KEILLA DOS REIS DUTRA FERREIRA - UENF

MODULA??O DA TRANSI??O DIM?RFICA DE Yarrowia lipolytica

KEILLA DOS REIS DUTRA FERREIRA

UNIVERSIDADE ESDATUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIROUENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ Abril/2016

I

MODULA??O DA TRANSI??O DIM?RFICA DE Yarrowia lipolytica

KEILLA DOS REIS DUTRA FERREIRA

"Tese apresentada ao Centro de Bioci?ncias e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exig?ncias para obten??o do t?tulo de Doutora em Bioci?ncias e Biotecnologia"

ORIENTADORA: ANNA L. OKOROKOVA FA?ANHA

CAMPOS DOS GOYTACAZES ? RJ Abril/2016

II

MODULA??O DA TRANSI??O DIM?RFICA DE Yarrowia lipolytica

KEILLA DOS REIS DUTRA FERREIRA

"Tese apresentada ao Centro de Bioci?ncias e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exig?ncias para obten??o do t?tulo de Doutora em Bioci?ncias e Biotecnologia"

Comiss?o Examinadora:

Prof. Cl?vis de Paula Santos - UENF _______________________________________________________________ Prof. Marco Antonio Cruz Lopes - UFRJ ______________________________________________________________ Profa. Valdirene Moreira Gomes - UENF Profa Anna L. Okorokova Fa?anha ? UENF (Orientadora)

III

SUM?RIO

LISTA DE ABREVIATURAS...................................................................................V RESUMO.............................................................................................................. ...II ABSTRACT............................................................................................................ ..I 1. REVIS?O DE LITERATURA ............................................................................ ..II

1.1 Yarrowia lipolytica .................................................................................. .- 1 1.2 Transi??o levedura-hifa............................................................................... 2 2.FATORES EU MODULAM A TRANSI??O LEVEDURA - HIFA EM Yarrowia lipolytica.............................................................................................................3 2.1 Auxina ........................................................................................................... 3 2.2 H+-ATPases .................................................................................................. 7 2.3 ?xido N?trico ................................................................................................ 8 2.4 Sinaliza??o por meio da cascata da MAPK e PKA.................................. 10 3. OBJETIVOS...................................................................................................... 12 3.1 Objetivo geral ............................................................................................. 12 3.2 Objetivos espec?ficos ................................................................................ 12 4. MATERIAIS E M?TODOS ................................................................................ 13 4.1 Cepa da levedura Yarrowia lipolytica....................................................... 13 4.2 Prepara??o dos meios de cultura e manuten??o da cepa. .................... 13 4.3 Acompanhamento da morfologia de Y. lipolytica ................................... 13 4.4 Cultivo de Y. lipolytica em meio l?quido .................................................. 13 4.5 Dosagem de compostos ind?licos produzidos por Y. lipolytica .............. 14 4.6 Isolamento de membranas celulares de Y. lipolytica. ............................ 15 4.7 Determina??o do conte?do de prote?na. ................................................. 15 4.8 Determina??o do transporte de H+ ............................................................. 16 4.9 Determina??o de fosfato inorg?nico (Pi). ................................................ 17 4.10 Determina??o da atividade hidrol?tica. .................................................. 17 4.11 Quantifica??o de NO em c?lulas de Y. lipolytica. ................................. 17 4.12 Quantifica??o de am?nia em c?lulas de Y. lipolytica. .......................... 18 5. RESULTADOS.................................................................................................. 20 5.1 Efeito dos inibidores de AIA (TIBA e PCIB) sobre o cultivo e transi??o dim?rfica de Y. lipolytica................................................................ 20 5.2 Efeito dos inibidores da sinaliza??o da auxina na morfologia das col?nias de Yarrowia lipolytica. ..................................................................... 21 5.3 Efeito do AIA sobre a atividade de H+-ATPase e tipo P e atividade hidrol?tica de Y. lipolytica................................................................................ 22 5.4 Detec??o de NO em c?lulas de Y. lipolytica ............................................ 23

IV

5.5 Efeito do doador de ?xido n?trico (SNP) sobre o cultivo e transi??o dim?rfica de Y. lipolytica................................................................................. 25 5.6 Efeito do bloqueador de ?xido n?trico (PTIO) sobre a transi??o dim?rfica de Y. lipolytica................................................................................. 26 5.7 Efeito do NO sobre a atividade de H+-ATPase tipo P e atividade hidrol?tica de Y. lipolytica................................................................................ 28 5.8 Efeito do inibidor da ?xido n?trico sintase (L-NAME) sobre a transi??o dim?rfica de Y. lipolytica................................................................ 29 5.9 Efeito do inibidor de GMP c?clico sobre a transi??o dim?rfica de Y. lipolytica. .......................................................................................................... 30 5.10 Efeito da via de sinaliza??o desencadeada pela MAPK na morfog?nese de Y. lipolytica.. ........................................................................ 31 5.11 An?lise da rela??o das vias da auxina e a via da MAPK com NO na morfog?nese de Y. lipolytica. ......................................................................... 32 5.12 Efeito da via de sinaliza??o desencadeada pela MAPK sobre a atividade de H+-ATPase tipo Pe atividade hidrol?tica de Y. lipolytica. ........ 33 5.13 Efeito do AMP c?clico na morfog?nese de Y. lipolytica. ....................... 35 5.14 Efeito da via da PKA sobre a morfologia de Y. lipolytica..................... 36 5.15 Efeito do inibidor da PKA sobre a transi??o dim?rfica em Y. lipolytica. .......................................................................................................... 37 5.16 AMP c?clico reverte o efeito bloqueador da morfog?nese causado pelo inibidor da MAPK..................................................................................... 37 5.17 Efeito dos estimuladores e inibidores da morfog?nese de Y. lipolytica sobre o pH ambiental das col?nias. .............................................. 38 5.18 Quantifica??o de am?nia secretada por c?lulas de Y. lipolytica. ........ 39 6. DISCUSS?O ..................................................................................................... 40 7.CONCLUS?O......................................................................................................51 8. BIBLIOGRAFIA..................................................................................................52

V

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