana interna da casca e por associações de fibras. Possui seis camadas de fibras orientadas alternadamente em direcções opostas, enquanto que a membrana interna tem três camadas de fibras paralelas à casca e com ângulos rectos entre elas (Fennema, 1976). A sua estrutura confere-lhes resistência e assim contribui para impermeabilizar o conteúdo do ovo, dos microrganismos (Larrañaga et al., 1999).
1.1.2. Clara
A clara é constituída por quatro fracções, que diferem na sua viscosidade: a fracção externa, estreita e fluida; a fracção intermédia, espessa e densa, designada por saco de albumina; a zona interna fluida e fina e a zona calazifera (Belitz & Grosh, 1987, Macrae et al., 1993, Larrañaga et al., 1999).
A porção interior do ovo, a gema ou vitelo, é rodeada pelo albúmen. Uma camada estreita mas resistente do albúmen (camada calazifera) rodeia estreitamente a gema e ramifica-se em duas calazas em sítios opostos da gema, que se estendem ao albúmen espesso. A calaza é uma espécie de cordão, constituído por fibras de mucina, que liga a gema à casca, permitindo-lhe oscilar dentro de um limite de segurança, e mantendo-a numa posição central ao ovo (Regestein & Regestein, 1984, Belitz & Grosh, 1987, Larrañaga et al., 1999).
A clara protege a gema dos choques e variações de temperatura. É constituída sobretudo por água e proteínas, com escassos minerais, o que é invulgar num produto de origem animal (as proteínas constituem cerca de 90% da matéria seca). Possui glucose livre (no dobro da concentração presente no plasma sanguíneo), que constitui a fonte primária de energia disponível para o embrião (Linden & Lorient, 1999). O albúmen é o conjunto de proteínas presentes na clara.
A clara é uma fonte natural de proteínas com interesse nutricional, biológico e tecnológico. As proteínas da clara do ovo são extensivamente usadas no processamento alimentar pelas suas propriedades funcionais excepcionais (gelificante e espumante), assim estas proteínas são desejadas em muitos alimentos como os produtos de pastelaria, produtos de carne, bolachas e molhos (Vachier et al., 1995). O conhecimento das suas características físico-químicas favorece a elucidação das suas funções e relações em benefício da indústria alimentar. A Tabela 1 lista as proteínas do albúmen, de acordo com a sua abundância na clara do ovo, e algumas propriedades físico-químicas destas (Linden & Lorient, 1999).
O albúmen contém cerca de 0.02% de lípidos e 1% de hidratos de carbono (metade destes na forma livre e a restante parte ligada a proteínas) (Macrae et al., 1993, Ternes, 2003).
Tabela 1. Características físico-químicas das proteínas presentes na clara de ovo (Linden & Lorient, 1999)
|Proteínas |Matéria seca|Massa molecular |Ponto |Temperatura de |Características |
| |(%) |(Da) |Isoeléctrico |Desnaturação (ºC) | |
|Conalbumina |12 |76 000 |6,5 |61 |Combina-se com metais, |
|(ovotransferrina) | | | | |inibidor bacteriano |
|Ovomucoide |11 |28 000 |4,0 |70 |Inibe a tripsina |
|Ovoglobulinas |4 + 4 |36 000 - 45 000 |5,6 |92 |Propriedades espumantes |
|Lisozima |3.5 |14 300 |10,5 |75 |Lise bacteriana |
|Ovomucina |3 |5,5-8.3x106 |4,5-5,0 | |Factor de viscosidade |
|Ovoinibidor |1.5 |49 000 |5,1 | |Inibição da serina |
| | | | | |proteases |
|Ovoglicoproteína |1.0 |24 400 |3,9 | |Factor de viscosidade |
|Flavoproteína |0.8 |34 000 |4,0 | |Ligação á vitamina B2 |
|Ovomacroglobulina |0.5 |7,7x105 |4,5 | |Alta capacidade |
| | | | | |antigénica |
|Inibidor Ficina |0.05 |12 700 |5,1 | |Inibição SH proteases |
|Avidina |0.05 |68 300 |10 | |Complexação da biotina |
1.1.3. Gema
No centro da gema encontra-se o latebra, que mantém o disco germinal ou cicatrícula à superfície da gema, local onde ocorrem as divisões celulares e se forma o embrião. O material da gema está disposto em anéis concêntricos que variam de cor conforme o regime alimentar e os pigmentos lipossolúveis presentes na alimentação da galinha. A gema é rodeada por uma membrana semipermeável, a membrana vitelina, que tem cerca de 0,025 mm (Regestein & Regestein, 1984, Macrae et al., 1993).
A gema apresenta-se como uma dispersão de partículas de diferentes tamanhos numa fase aquosa contínua ou plasma. Estas partículas podem ser classificadas em dois grupos:
• Gotículas de gema de tamanho altamente variável, com um diâmetro oscilante entre 20-150 µm. Assemelham-se a gotas de gordura, resumem-se sobretudo a lípidos, e algumas possuem membranas proteicas. É uma mistura de lipoproteinas com baixa densidade (LDL);
• Grânulos que têm um diâmetro de 0,3-1,6 µm, possuem um tamanho inferior e são mais uniformes no tamanho, mas menos uniformes na forma que as gotículas de gema. Albergam uma subestrutura e consistem em proteínas mas também contêm lípidos e minerais (Fenema, 1976).
As lipoproteínas são as principais responsáveis pelas propriedades emulsionantes da gema. Estas podem ser fraccionadas por centrifugação, resultando um sedimento, designado grânulos e uma fracção sobrenadante, designada plasma (Denmat et al., 2000, Garti, 2002). As proteínas presentes na gema estão resumidas na Tabela 2.
Tabela 2. Composição em proteínas da gema de ovo (Linden & Lorient, 1999)
| |Matéria Seca (%) |
|Carotenos | |
|-carotenos |Vestígios |
|-carotenos |0,03 |
|Xantofilas | |
| criptoxantina |0,03 |
| luteína |0,1 |
| zeaxantina |0,2 |
Os carotenóides fazem parte do sistema antioxidante do embrião, e são obtidos directamente da gema e derivam da dieta da galinha poedeira (Karadas et al., 2005). A composição e conteúdo em carotenóides na gema varia com a dieta da galinha poedeira (Surai & Speake, 1998, Na et al., 2004).
1.2- Valor Nutricional
O ovo é um alimento muito nutritivo, constitui uma fonte de proteínas equilibradas e de lípidos facilmente digestíveis (Tabela 4).
Tabela 4. Composição nutricional do ovo bruto inteiro (por 100g) (Macrae et al., 1993)
| |Ovo inteiro |Clara |Gema |
|Água (g) |72,8 – 75,6 |87,9 – 89,4 |45,8 – 51,2 |
|Energia | | | |
|(kJ) |612 |153 |1402 |
|(kcal) |147 |36 |339 |
|Proteínas (g) |12,8 – 13,4 |9,7 – 10,6 |15,7 – 16,6 |
|Gordura (g) |10,5 – 11,8 |0,03 |31,8 – 35,5 |
|Hidratos de Carbono (g) |0,3 – 1,0 |0,4 – 0,9 |0,2 -1,0 |
|Cinzas (%) |0,8-1,0 |0,5-0,6 |1,1 |
As proteínas do ovo são consideradas proteínas ideais – modelo para outras proteínas – pois possuem todos os amino ácidos essenciais nas proporções adequadas para a nutrição humana, como se pode observar na Tabela 5 (Turnbull, 1998, Meister et al., 2002, Stadelman, 2003).
Tabela 5. Composição em amino ácidos do ovo comestível (por 100g) (Turnbull, 1998, Stadelman, 2003)
|Amino ácidos (g) |Inteiro |Clara |Gema |
| | | |Pura |Comercial |
|Alanina |0,696 |0,608 |0,861 |0,818 |
|Arginina |0,750 |0,572 |1,000 |0,904 |
|Àcido aspártico |1,256 |1,072 |1,630 |1,559 |
|Cisteína |0,290 |0,272 |0,301 |0,301 |
|Ácido glutâmico |1,632 |1,400 |2,126 |2,005 |
|Glicina |0,420 |0,368 |0,518 |0,497 |
|Histidina |0,296 |0,237 |0,434 |0,402 |
|Isoleucina |0,682 |0,596 |0,849 |0,790 |
|Leucina |1,068 |0,886 |1,470 |1,364 |
|Lisina | 0,770ª | 0,520ª | 1,160ª |- |
|Metionina |0,390 |0,362 |0,416 |0,416 |
|Fenilanina |0,664 |0,614 |0,717 |0,696 |
|Prolina |0,498 |0,410 |0,699 |0,645 |
|Serina |0,930 |0,725 |1,432 |1,307 |
|Treonina |0,600 |0,479 |0,892 |0,819 |
|Triptofano |0,152 |0,129 |0,199 |0,191 |
|Tirosina |0,510 |0,410 |0,747 |0,686 |
|Valina |0,762 |0,671 |0,934 |0,885 |
Os lípidos da gema são altamente digestíveis para os humanos (entre 94 a 96%) devido ao seu estado de emulsão. Praticamente todos os lípidos da gema estão presentes como lipoproteínas. Da gordura total do ovo cerca de metade está na forma insaturada.
Os ovos são ricos em colesterol (Turnbull, 1998). De acordo com a Tabela 6, um ovo grande com uma gema de 17g terá cerca de 218 mg de colesterol (Stadelman, 2003). Está estabelecido que indivíduos com uma dieta equilibrada podem ingerir até um ovo por dia sem aumentar significativamente o seu colesterol plasmático (Turnbull, 1998).
O conteúdo em gordura, ácidos gordos e colesterol de um ovo relaciona-se com a dieta das galinhas e em alguns países é possível comprar ovos com o conteúdo em ácidos gordos e colesterol manipulado (Turnbull, 1998).
Tabela 6. Componentes lipídicos do ovo comestível (por 100g) (Stadelman, 2003)
|Ácidos gordos (g) |Inteiro |Gema |
| | |Pura |Comercial |
|Saturados (totais) |3,100 |9,554 |7,663 |
| 8:0 |0,004 |0,012 |0,010 |
|10:0 |0,004 |0,012 |0,010 |
|12:0 |0,004 |0,012 |0,010 |
|14:0 |0,034 |0,102 |0,077 |
|16:0 |2,226 |6,861 |5,524 |
|18:0 |0,784 |2,416 |1,915 |
|20:0 |0,004 |0,012 |0,010 |
|Monoinsaturados (totais) |3,810 |11,741 |9,444 |
|14:1 |0,010 |0,030 |0,030 |
|16:1 |0,298 |0,916 |0,717 |
|18:1 |3,472 |10,699 |8,623 |
|20:1 |0,028 |0,084 |0,067 |
|22:1 |0,004 |0,012 |0,010 |
|Polinsaturados (totais) |1,364 |4,205 |3,374 |
|18:2 |1,148 |3,356 |2,842 |
|18:3 |0,034 |0,102 |0,077 |
|20:4 |0,142 |0,440 |0,352 |
|20:5 |0,004 |0,012 |0,010 |
|22:6 |0,036 |0,114 |0,092 |
|Colesterol (mg) |426,0 |1.283,0 |1.038 |
|Lecitina (g) |2,30 |6,687 |5,396 |
|Cefalina (g) |0,46 |1,319 |1,068 |
O ovo é um alimento rico em vitaminas, com excepção do ácido ascórbico (vitamina C). É uma boa fonte de vitamina D (calciferol), vitamina B2 (riboflavina) e vitamina A (retinol) e E. As vitaminas presentes no ovo variam com a alimentação da galinha poedeira (Stadelman, 2003).
As vitaminas lipossolúveis, A, D e E, existem apenas na gema enquanto as vitaminas hidrossolúveis encontram-se no albúmen e na gema (Turnbull, 1998). Os valores médios das vitaminas do ovo encontram-se na Tabela 7.
Tabela 7. Vitaminas presentes no ovo comestível (por 100g) (Stadelman, 2003)
|Vitamina (unidade) |Inteiro |Clara |Gema |
| | | |Pura |Comercial |
|A (IU) |634,0 | |1946,0 |1580,0 |
|D (IU) |49,0 | |147,6 |118,3 |
|E (mg) |1,40 | |4,217 |3,390 |
|B12 (µg) |1,00 |0,210 |3,132 |2,512 |
|Biotina (µg) |19,96 |7,006 |45,662 |37,943 |
|Colina (mg) |430,12 |1,257 |1301,00 |1050,09 |
|Ácido fólico (µg) |46,0 |2,994 |144,58 |120,17 |
|Inositol (mg) |10,78 |4,132 |23,795 |19,891 |
|Ácido nicotínico (mg) |0,074 |0,093 |0,012 |0,013 |
|Ácido pantoténico (mg) |1,254 |0,120 |3,807 |3,899 |
|Piridoxina (mg) |0,140 |0,003 |0,392 |0,320 |
|Riboflavina (mg) |0,508 |0,452 |0,639 |0,595 |
|Tiamina (mg) |0,062 |0,006 |0,169 |0,133 |
Os ovos são uma excelente fonte da maioria dos minerais, com excepção do cálcio (Turnbull, 1998). O ferro presente na gema é altamente biodisponível e pode ser um factor importante para indivíduos carentes em ferro, especialmente as crianças.
A quantidade exacta de minerais do ovo depende do teor em minerais da dieta da galinha. A “estirpe” da galinha influencia a concentração em iodo e a idade influencia o conteúdo em fósforo e cloro do ovo. A altura do ano tem um efeito significativo no conteúdo em sódio, cálcio e cloro do ovo (Stadelman, 2003).
A composição em minerais do ovo é apresentada na Tabela 8, a casca não é considerada pois não é um item comum na dieta humana.
Tabela 8. Composição em minerais do ovo comestível (por 100g) (Stadelman, 2003)
|Mineral (mg) |Inteiro |Clara |Gema |
| | | |Pura |Comercial |
|Cálcio |50,0 |5,998 |138,552 |113,276 |
|Cloro |174,2 |179,64 |163,250 |163,250 |
|Cobre |0,014 |0,006 |0,024 |0,020 |
|Ferro |1,440 |0,030 |3,554 |2,861 |
|Fósforo |178,0 |11,976 |487,944 |395,080 |
|Iodo |0,048 |0,003 |0,133 |0,108 |
|Magnésio |10,0 |11,976 |6,024 |5,837 |
|Manganês |0,024 |0,003 |0,072 |0,059 |
|Potássio |120,0 |143,7 |96,384 |106,022 |
|Sódio |126,0 |164,7 |42,168 |60,008 |
|Sulforoso |164,0 |167,7 |150,600 |150,600 |
|Zinco |1,10 |0,0 |3,132 |2,536 |
O ovo é uma das fontes nutricionais mais importantes de colina, o corpo humano produz a sua própria colina, mas pode não ser suficiente para suportar as suas necessidades. A colina também possui prováveis benefícios para a função cognitiva. Assim torna-se necessária uma fonte alimentar (Meister et al., 2002).
O ovo fornece uma porção relativamente elevada de nutrientes para indivíduos de todas as faixas etárias, particularmente durante o crescimento, e pode contribuir significativamente para as necessidades diárias individuais em nutrientes essenciais, enquanto fornece uma baixa proporção de calorias. Um ovo de 60g fornece cerca de 367 kJ (90 kcal) (Turnbull, 1998).
1.3 Proteínas com função antimicrobiana
Em contraste com o sistema imunitário dos animais, que produzem polipéptidos antimicrobianos quando necessitam, o ovo resiste eficientemente aos microrganismos, durante longos períodos, na ausência deste sistema de defesa do hospedeiro inato e sistemático.
Aparentemente, o papel principal da clara é manter os microrganismos afastados da gema, o reservatório dos nutrientes do ovo (Ibrahim, 2000, Naidu, 2000). O albúmen é um meio desfavorável para o crescimento de microrganismos devido: (i) ao elevado pH, alcançando o valor de 9,5 3 a 4 dias após a postura; (ii) ao baixo conteúdo em componentes azotados; (iii) à indisponibilidade de duas vitaminas, a biotina e a riboflavina, através da sua combinação com componentes proteicos; e (iv) à quelatação ávida dos iões férricos (Fe3+) pela ovotransferrina (Tranter, 1994).
A maioria das proteínas presentes no albúmen do ovo, possui propriedades antimicrobianas ou outra função biológica interferente com o crescimento e disseminação de microrganismos invasores (Ibrahim, 2000, Naidu, 2000). Para fazer face à enorme diversidade microbiana existente na natureza, estas proteínas necessitam de possuir funções múltiplas (Naidu, 2000). Estas propriedades são essenciais no desenvolvimento do embrião (Silphaduang et al., 2006).
1.3.1 Lisozima
A lisozima é definida como 1,4-β-N-acetilmuramidase. Esta enzima catalisa a hidrólise da ligação glicosídica entre C1 do ácido N-acetilmurâmico (NAM) e o C4 do N-acetilglucosamina (NAG) do peptidoglicano bacteriano (Tranter, 1994, Davis & Reeves, 2002). Esta enzima da clara do ovo demonstra actividade antimicrobiana sobre um espectro limitado de bactérias e fungos (Davis & Reeves, 2002)
A actividade antimicrobiana da lisozima é superior para certas bactérias Gram +, enquanto as bactérias Gram - são menos susceptíveis à acção bacterolítica desta enzima (Tranter, 1994, Davis & Reeves, 2002). Esta diferença de susceptibilidade pode ser explicada pela estrutura em envelope complexa das bactérias Gram -, como a E.coli ou a Salmonella typhimurian, a membrana externa reduz o acesso da lisozima ao seu local activo (Davis & Reeves, 2002).
As paredes celulares do Micrococcus lysodeikticus são as mais sensíveis enquanto que as paredes do Staphilococci são as mais resistentes à acção bactericida desta proteína (Davis & Reeves, 2002). A diferença de sensibilidade à lisozima demonstrada pelas bactérias Gram + pode ser explicada pela presença de proporções superiores de ligações 1,6 ou 1,3 entre NAM e NAG do peptidoglicano, que são mais resistentes à acção da lisozima que as ligações 1,4 (Tranter, 1994).
Entre as bactérias Gram-, Salmonella e Shigella são as mais sensíveis à acção da lisozima, por outro lado as bactérias: E.coli, Vibrio e Proteus são as menos sensíveis a esta enzima (Davis & Reeves, 2002).
A desnaturação térmica da lisozima resulta na perda progressiva da actividade enzimática, mas também no incremento da acção antimicrobiana sobre as bactérias Gram -. A lisozima possui uma acção antibacteriana independente da sua actividade muramidase, esta função deve-se a péptidos bactericidas derivados da proteína, que possuem uma actividade microbicida espantosa e um largo espectro de acção (Abdou et al., 2005). Assim, a actividade antimicrobiana da lisozima deve-se a factores estruturais (Davis & Reeves, 2002).
1.3.2 Ovotransferrina
A ovotransferrina também designada como conalbumina é o componente principal da defesa antimicrobiana do ovo (Tranter, 1994, Ibrahim, 2000).
É a principal proteína de ligação do ferro do ovo. O ferro é um elemento essencial para virtualmente todas as bactérias, pois é necessário para um número elevado de reacções enzimáticas, como grupo prostético ou como co-factor. Várias proteínas e leveduras não crescem em meio nutritivo contendo ovotransferrina (OTf), devido ao sequestro do ferro disponível (Tranter, 1994).
A ovotransferrina age como um agente bactericida e a sua actividade antimicrobiana pode ser desacoplada das suas propriedades de sequestração do ferro, além disso possui um efeito bacteriostáctico (imunidade nutricional) (Naidu, 2000).
A actividade bactericida tem sido atribuída à presença de um péptido (OTAP-92), que é libertado pela quebra específica na sequência Asp-X, reconhecida como o domínio bactericida da molécula OTf (Ibrahim, 2000, Naidu, 2000, Davis & Reeves, 2002).
O péptido antimicrobiano da ovotransferrina (OTAP-92) é um fragmento catiónico de 92 amino ácidos, localizado entre a sequência 109-200 do domínio N da proteína. Demonstra actividade bactericida sobre as bactérias: S.aureus (Gram +) e estirpes de E.coli (Gram -) (Ibrahim, 2000, Davis & Reeves, 2002). Este péptido catiónico é capaz de eliminar bactérias Gram -, ao atravessar a membrana externa, promover uma via ascendente e danificar a membrana citoplasmática através da formação de um canal (Davis & Reeves, 2002).
1.3.3 Ovoglobulina IgY
Este sistema facilita a transferência de anticorpos específicos do soro da galinha para a gema de ovo e providencia uma fonte de anticorpos (IgY) ao embrião em desenvolvimento.
A gema de ovo pode ser “armada” com uma elevada quantidade de IgY, que podem imobilizar os patogénicos existentes ou em invasão, durante o desenvolvimento do embrião. Assim, a imunização das galinhas poedeiras a vários patogénicos resulta na produção de diferentes antigénios IgY específicos nos ovos. A gema contém 8-20 mg de IgY por ml ou 136-340 mg por gema (Naidu, 2000, Sim et al., 2000).
1.3.4 Avidina
A avidina é uma proteína que se liga até quatro moléculas de biotina com uma afinidade excepcional. É vista como um antibiótico presente na clara de ovo, inibindo o crescimento bacteriano como uma proteína reparadora, na reprodução ou como uma enzima lítica (Mine, 2000).
A avidina inibe o crescimento in vitro de bactérias e leveduras com necessidade de biotina. A sua actividade antimicrobiana pode advir da sua capacidade de ligação a várias bactéria Gram - (E.coli, K. pneumoniae, S. marecescens, P. aeruginosa) e Gram positivas (S. aureus e S. epidermidis). Esta pode agir como um sistema de defesa do hospedeiro com propriedades antimicrobianas e de inibição enzimática (Mine, 2000, Naidu, 2000).
Contudo é necessário mais informação acerca da estrutura tridimensional da avidina para uma compreensão superior do seu papel biológico e da sua função como agente antimicrobiano (Mine, 2000, Naidu, 2000).
1.4 Proteínas Antiaderentes
Vários estudos demonstram a actividade antimicrobiana da gema de ovo, especificamente atribuída à fracção IgY. Contudo, estudos recentes demonstraram a importância e a actividade antiaderente sobre patogénicos, de outros compostos que não o IgY. Este estudo revelou os grânulos da gema, principalmente as lipoproteínas HDL como os componentes efectivos de protecção contra a colonização e infecção observada por patogénicos entéricos (S. enteritidis, S. typhimurium, E.coli O157:H7) (Kassaify et al., 2005).
A actividade protectora associada à HDL mantém-se intacta após digestão enzimática e possui um efeito antiaderente e não antimicrobiano. O seu efeito anti-infecções ocorre dos seus efeitos negativos directos sobre o metabolismo bacteriano e a modificações nos receptores das células epiteliais necessárias para a adesão e invasão bacteriana (Kassaify et al., 2005).
1.5 Aminas biogénicas – Diaminas e Poliaminas
As poliaminas regulam o crescimento e diferenciação celular nos eucariotas e procariotas. São componentes indispensáveis de todos os organismos vivos, importantes no crescimento, renovação e metabolismo (Sjöholm, 1993, Ha et al., 1998, Medina et al., 2004, Karovičová & Kohajdová, 2005, Soulet & Rivest, 2007). Os estudos respeitantes à composição em aminas são escassos e em geral poucas amostras foram analisadas em cada caso (Tabela 9).
Tabela 9. Composição de aminas e poliaminas em ovos
|Amostra |Aminas identificadas |Concentração |Autor |
|Ovo cozido |Putrescina |0,26 - 0,35 mg/kg |Bardócz et al. 1995 |
| |Espermidina |0 - 0,14 mg/kg | |
| |Espermina |0,20 - 0,60 mg/kg | |
|Ovos crus e cozidos |Putrescina |0.4 mg/kg |Okamoto et al., 1997 |
| |Cadaverina |0,5 mg/kg | |
| |Histamina |0,5 mg/kg | |
| |Espermidina |1,4 mg/kg | |
|Gema de ovo |Putrescina |10 nmol/g |Nishimura et al., 2006 |
| |Espermidina |4 nmol/g | |
| |Cadaverina |261 nmol/g | |
|Ovo |Putrescina |5 µg/100 g |Larqué et al., 2007 |
| |Espermidina |10 µg/100 g | |
| |Espermina |5 µg/100 g | |
Bardócz et al. (1995) reportam teores de 0,26 a 0,35, 0 a 0,14 e 0,20 a 0,60 mg/kg de putrescina, espermidina, espermina, respectivamente, em ovos cozidos. Okamoto e os seus colegas relatam baixas concentrações de poliaminas nos ovos crus e cozidos. Os teores máximos de aminas encontrados foram 0.4 mg/kg de putrescina, 0,5 mg/kg de cadaverina, 0,5 mg/kg de histamina e 1,4 mg/kg de espermidina (Okamoto et al., 1997, Kalač et al., 2005).
Recentemente, Nishimura e os seus colaboradores analisaram gemas de ovo e referiram a presença de putrescina, espermidina e cadaverina com os seguintes teores, 10, 4 e 261 nmol/g, respectivamente (Nishimura et al., 2006). Outros investigadores identificaram as poliaminas, putrescina, espermidina e espermina nas seguintes concentrações 5, 10 e 5 µg/100 g de ovo (Larqué et al., 2007).
2- Modificações na composição do Ovo durante o armazenamento
2.1 Conservação
O período para o consumo de ovos frescos tem sido definido como três semanas, no entanto, o período de tempo e temperatura máximos de armazenamento para ovos em temperatura ambiente e sob refrigeração são motivos de debate permanente (Cepero et al., 1995).
O congelamento do ovo inteiro líquido é um método comum de preservação. A pasteurização anterior ao congelamento provoca uma modificação no comportamento de difusão durante o armazenamento. A viscosidade aparente aumenta com a pasteurização e com o armazenamento em gelo (Szczesniak, 1998).
O uso de atmosferas controladas (ar ou azoto com 45% de CO2) é uma forma eficaz para preservar os ovos. O armazenamento refrigerado preserva os ovos durante 6-9 meses, sendo que o prazo de prateleira aumenta quando são armazenados a -1,5 ºC. A perda de peso do ovo durante o armazenamento varia entre 3,0-6,5 % (Belitz & Grosh, 1987). Outra alternativa é a redução da porosidade da casca embebendo-a em óleo, ou aquecimento breve em água de forma a coagular a camada proteica da casca, ou o uso de embalagens impermeáveis (Linden & Lorient, 1999).
2.2 Contaminação
O conteúdo do ovo de galinha pode ser contaminado, prévia (transmissão horizontal) ou posteriormente à postura (transmissão vertical). No último caso, a clara é contaminada quando a cutícula, a casca e as membranas da casca falham na prevenção da invasão microbiana. Na clara os microrganismos encontram outros obstáculos, resultantes das proteínas antimicrobianas existentes, do pH alcalino e da temperatura (Messens et al., 2004).
Após lavagem da casca com A – Extran e B – Tergitol
Figura 3. Micromapeamento electrónico de sondagem da casca de ovo. a) Cutícula com uma superfície homogénea, a1) superfície da cutícula corroída, a2) secção radial da casca mostrando a cutícula; b) superfície externa da casca; b1) superfície externa da casca com irregularidades, b2) superfície externa com aspecto granular; c) superfície interna com estrias e poros normais, c1) superfície interna com pequenas fissuras, c2) superfície interna com fissuras e poros (Favier et al., 2000).
A casca dos ovos pode ser um veículo de microrganismos patogénicos para o Homem, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Listeria monocytogenes e a Yersinia enterocolítica são alguns microrganismos encontrados na casca. A casca pode ser contaminada, com matéria fecal no local de postura, com a água de lavagem, durante a manipulação e durante o armazenamento (Favier et al., 2000).
Um dos processos utilizados para diminuir a contaminação dos ovos é a lavagem da casca. Contudo o efeito dos agentes físicos e químicos usados durante a lavagem constitui um ponto essencial na redução ou eliminação do risco de contaminação da casca. Alguns destes produtos podem alterar a cutícula, fina e delicada, da casca e permitir a re-contaminação futura do ovo. Num estudo realizado por Favier et al., com os detergentes Extran e Tergitol, verificou-se a sua eficácia na eliminação de bactérias à superfície e também que estes detergentes provocam várias alterações na casca e afectam a estrutura da camada interna, Fig 3. Isto pode favorecer a penetração das bactérias após lavagem e produzir modificações bioquímicas no conteúdo do ovo (Favier et al., 2000).
2.2.1 Salmonella spp.
A Salmonella spp. é o principal contaminante do ovo, pode ser encontrada na casca de ovo e também pode estar presente dentro do ovo como resultado de transmissão transversal durante a sua formação. Números superiores de S. enteritidis são encontrados mais frequentemente na clara do que na gema (Smith et al., 2003). Os ovos ou os seus produtos são dos principais responsáveis pelos surtos alimentares causados por esta bactéria, por outro lado uma das origens mais frequentes de surtos alimentares é a presença desta bactéria e da sua enterotoxina.
A pasteurização destrói efectivamente a S. enteritidis enquanto mantém as suas propriedades funcionais, mas o uso contínuo de ovos em casca não pasteurizados em bolos domésticos aumenta o risco de contaminação dos produtos de pastelaria pela Salmonella spp. . Muitos produtos de pastelaria à base de ovo assentam num tratamento térmico mínimo para produzir um produto mais leve e macio. Estes produtos, especialmente quando são preparados com ovos não pasteurizados são causas frequentes de surtos (Radkowski, 2001, Smith et al., 2003). A pasteurização de ovos é critica no controlo de surtos de doenças alimentares causadas por Salmonella. Os ovos pasteurizados devem ser usados em produtos não ou ligeiramente cozinhados ou em produtos que requerem a associação ou conservação da casca do ovo. Deve-se ainda evitar o uso de ovos fendidos (Smith et al., 2003).
É necessário reduzir o risco para a saúde pública associado ao consumo de ovos infectados com S. enteritidis. A vacinação das galinhas pode ser uma forma efectiva de reduzir tal contaminação. De facto, Buck e os seus colaboradores demonstraram que a imunização de galinhas poedeiras com fímbrias do tipo1 reduz substancialmente o número de ovos contaminados e reduz a colonização do sistema reprodutivo da galinha (Buck et al., 2005).
2.3 Modificações ao longo do armazenamento
A frescura, a característica mais relacionada com a qualidade do ovo, declina após a postura dependendo do tempo e temperatura. Este declínio na qualidade é associado às modificações químicas, nutricionais, funcionais e higiénicas (Hidalgo et al., 2006).
Figura 4. Aspecto dos ovos frescos e dos ovos envelhecidos (baseado em Larrañaga et al., 1999).
Uma série de modificações ocorrem durante o armazenamento do ovo. A difusão de CO2 através dos poros da casca, que começa logo após a postura, provoca um aumento no pH, especialmente na clara do ovo. A evaporação de água gradual através da casca provoca a diminuição da densidade (inicialmente com o valor de 1,086; o coeficiente de redução diário é aproximadamente de 0,0017 g/cm3) e a câmara de ar alarga. Verifica-se igualmente aumento do peso da gema e diminuição da densidade, do peso do ovo e do peso do albúmen (Silversides & Villeneuve, 1994, Silversides & Scott, 2001, Silversides & Budgell, 2004, Jones, 2007).
Ocorre conversão da ovalbumina em S-ovalbumina e sucede a dissociação do complexo ovomucina-lisozima (com a destruição do gel de ovomucina), que resulta na diminuição da viscosidade da clara do ovo e na consequente redução das suas propriedades gelificantes e espumantes, ver Figura 4 (Davis & Reeves, 2002). A gema de ovo é compacta e vertical, mas achata durante o armazenamento, ver Figura 4. Além disso a membrana vitelina da gema torna-se rígida e quebra quando o ovo é aberto e desenvolve-se um aroma a “mofo” (Belitz & Grosh, 1987, Szczesniak, 1998).
Estas alterações são usadas para determinar a idade de um ovo, por exemplo o teste de flutuação (alteração da densidade do ovo), a iluminação (posição e forma da gema), o teste da viscosidade da clara, a medição da dimensão da câmara de ar, o índex refractivo e ensaios sensoriais para detectar o aroma a “mofo” (realizados com ovos levemente fervidos) (Belitz & Grosh, 1987, Hidalgo et al., 2006).
Recentemente, Hidalgo et al, propuseram um teste baseado na furosina [e-N-(2-furoilmetil-L-lisina) ] para avaliar a frescura dos ovos em casca., no qual é detectada a furosina presente no albúmen. Este teste mostra elevada reprodutibilidade e baixa variabilidade natural em ovos frescos e é independente do peso do ovo, idade da galinha e da humidade relativa de armazenamento (Hidalgo et al, 2006).
A perda da qualidade dos ovos, assim como a perda de CO2 e de água durante o armazenamento, são menores para uma temperatura de armazenamento inferior. Assim o armazenamento refrigerado é importante para a preservação do ovo, as condições vulgarmente usadas são: temperatura entre os 0 a -1,5 ºC e humidade relativa de 85-90% (Belitz & Grosh, 1987).
O conteúdo do albúmen e o conteúdo total de proteínas pode variar significativamente com a idade da galinha. Os ovos armazenados, por grandes períodos, a 2ºC mostram uma redução significativa no conteúdo em treonina, este amino ácido pode ser também reduzido durante a cozedura do ovo (Turnbull, 1998). Os lípidos de um ovo fresco encontram-se todos na gema, no entanto, pode ocorrer migração para o albúmen em ovos não frescos (Stadelman et al., 2003).
A modificação de várias propriedades do ovo, como o comportamento e estabilidade da clara de ovo é um factor importante para o processamento do ovo (Belitz & Grosh, 1987).
3- Propriedades Funcionais do Ovo
Os ovos estão na base de um extraordinário número de usos, um facto enfatizado pela quantidade de produtos alimentares e não alimentares que contém ovos ou os seus produtos. A popularidade do ovo deve-se às suas características únicas e variadas.
Os ovos e os seus produtos são usados na indústria alimentar pelo seu valor nutricional, mas também devido às suas propriedades funcionais, nomeadamente, coagulante, emulsionante, aromatizante e corante, que os tornam indispensáveis em processos de produção (Linden & Lorient, 1999). As propriedades funcionais do ovo têm sido usadas por cozinheiros, chefes e pela indústria alimentar. A sua disponibilidade, assim como o seu preço têm sido factores importantes na sua aplicação.
Os ovoprodutos são amplamente utilizados na indústria alimentar, contudo apresentam alguns factores limitativos, ver Tabela 10. É de realçar que os produtos do ovo têm um custo elevado em relação a outros ligantes protéicos (proteínas de leite, sangue ou soja), mas as excelentes propriedades, espumante e coagulante da clara e emulsionante da gema justificam a sua aplicação (Souza-Soares & Siewerdt, 2005).
Tabela 10. Vantagens e limitações à utilização dos principais ovoprodutos (Linden & Lorient, 1999, Souza-Soares & Siewerdt, 2005)
|Tipo |Vantagens |Limitações |
| |Propriedades funcionais semelhantes aos ovos|Uso imediato sem permitir o conhecimento das|
|Ovoprodutos Líquidos |em casca; |análises microbiológicas. |
| |Grande flexibilidade de emprego; | |
| |Preparação de produtos com variação de | |
| |extracto seco, sal e açúcar. | |
| |Aumento da viscosidade e possibilidade de |Armazenamento a baixas temperaturas (- |
|Ovoprodutos congelados |retomar à normalidade através da adição de |20ºC), controlo do descongelamento; |
| |açúcar e/ou sal; |Pouca flexibilidade na utilização; |
| |Qualidade bacteriológica idêntica ao produto|Propriedades funcionais modificadas. |
| |fresco sem ser utilizado imediatamente após | |
| |o descongelamento. | |
| |Economia em gastos de transportes e de |Propriedades Funcionais diminuídas |
|Ovoprodutos em pó |armazenamento; |(particularmente a capacidade espumante e |
| |Conserva-se durante 1 ano a 20ºC; |colorante); |
| |Qualidade bacteriológica estável; |Diminuição do açúcar das claras para uma boa|
| |Aumento da viscosidade. |conservação. |
3.1 Coagulação ou floculação
A coagulação é uma mudança na estrutura das proteínas do ovo que resulta na sua perda de solubilidade e espessamento. Pode ser provocada por calor, meios mecânicos, sais, ácidos ou bases. O ovo move-se de um estado fluído para um estado sólido designado coágulo. A coagulação térmica acontece a partir dos 62 ºC para a clara e desde os 65 ºC no caso da gema (Mine, 1995, Kiosseoglou & Paraskevopoulou, 2005). A exposição a temperaturas superiores resulta em níveis superiores de floculação e em géis mais resistentes. Contudo a partir dos 90 ºC ou de tempos de aquecimento exagerados pode ocorrer diminuição da resistência do gel, contracção do gel e sinerese (Mine, 1995, Aguilera & Rademacher, 2004). As ovoalbumina e a conalbumina possuem boas propriedades gelificantes. Dentre as proteínas da clara, apenas a ovomucoide não coagula. As proteínas da gema estão igualmente sujeitas à termocoagulação, com excepção das livetinas e da fosvitina (Belitz & Grosh, 1987, Linden & Lorient, 1999).
O sal e o açúcar protegem contra a desnaturação térmica e permitem aumentar a temperatura de pasteurização em 6 e 3 ºC, respectivamente. Esta protecção ocorre devido à redução da água livre na fase solúvel. A modificação da estrutura da proteína ligada à água melhora a estabilidade da mistura e atrasa a desnaturação (Linden & Lorient, 1999).
O sucesso de muitos alimentos cozinhados depende da coagulação das proteínas do ovo. A clara e a gema do ovo podem ser utilizadas devido à sua capacidade de se ligarem em conjunto a alimentos.
3.2 Propriedades emulsionantes
A gema de ovo é uma dispersão de gotículas de óleo em água – uma emulsão. Todos os constituintes do ovo, lipoproteínas LDL e HDL, fosvitina e livetina possuem a capacidade de adsorver na interface óleo-aquosa (Anton et al., 2001).
A capacidade emulsionante é atribuída principalmente às lipoproteínas LDL e aos fosfolípidos (Linden & Lorient, 1999, Anton et al., 2001, Anton et al., 2003).
A viscosidade da gema do ovo confere boa estabilidade às emulsões, existe uma relação linear entre a estabilidade da emulsão e a raiz quadrada da viscosidade. A adição da clara à gema de ovo diminui a estabilidade das emulsões formadas e este efeito está ligado essencialmente a um decréscimo na viscosidade (Linden & Lorient, 1999).
A viscosidade da gema aumenta com a adição de cloreto de sódio, o que melhora a estabilidade das emulsões pois provoca uma importante diminuição da capacidade emulsionante dos constituintes da gema. O sal provoca uma desidratação dos complexos protéicos e lipoprotéicos da gema, pois o sódio utiliza uma parte de água para sua dissolução. Assim, as proteínas desidratadas tendem a associar-se, resultando no aumento da viscosidade (Linden & Lorient, 1999).
É de referir, que a pasteurização, o congelamento e a concentração têm pouco impacto nas propriedades emulsionantes da gema (Anton et al, 2001, Anton et al, 2003).
3.3 Capacidade espumante
Quando a clara de ovo é batida, ocorre o aprisionamento de bolhas de ar no albúmen e é formada uma espuma – fase gasosa dispersa numa fase líquida. Devido à elevada área superficial na interface líquida/gasosa, as proteínas desnaturam e agregam-se durante o processo de bater a clara (Belitz & Grosh, 1987). A clara é especialmente sensível ao batimento excessivo, bater a clara durante mais de 6-8 minutos causa a agregação - coagulação parcial das proteínas na interface ar-água. Estas proteínas, que não podem ser dissolvidas, não estão adsorvidas propriamente na interface e não formam um filme interfacial coerente, uma vez que a viscosidade da lamela líquida não é a suficiente para criar uma boa estabilidade da espuma (Linden & Lorient, 1999).
A capacidade agregante assim como a estabilidade são critérios importantes para as propriedades espumantes. A clara de ovo é um excelente agente espumante (Mine, 1995). Esta propriedade é muito usada no fabrico de produtos alimentares mais leves, por exemplo soufflé, omoletes (Belitz & Grosh, 1987, Davis & Reeves, 2002).
3.4 Capacidade aromática e corante
O ovo inteiro, particularmente a gema, possui um aroma característico e muito apreciado. A gema fresca tem um odor suave mas desenvolve um aroma agradável característico durante o aquecimento. O odor e propriedades aromáticas da gema crua e cozida podem ser influenciados pela fonte de proteínas na dieta da galinha (Maga, 1982).
Nenhum componente isolado dos ovos pode ser considerado o responsável pelo seu sabor característico. O sabor de ovos tem sido descrito como fresco, leve, doce, terroso, e bolorento. Os ovos são usualmente adicionados em produtos de pastelaria, mas também são apreciados por eles próprios devido ao seu aroma distinto (Ensminger et al., 1995).
Os aromas estão ligados aos lípidos da gema que contêm centenas de compostos voláteis (Linden & Lorient, 1999). A oxidação dos lípidos e as reacções de Maillard são as vias mais importantes na formação dos aromatizantes da gema de ovo.
Umano e os seus colaboradores identificaram 85 compostos voláteis no ovo inteiro, 75 na gema de ovo e 57 na clara de ovo. De acordo com eles o ovo inteiro possui como componentes principais nitrilos, alquibenzenos, cetonas, pirazinas, pirróis e piridinas. O ovo cozido contém elevadas quantidade de cetonas, pirazinas e nitrilos (Umano et al., 1990). Vários estudos compararam os voláteis totais da gema de ovo e os voláteis totais produzidos pelo ovo inteiro e verificaram que a gema produz menos cetonas, índoles e mais pirazinas (Adamiec et al., 2002).
Cerny e Guntz centraram-se na verificação dos compostos que contribuem efectivamente para o aroma da gema ovo, a Tabela 11 apresenta os compostos identificados como poderosos aromatizantes (Cerny & Guntz, 2004).
Tabela 11. Potentes aromatizantes da gema de ovo (Cerny & Cuntz, 2004)
|Número |Composto |
|1 |Butano-2-dione |
|2 |3-metilbutanal |
|3 |1-penteno-3-one |
|4 |2-(Metiltio)acetaldeído |
|5 |Hexanal |
|6 |Metional |
|7 |Heptanal |
|8 |2-Acetil-1-pirroline |
|9 |1-Octeno-3-one |
|10 |Octanal |
|11 |Fenilacetaldeído |
|12 |2,5-Dimethil-4-hidroxi-3-(2H)-furanona |
|13 |(E)-2-Octenal |
|14 |2-Metoxifenol |
|15 |Nonanal |
|16 |(Z)-3-Nonenal |
|17 |(E)-2-Nonenal |
|18 |(E)-2-Decenal |
|19 |(E,E)-2,4-Decadienal |
|20 |(E)-2-Undecenal |
Os pigmentos presentes na gema – xantofilas, luteína e zeaxantina- fornecem cor à gema. A cor da gema depende da quantidade de xantofilas e carotenóides, que provêm da dieta do animal. Esta determina a atracção e aceitabilidade do ovo ou dos produtos contendo ovo para o consumidor. Por exemplo, pigmentos do ovo contribuem para a cor amarela desejável para produtos de pastelaria, omoletes, etc. Contudo, é raro o uso dos ovos como ingredientes em produtos alimentares apenas pelo seu contributo para a cor (Linden & Lorient, 1999).
Objectivos da Tese
Após revisão da literatura referente à composição, modificações ao longo do armazenamento e propriedades funcionais do ovo, verificou-se que um dos aspectos menos estudados da gema era a composição em aminas biogénicas e da fracção volátil. Deste modo, foram delineados os seguintes objectivos para este trabalho:
A. Avaliar a influência da temperatura e do tempo de armazenamento na composição em aminas biogénicas das gemas de ovo
i. Optimizar uma metodologia de HPLC para separação e quantificação de aminas biogénicas em gema de ovo;
ii. Caracterizar a gema proveniente de ovos caseiros e comerciais, no que respeita aos teores de aminas biogénicas;
iii. Avaliar a influência de diferentes temperaturas de armazenamento dos ovos (5 ± 1 ºC e 25 ± 1 ºC) na composição em aminas biogénicas da gema ao longo do prazo de validade.
B. Avaliar a influência da gema de ovo na fracção volátil e nas características sensoriais de creme de pasteleiro
i. Optimizar um método HS-SPME para a extracção dos compostos voláteis;
ii. Identificar os compostos voláteis presentes em cremes de pasteleiro contendo gema de ovo e substitutos;
iii. Prever a origem dos cremes de pasteleiro recorrendo à análise discriminante com base nos diferentes perfil voláteis dos cremes de pasteleiro;
iv. Caracterizar o perfil sensorial dos diferentes cremes de pasteleiro;
v. Comparar o perfil volátil com o perfil sensorial dos diversos cremes de pasteleiro.
A. Composição em Aminas Biogénicas da gema de ovo: Influência do tempo e da temperatura de armazenamento
A.1. Introdução
A.1.1. Aminas Biogénicas
As aminas biogénicas e em particular as poliaminas estão presentes em baixas concentrações nas células dos procariotas e eucariotas e desempenham funções reguladoras no crescimento. São formadas e degradadas durante o metabolismo normal dos animais, plantas e microrganismos (Saito et al., 1992; Stute et al., 2002, Leitão et al., 2005, Lavizzari et al., 2006, Innocente et al., 2007).
As aminas exercem funções fisiológicas importantes nos tecidos animais e vegetais (Soulet & Rivest, 2007). São fontes de azoto e são precursores da síntese de hormonas, alcalóides, ácidos nucléicos e proteínas. São importantes substâncias mensageiras e regulam o funcionamento celular (Brink et al., 1990, Medina et al., 2003, Chiacchierini et al., 2006). Nas plantas e nos animais, as poliaminas estão envolvidas em vários processos celulares como a divisão e diferenciação celular, regulação da expressão dos genes (através da alteração da estrutura do DNA e modulando as cinases proteícas e os factores de transcrição), a síntese de ácidos nucléicos e proteínas, manutenção da estabilidade membranar e dos ácidos nucléicos e nas repostas ao stress (Sousadias & Smith, 1995, Ha et al., 1998, Wada et al, 2002, Moret et al., 2005, Soda et al., 2005, Soulet & Rivest, 2007). Devido à diversidade dos seus papéis no metabolismo celular e no crescimento, são requeridas em elevados níveis nos tecidos em rápido crescimento (Karovičová & Kohajdová, 2005).
Todas as células possuem a capacidade de produzir poliaminas, contudo durante o crescimento e o envelhecimento celular o seu conteúdo em poliaminas diminui (Santos, 1996, Nishimura et al., 2006).
As aminas podem ser classificadas em função do número de grupos amina, da estrutura química e da via sintética. Quanto ao número de grupos amina na molécula classificam-se em monoaminas (tiramina, feniletilamina), diaminas (histamina, triptamina, serotonina, putrescina e cadaverina) e poliaminas (espermina, espermidina e agmatina) (Bardócz, 1995, Kalač et al., 2005, Smith et al., 2000, Larqué et al., 2007).
Relativamente à sua estrutura química, podem ser alifáticas (putrescina, cadaverina, espermina e espermidina), aromáticas (tiramina e feniletilamina) ou heterociclícas (histamina e triptamina) (Medina et al., 2003, Kalač & Krausová, 2005, Kvasnicka & Voldrich, 2006).).
A espermina e espermidina são formadas in situ nas células à medida que são requeridas, com a agmatina e a putrescina como intermediárias (Bardócz, 1995, Ruiz-Capillas & Jiménez-Colmenero, 2004).
As aminas biogénicas derivam essencialmente da descarboxilação dos aminoácidos do respectivo precursor, através de enzimas substrato específicas resultantes de microrganismos, ou alternativamente devido à aminação e transaminação de aldeídos e cetonas (Friday & Firman, 1999, Kvasnicka & Voldrich, 2006, Punakivi et al., 2006). A descarboxilação dos amino ácidos ocorre pela remoção do grupo α-carboxil formando a amina correspondente (Shalaby, 1996).
As diaminas, triptamina, putrescina e cadaverina são formadas, como se observa na Figura 5, a partir da histidina, tirosina, fenilalanina, triptofano, ornitina e lisina, respectivamente (Mariné-Font et al., 1995; Punakivi et al., 2006).
A biossíntese das poliaminas é controlada por duas enzimas, ornitina descarboxilase (ODC) e S-adenosimetionina descarboxilase (AdoMetDC) e as poliaminas são formadas a partir da metionina e da ornitina (Fig. 5) . A metionina fornece o grupo aminopropil necessário à conversão de putrescina nas poliaminas mais complexas. A síntese é realizada através de duas enzimas aminopropiltransferases, espermina e espemidina sintetase. As plantas e os microrganismos também podem produzir putrescina através da actividade da arginina descarboxilase (ADC) (Kalač & Krausová, 2005, Cipolla et al., 2007).
[pic]
Figura 5. Circuitos da formação das aminas biogénicas e das poliaminas (Mariné-Font et al., 1995).
As aminas estão presentes numa larga variedade de produtos alimentares como o chocolate, bolachas de água e sal, peixe e produtos do peixe, cerveja, vinho tinto, queijo, etc. (Arce et al., 1998, Bodmer et al., 1999, Soleas et al., 1999, Lange & Wittmann, 2002, Kvasnička & Voldřich, 2006, Önal, 2007). São formadas em processos metabólicos ou através de actividade microbiana (Smith et al., 2000, Kvasnička & Voldřich , 2006)
Os pré-requisitos para a formação de elevadas quantidades de aminas biogénicas nos alimentos são a existência de aminoácidos livres, a presença de microrganismos descarboxilase-positivos e condições favoráveis ao crescimento bacteriano e à actividade microbiana (Lange & Wittmann, 2002, Innocente et al., 2007). As aminas podem ser constituintes naturais de alguns alimentos: por exemplo a tiramina e a serotonina estão presentes em alguns vegetais e frutos; e a putrescina, igualmente relacionada com a degradação dos alimentos, também se pode encontrar em alguns vegetais e frutos. No decorrer da deterioração dos alimentos é usual observar-se um aumento da concentração de aminas biogénicas (Wada et al., 2002, Ferreira & Pinho, 2006, Önal, 2007).
A.1.2. Metodologias analíticas para doseamento de aminas biogénicas
A determinação das aminas biogénicas em alimentos é geralmente realizada através de métodos cromatográficos incluindo: cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia gasosa, electroforese capilar (CE) e cromatografia líquida de alta eficiência. As aminas biogénicas podem ainda ser detectadas recorrendo a métodos bioquímicos de análise, como sendo, testes imunológicos de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbente Assay) e testes realizados com culturas bacterianas descarboxilase-oxidativas em tirosina-agar. Os testes imunoenzimáticos para a histamina são realizados recorrendo a Kits comerciais que apresentam elevada reprodutibilidade, originam poucos “falsos negativos” e “falsos positivos” quando comparados com o método fluorimétrico oficial AOAC (AOAC, 1995).
A aplicação directa de um único procedimento cromatográfico não é fiável para a determinação simultânea das aminas devido à ausência de um cromofóro ou fluróforo comum na sua estrutura (Paleólogos et al., 2003). Torna-se necessário realizar uma derivatização pré ou pós-coluna, introduzindo um grupo facilmente detectado no grupo amina, para aumentar a sensibilidade do método analítico (Casal et al., 2002, Loukou & Zotou, 2003, Önal, 2007).
Na literatura estão descritos vários agentes derivatizantes, sendo de destacar, o cloreto de dansilo (Carlucci & Karmas, 1988, Romero et al., 2001, Chiacchierini et al., 2006, Soufleros et al., 2007), cloreto de dabsilo (Krause et al., 1995, Romero et al., 2001), a ninidrina (Joosten & Olieman, 1986) a iodoplatina, a fluorescaína (Kalligas et al., 1994) e o oftaldeído (OPA) (Veciana-Nogues et al., 1995, Romero et al., 2001).
Os métodos analíticos para a análise de aminas, geralmente, envolvem 3 passos principais: extracção da aminas, purificação do extracto e derivatização. O método mais usado na determinação de várias aminas é o HPLC (Ferreira & Pinho, 2006).
Diferentes solventes são usados na extracção de aminas, nomeadamente, os ácidos hidroclorídico, tricloroacético, perclórico, assim como, metanol e outros solventes orgânicos. A extracção das aminas representa um passo crítico do processo e pode influenciar negativamente as recuperações analíticas (Vinci & Antonelli, 2002).
Na detecção de aminas biogénicas por HPLC utiliza-se geralmente um detector de UV ou de fluorescência, após derivatização (Loukou & Zoutou, 2003 b, Ferreira & Pinho, 2006). O reagente de derivatização mais usado é o cloreto de dansilo (Casal et al., 2002, Chiacchierini et al., 2006, Önal, 2007, Soufleros et al., 2007) contudo o cloreto de dabsilo apresenta algumas vantagens importantes. O cloreto de dabsilo é um reagente excelente na detecção espectofotométrica visto formar compostos com cor que podem ser detectados na zona do visível (λ = 436-460 nm) com elevada especificidade e sensibilidade e os derivados das aminas primárias e secundárias são estáveis à temperatura ambiente (Krause et al., 1995, Romero et al., 2000, Castillo & Castells, 2001, Loukou & Zotou, 2003).
As colunas cromatográficas mais utilizadas na separação das aminas biogénicas por HPLC são as de troca iónica e as de fase reversa, podendo a derivatização efectuar-se pré ou pós-coluna. O último caso é mais reprodutível, contudo o equipamento requerido é muito dispendioso, o que limita a sua utilização. Por outro lado, a derivitazição pré-coluna obriga a um trabalho cuidadoso ao nível de controlo de tempos e temperaturas de reacção, de modo a garantir a estabilidade e reprodutibilidade dos derivados formados (Ferreira & Pinho, 2006).
A cromatografia gasosa tem surgido como alternativa ao HPLC. A alta resolução das colunas capilares utilizadas, juntamente com um sistema selectivo de detecção, tem possibilitado a análise por GC com muita eficácia. Porém, a cromatografia gasosa apresenta alguns problemas relacionados com a baixa massa molar, a elevada solubilidade na água e a baixa volatilidade destes compostos (Kataoka, 1996). Assim sendo, é necessário recorrer a reacções de derivatização de forma a reduzir a polaridade aumentando a volatilidade. Reacções como a acilação, sililação, dinitrofenilação e formação de produtos de condensação são os procedimentos mais difundidos de derivatização de aminas primárias, secundárias, terciárias, insaturadas e aromáticas (Kataoka, 1996). A detecção pode ser feita por FID (detector por ionização em chama) ou por MS (Espectrometria de massa).
A.2. Parte experimental
A.2.1 Amostragem
No presente estudo foram usados ovos, caseiros e comerciais, de tamanho médio, com peso entre 53-62 g. Após postura dos ovos caseiros estes foram armazenados a duas temperaturas diferentes, nomeadamente, a 25±1º C e a 5±1º C. Posteriormente foram analisados (em duplicado) após 1, 4, 8, 12, 16 e 20 dias de armazenamento, como se pode observar na Fig.6.
Figura 6. Esquema da amostragem para os ovos caseiros
Adicionalmente, usaram-se ovos comerciais de cinco marcas, disponíveis no mercado. Estes estavam no estabelecimento comercial à temperatura ambiente e foram adquiridos entre 2 a 3 dias após a postura. No laboratório foram armazenados a duas temperaturas diferentes, 25±1ºC e 5±1ºC. Foram analisados (em duplicado), periodicamente (3, 8, 10, 13, 17, 23 e 26 dias), até atingirem a data indicada no prazo de validade (Fig. 7).
Figura 7. Esquema da amostragem para os ovos comerciais
A.2.2. Material e métodos
Reagentes
As aminas biogénicas (cadaverina, etilamina, etanolamina, β-feniletilamina, histamina, putrescina, tiramina, triptamina) e o cloreto de dabsilo eram da Sigma.
As soluções padrão foram preparadas numa concentração de 4 g/L. Usou-se ácido clorídrico 0,1 M para este propósito.
Ácido tricloroacético 5 % prepara-se dissolvendo 12,5 g de ácido concentrado em 100 ml de água ultra-pura.
BEHPA/clorofórmio 0,1 M consiste numa mistura de 8,61 ml de BEHPA concentrado e clorofórmio até perfazer o volume final de 250 ml.
Tampão fostato 0,2 M consiste em 9,13 g de hidrogeno fosfato de potássio trihidratado dissolvidos em água ultra-pura até perfazer 200 ml
Tampão reacção (0,15 mol/l NaHCO3, pH 8,6) consiste em 630 mg de hidrogeno carbonato de sódio dissolvidos em 40 ml desionizada, ajusta-se o pH a 8,6 com NaOH diluída e perfez-se o volume de 50 ml com água ultra-pura.
Tampão diluição é uma mistura de 50 ml de acetonitrilo, 25 ml de etanol e 25 ml de tampão eluição A.
Reagente cloreto de dabsilo (6,2 mM em acetona), prepara-se dissolvendo 20 mg de cloreto de dabsilo em 10 ml de acetona pela acção de ultrassons (10 min), filtra-se e armazena-se a -20 ºC.
Procedimento de extracção das aminas biogénicas
Pesam-se 5 g de cada amostra às quais são adicionadas 6 ml de ácido tricloroacético 5%. As amostras são homogeneizadas no Ultra-Tourax durante1 min e posteriormente centrifugadas durante 10 min (9000 rpm, 25ºC). Do extracto resultante retiram-se 2 ml aos quais são adicionados 500 µl de tampão fosfato 0,2 M e 1ml de BEPHA/clorofórmio 0,1M. Após centrifugação (5000 rpm, 5 min, 25ºC) obtêm-se duas fases, separa-se a fase inferior (clorofórmio) e adiciona-se 1 ml de HCl 0,1 M. Homogeneíza-se no vortex e retiram-se 400 µl da fase superior, que são levados à secura em N2 a uma temperatura de 55ºC. A Fig. 8 apresenta o esquema da extracção das aminas presentes nas amostras.
Derivatização
Alíquotas de 20 μl de padrões das aminas, são transferidas para frascos eppendorfs de 1ml, contendo 0,2-50 nmol por componente, após secura em N2 a uma temperatura de 55ºC. As aminas presentes na amostra após o processo de extracção, ver Fig. 8, são diluídos com 200 μl de tampão reacção. Após agitação com a ajuda de um agitador vortex adiciona-se 200 μl de reagente cloreto dabsilo e agita-se novamente.
Figura 8. Esquema resumido da extracção e derivatização das aminas biogénicas.
Incubam-se as amostras a 70ºC durante 15 min, com agitação ao 1º min e 12º min. Colocam-se as amostras ou padrões em gelo durante 10 min de modo a parar a reacção. Após centrifugação (5 min, 13 000 g), os sobrenadantes límpidos são directamente injectados ou armazenam-se a -20ºC até à cromatografia. A Fig. 8 apresenta o esquema da extracção das aminas presentes nas amostras e subsequente derivatização.
Equipamento e condições cromatográfícas
A separação cromatográfica efectuou-se num cromatógrafo líquido de alta eficiência Jasco (Japão), equipado com duas bombas de alta pressão, modelo PU-2080 Plus e um injector manual Rheodyne com um loop de 20 µl. Usou-se um detector Uv, modelo MD-2010 Plus.
Os dados foram adquiridos e analisados usando o programa Borwin Controller Software (JMBS, França).
As aminas derivadas do dabsilo são separadas por uma coluna C18 I.D. Spherisorb ODS, 150 x 4,6 mm, 3 μm.
A fase móvel A consiste em 9mM de dihidrogenofosfato, 4% dimetilformamida e 0,1-0,2 % de trietilamina (TEA), com pH 6,55 por meio de ácido fosfórico. A fase móvel B é uma mistura de 80% (v/v) de acetonitrilo aquoso.
As aminas dabsiladas são eluídas com um fluxo de 1 ml/minuto usando o gradiente exposto na Tabela 12, a detecção foi realizada a 436 nm.
Tabela 12. Esquema do gradiente de eluição usado na separação das aminas biogénicas em estudo.
|Eluente |Tempo (min) |
| |0,0 |15,0 |20,0 |30,0 |35,0 |
|Eluente B (%) |40 |76 |78 |100 |40 |
|Eluente A (%) |60 |24 |22 |0 |60 |
A.2.3 Análise estatística
A exploração dos dados, análise descritiva, teste t, ANOVA dois factores com teste de Tukey e regressão linear múltipla pelo método stepwise foram realizadas com o programa SPSS para Windows, versão 15.0 (SPSS Inc, Chicago, IL).
A.3. Resultados e Discussão
A.3.1. Optimização do método de HLPC e do processo extractivo
A optimização do método de HPLC efectuou-se a partir de um método da literatura (Ferreira & Pinho, 2006), adequado para separar, simultaneamente, aminoácidos livres e aminas biogénicas. Atendendo a que neste trabalho o objectivo era unicamente determinar a composição em aminas biogénicas da gema de ovo, a optimização do método de HPLC visou reduzir o tempo de separação cromatográfica. Com este objectivo foram testados diferentes gradientes de forma a permitir separar onze aminas biogénicas.
Obteve-se linearidade entre as concentrações de putrescina, cadaverina, histamina, etilamina, propilamina, etanolamina, tiramina, triptamina, espermina, espermidina, feniletilamina e a absorvância a 436 nm. O limite de detecção foi inferior a 0,2 mg/L. As equações das rectas usadas para a quantificação das aminas biogénicas nas amostras em estudo e os parâmetros das curvas de calibração foram resumidos na Tabela 13.
Tabela 13. Parâmetros das curvas de calibração determinados pelo método do padrão externo
|Amostra |Intervalo de |Declive (mg/l) |Ordenada na origem|R |Limite de detecção|
| |concentração (mg/l) | | | |(mg/l) |
|Cadaverina |3,5-12,5 |2E+08 |2E+06 |0.9943 |0,20 |
|Etilamina |1,5-50,0 |3E+08 |139387 |0.9966 |0,15 |
|Propilamina |1,5-50,0 |2E+08 |342539 |0,9974 |0,15 |
|Etanolamina |1,5-50,0 |2E+08 |287687 |0.9998 |0,15 |
O método de extracção foi optimizado para eliminar a interferência dos aminoácidos livres e outros compostos. As condições seleccionadas permitiram obter elevada reprodutibilidade e exactidão, tanto na extracção como na derivatização, com valores de desvio padrão relativo menores que 4% e recuperações superiores a 90%.
A.3.2. Composição em aminas biogénicas da gema de ovo
Nas amostras de gemas de ovos caseiros só foram detectadas cinco das onze aminas biogénicas em estudo. As concentrações variaram entre 9,32 e 1,08 mg de etanolamina /kg de gema, entre 7,79 e 0,59 mg de etilamina/kg de gema, entre 9,92 e 2,72 mg de propilamina/kg de gema, entre 20.8 e 0,19 mg de putrescina/kg de gema, entre 11,32 e 6,89 mg de cadaverina/kg de gema (Tabela 14).
Tabela 14. Composição em aminas biogénicas doseadas na gema dos ovos caseiros *
| |Etanolamina |Etilamina |Propilamina |Putrescina |Cadaverina |
| |mg/kg gema |mg/kg gema |mg/kg gema |mg/kg gema |mg/kg gema |
| | | | | | |
|Dias | | | | | |
|CP1 |3.2±0.3a |1.0±0.1 a |38.20±1.02 a |1.61±0.22 a |0.7 |
|CP2 |3.9±0.4 a |0.1±0.0 b |30.86±1.53 b |1.39±0.34 a |0.69 |
|CP3 | ................
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