IMUNOLOGIA CAPÍTULO SETE REAÇÕES ANTIGENO-ANTICORPO E ...

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IMUNOLOGIA ? CAP?TULO SETE REA??ES ANTIGENO-ANTICORPO E TESTES SELECIONADOS

Dr Gene Mayer

Tradu??o: PhD. Myres Hopkins EM INGL?S

EM ESPANHOL SHQIP - ALBANIAN

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DR MYRES HOPKINS ESCOLA DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DA CAROLINA DO SUL

LEITURA (EM INGL?S) Male et al. Immunology 7th edi??o pp 67-74

OBJETIVOS Descrever a natureza das rea??es Ag-Ac Comparar e diferenciar afinidade e avidez de anticorpos Delienar a base para a especificidade e reatividade cruzada de anticorpos

Discutir os princ?pios dos testes cumumente usados em rea??es ant?geno/anticorpo

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Figura 1

I. NATUREZA DAS REA??ES ANT?GENO-ANTICORPO

A. Conceito de Chave e Fechadura O s?tio de combina??o de um anticorpo ? localizado na por??o Fab da mol?cula e ? constru?do a partir de regi?es hipervari?veis de cadeias pesadas e leves. Estudos de cristalografia por raios X das intera??es ant?geno-anticorpo mostram que o determinante antig?nico se aninha em uma fenda formada pelo s?tio de combina??o do anticorpo como ilustrado na Figura 1. Dessa forma, nosso conceito de rea??es ant?geno-anticorpo ? o de uma chave (i.e. o ant?geno) que cabe em uma fechadura (i.e. o anticorpo).

B. Liga??es N?o-covalentes As liga??es que unem o ant?geno ao s?tio de liga??o do anticorpo s?o todas n?o-covalentes por natureza. Elas incluem pontes de hidrog?nio, liga??es eletrost?ticas, for?as de Van der Waals e hidrof?bicas. Liga??es m?ltiplas entre o ant?geno e o anticorpo garantem que o ant?geno ser? ligado fortemente ao anticorpo.

C. Reversibilidade Uma vez que as rea??es ant?geno-anticorpo ocorrem via liga??es n?o-covalentes, elas s?o por natureza revers?veis.

PALAVRAS CHAVE

Affinity Avidez Especificidade Reatividade cruzada Aglutina??o Hemaglutina??o Aglutinina Titragem Pro-zona Hemaglutina??o passiva Teste de Coombs Direto Teste de Coombs Indireto Inibi??o de hemaglutina??o Ponto de equival?ncia Excesso de anticorpo Excesso de ant?geno Imunodifus?o radial Imunoeletroforese Contraimunoeletroforese Radioimunoensaio Ensaio Imunoadsorvente Ligado ? Enzima RIA/ELISA Competitivo RIA/ELISA N?o Competitivo Imunofluoresc?ncia Citometria de fluxo Fixa??o do complemento

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Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

II. AFINIDADE E AVIDEZ

A. Afinidade Afinidade de um anticorpo ? a for?a da rea??o entre um ?nico determinante antig?nico e um ?nico s?tio de combina??o no anticorpo. ? a soma das for?as de atra??o e repuls?o que operam entre o determinante antig?nico e o s?tio de combina??o do anticorpo, como ilustrado na Figura 2.

Afinidade ? a constante de equil?brio que descreve a rea??o ant?geno-anticorpo, como ilustrado na Figura 3. A maioria dos anticorpos t?m uma elevada afinidade por seus ant?genos.

B. Avidez Avidez ? uma medida da for?a total de liga??o de um ant?geno contendo muitos determinantes antig?nicos e anticorpos multivalentes. A avidez ? influenciada tanto pela val?ncia do anticorpo como pela val?ncia do ant?geno. Avidez ? mais que a soma de afinidades individuais. Isto ? ilustrado na Figura 4.

Repetindo, afinidade se refere ? for?a de liga??o entre um ?nico determinante antig?nico e um s?tio de combina??o de um anticorpo particular, enquanto que avidez se refere ? for?a total de liga??o entre ant?genos e anticorpos.

III. ESPECIFICIDADE E REATIVIDADE CRUZADA

A. Especificidade Especificidade se refere ? abilidade de um s?tio de combina??o de anticorpo em particular de reagir com apenas um ant?geno. Em geral, h? um elevado grau de especificidade nas rea??es ant?geno-anticorpo. Anticorpos podem distinguir diferen?as em 1) estrutura prim?ria de um ant?geno, 2) formas isom?ricas de um ant?geno, e 3) estrutura secund?ria e terci?ria de um ant?geno.

B. Reatividade cruzada Reatividade cruzada se refere ? habilidade de um s?tio de combina??o de anticorpo em particular de reagir com mais de um determinante antig?nico ou a habilidade de uma popula??o de mol?culas de anticorpos de reagir com mais de um ant?geno. A Figura 5 ilustra como rea??es cruzadas podem ocorrer. Rea??es cruzadas aparecem porque o ant?geno envolvido na rea??o cruzada compartilha um mesmo epitopo com o ant?geno imunizador ou porque ele

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tem um epitopo que ? estruturalmente semelhante ao epitopo no ant?geno imunizante (multiespecificidade).

IV. TESTES DE REA??O ANT?GENO-ANTICORPO

A. Fatores que afetam a medi??o de rea??es ant?geno-anticorpo A ?nica forma de se saber se uma rea??o ant?geno-anticorpo ocorreu ? descobrir um jeito de detectar direta ou indiretamente os complexos formados entre o ant?geno e o anticorpo. A facilidade da escolha sobre qual deles poder? detectar as rea??es ant?geno-anticorpo vai depender de v?rios fatores.

1. Afinidade Quanto maior a afinidade do anticorpo pelo ant?geno, mais est?vel ser? a intera??o. Nesse caso, a facilidade com que se pode detectar a intera??o ? maior.

2. Avidez Rea??es entre ant?genos multivalentes e anticorpos multivalentes s?o mais est?veis e portanto mais f?ceis de detectar.

Figura 6

3. Raz?o entre ant?geno e anticorpo A raz?o entre o ant?geno e o anticorpo influencia a detec??o dos complexos ant?genoanticorpo porque o tamanho dos complexos est? relacionado com a concentra??o do ant?geno e do anticorpo. Isto ? mostrado na Figura 6.

4. Forma f?sica do ant?geno A forma f?sica do ant?geno influencia em como se detecta sua rea??o com um anticorpo. Se o ant?geno ? particulado, geralmente se observa a aglutina??o do ant?geno pelo anticorpo. Se o ant?geno ? sol?vel, geralmente se pesquisa a precipita??o de um ant?geno ap?s a produ??o de grandes complexos ant?geno-anticorpo insol?veis.

Figura 7

B. Testes de Aglutina??o

1. Aglutina??o/Hemaglutina??o Quando um ant?geno ? particulado, a rea??o de um anticorpo com o ant?geno pode ser detectada pela aglutina??o (agrupamento) do ant?geno. O termo geral aglutinina ? usado para descrever anticorpos que aglutinam ant?genos particulados. Quando o ant?geno ? um eritr?cito ? usado o termo hemaglutina??o. Todos os anticorpos podem teoricamente aglutinar ant?genos particulados mas IgM, devido ? sua elevada val?ncia, ? particularmente uma boa aglutinina e se pode ?s vezes inferir que um anticorpo deve ser da clase IgM se for um bom anticorpo aglutinador.

a. Teste de aglutina??o qualitativo Testes de aglutina??o podem ser usados de maneira qualitativa para investigar a presen?a de um ant?geno ou um anticorpo. O anticorpo ? misturado com o ant?geno particulado e um teste positivo ? indicado pela aglutina??o do ant?geno particulado. (Figura 7).

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Por exemplo, c?lulas vermelhas do sangue de um paciente podem ser misturadas com um anticorpo dirigido a um ant?geno de grupo sangu?neo para determinar o tipo sangu?neo da pessoa. Em um segundo exemplo, o soro de um paciente ? misturado com c?lulas vermelhas do sangue de um tipo sangu?neo conhecido para pesquisar pela presen?a de anticorpos para aquele tipo sangu?neo no soro do paciente.

Figura 8

b. Teste de aglutina??o qualitativo Testes de aglutina??o podem tamb?m ser usados para medir o n?vel de anticorpos para ant?genos particulados. Neste teste, ? realizada uma dilui??o seriada de uma amostra a ser testada para anticorpos e a seguir ? adicionado um n?mero fixo de c?lulas vermelhas sangu?neas, bact?rias ou outro ant?geno particulado. Em seguida ? determinada a dilui??o m?xima que ainda permite aglutina??o. A dilui??o m?xima que ainda permite aglutina??o vis?vel ? chamada de t?tulo. Os resultados s?o descritos como a rec?proca entra a dilui??o m?xima que ainda permite aglutina??o vis?vel. A Figura 8 ilustra o teste quantitativo de hemaglutina??o.

Efeito prozona ? Ocasionalmente ? observado que quando a concentra??o do anticorpo ? elevada (i.e. dilui??es menores) n?o h? aglutina??o, mas quando a amostra ? posteriormente diluida ocorre a aglutina??o (Veja Paciente 6 na Figura 8). A aus?ncia de aglutina??o em altas concentra??es de anticorpos ? chamada de efeito prozona. A aus?ncia de aglutina??o no efeito prozona ? devida ao excesso de anticorpos resultando em complexos muito pequenos que n?o se aglomeram para produzir aglutina??o vis?vel.

c. Aplica??es dos testes de aglutina??o

i. Determina??o dos tipos sangu?neos ou de anticorpos para ant?genos de grupos sangu?neos.

ii. Avaliar infec??es bacterianas

ex. O aumento em t?tulo de um anticorpo dirigido a uma bact?ria em particular indica uma infec??o por aquele tipo bacteriano. N.B. um quadruplo em aumento do t?tulo ? geralmente considerado como um aumento significante de t?tulo de anticorpos.

d. Considera??es pr?ticas Embora o teste seja de f?cil execu??o, ? apenas semi-quantitativo.

Figura 9

2. Hemaglutina??o passiva Os testes de aglutina??o s? funcionam com ant?genos particulados. Entretanto, ? poss?vel se cobrir eritr?citos com um ant?geno sol?vel (ex. Ant?geno viral, um polissacar?deo ou hapteno) e usar as c?lulas vermelhas sangu?neas cobertas em um teste de aglutina??o com anticorpos para o ant?geno sol?vel (Figura 9). Issso ? chamado de hemaglutina??o passiva. O teste ? realizado tal como o teste de aglutina??o. As aplica??es incluem a detec??o de anticorpos para ant?genos sol?veis e detec??o de anticorpos para ant?genos virais.

Figura 10

3. Teste de Coombs (Teste de Antiglobulina)

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a. Teste de Cooms Direto Quando anticorpos se ligam a eritr?citos, eles nem sempre resultam em aglutina??o. Isso pode se dever ? rela??o ant?geno/anticorpo, em que o ant?geno em excesso, o anticorpo em excesso ou em alguns casos cargas el?tricas nas c?lulas vermelhas sangu?neas prejudicam a efici?ncia da liga??o cruzada entra as c?lulas. Esses anticorpos que ligam mas n?o causam aglutina??o das c?lulas vermelhas sangu?neas s?o ?s vezes referidos como anticorpos incompletos. Isso n?o quer dizer de forma nenhuma que os anticorpos sejam diferentes em sua estrutura, embora isso seja o que se pensava que fosse o caso. Pelo contr?rio, esta ? uma defini??o apenas funcional. Para detectar a presen?a de anticorpos n?o-aglutinadores nas c?lulas vermelhas sangu?neas, simplesmente se adiciona um segundo anticorpo diretamente contra a imunoglobulina (anticorpo) que cobre as c?lulas vermelhas. Esta anti-imunoglobulina pode agora fazer rea??o cruzada com as c?lulas vermelhas sangu?neas e levar ? aglutina??o. Este teste ? ilustrado na Figura 10 e ? conhecido como teste de Coombs Direto.

Figura 11

b. Teste de Coombs Indireto Se for necess?rio saber se uma amostra de soro tem anticorpos dirigidos contra uma c?lula vermelha sangu?nea em particular e voc? quer se assegurar de que tamb?m vai detectar anticorpos n?o-aglutinadores potenciais na amostra, ? realizado um teste de Coombs Indireto (Figura 11). Este teste ? feito incubando as c?lulas vermelhas sangu?neas com a amostra de soro, lavando-se para retirar quaisquer anticorpos n?o ligados e depois adicionando um segundo reagente anti-imunoglobulina para fazer liga??o cruzada com as c?lulas.

c. Aplica??es Entre estas se incluem a detec??o de anticorpos (Rh) anti-fator rhesus . Anticorpos contra o fator Rh geralmente n?o aglutinam c?lulas vermelhas sangu?neas. Portanto, c?lulas vermelhas de crian?as Rh+ nascidas de m?es Rh- , que t?m anticorpos anti-Rh, devem estar cobertas por esses anticorpos. Para verificar isso, ? realizado um teste de Coombs direto. Para ver se a m?e t?m anticorpos anti-Rh no seu soro se realiza um teste de Coombs Indireto.

Figura 12

4. Inibi??o de Hemaglutina??o O teste de aglutina??o pode ser modificado para ser usado na medi??o de ant?genos sol?veis. Este teste ? chamado inibi??o de hemaglutina??o. ? chamado inibi??o de hemaglutina??o porque ? medida a habilidade de um ant?geno sol?vel de inibir a aglutina??o por anticorpos de c?lulas vermelhas sangu?neas cobertas por ant?genos. Neste teste, uma quantidade fixa de anticorpos dirigidos ao ant?geno em quest?o ? misturada com uma quantidade fixa de c?lulas vermelhas sangu?neas cobertas com o ant?geno (veja hemaglutina??o passiva acima). Tamb?m est?o incluidas na mistura diferentes quantidades da amostra a ser analizada para a presen?a do ant?geno. Se a amostra cont?m o ant?geno, o ant?geno sol?vel ir? competir com o ant?geno que cobre as c?lulas vermelhas sangu?neas pela liga??o com os anticorpos, inibindo dessa forma a aglutina??o das c?lulas vermelhas sangu?neas, como ilustrado na Figura 12.

Pela dilui??o seriada da amostra voc? pode quantificar o ant?geno na sua amostra desconhecida pelo seu t?tulo. Este teste ? geralmente usado para quantificar ant?genos sol?veis e ? sujeito ?s mesmas considera??es pr?ticas do teste de aglutina??o.

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Figura 13

C. Testes de precipita??o

1. Imunodifus?o Radial (Mancini) Na imunodifus?o radial o anticorpo ? incorporado no gel de ?gar quando este for derramado e dilui??es diferentes do ant?geno s?o aplicadas nos po?os perfurados no agar. ? medida que o ant?geno se difunde no gel ele reage com o anticorpo e quando o ponto de equival?ncia ? atingido ? formado um anel de precipita??o, conforme ? ilustrado na Figura 13.

O di?metro do anel ? proporcional ao log da concentra??o do ant?geno, uma vez que a quantidade de anticorpo ? constante. Portanto, ao correr diferentes concentra??es de um ant?geno padr?o pode-se gerar uma curva padr?o a partir da qual se pode quantificar a quantidade de um ant?geno em uma amostra desconhecida. Por essa raz?o, este ? um teste quantitativo. Se aparecerem no teste mais de um anel, ocorreram mais de uma rea??o ant?geno/anticorpo. Isso pode ser devido ? mistuda de ant?genos ou de anticorpos. Este teste ? comumente usado em laborat?rio cl?nico para a determina??o dos n?veis de imunoglobulina em amostras de pacientes.

Figura 14

2. Imunoeletroforese Em imunoeletroforese, uma mistura complexa de ant?genos ? aplicada em um po?o perfurado em um gel de ?gar e os ant?genos s?o submetidos ? eletroforese, de forma que os ant?genos s?o separados de acordo com suas cargas. Ap?s a eletroforese, um sulco ? feito no gel e os anticorpos s?o adicionados. ? medida que os anticorpos se difundem no ?gar s?o produzidas linhas de precipitina na zona de equival?ncia quando ocorre uma rea??o ant?geno/anticorpo, conforme ilustrado na Figura 14.

Este teste ? usado para a an?lise qualitativa de misturas complexas de ant?genos, embora uma medida grosseira da quantidade (espessura da linha) pode ser obtida. Este teste ? comumente usado para a an?lise de componentes no soro de um paciente. O soro ? colocado no po?o e anticorpos para soro total ? colocado no sulco. Atrav?s da compara??o com o soro normal, ? poss?vel determinar se h? defici?ncias em um ou mais componentes do soro ou se h? uma super-abund?ncia de algum dos componentes do soro (espessura da linha). Este teste pode tamb?m ser usado para avaliar a pureza das prote?nas de soro isoladas.

Figura 15

3. Eletroforese contracorrente Neste teste o ant?geno e o anticorpo s?o colocados em po?os perfurados no gel de ?gar e o ant?geno e o anticorpo s?o submetidos ? eletroforese um contra o outro, onde eles formam uma linha de precipita??o como ilustrado na Figura 15. Este teste somente funciona se forem conseguidas as condi??es em que em que o ant?geno e o anticorpo tenham cargas opostas. Este teste ? primariamente qualitativo, embora a partir da espessura da banda voc? possa obter alguma medida da quantidade. Sua maior vantagem ? a rapidez.

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Figura 16

Figura 17

D. Radioimunoensaio (RIA)/Ensaio Enzim?tico de Imunoabsor??o (ELISA)

Radioimunoensaios (RIA) s?o ensaios baseados na medi??o da radioatividade associada com complexos imunes. Em um teste particular, o marcador pode ser tanto o ant?geno como anticorpo. Ensaios enzim?ticos de Imunoabsor??o (ELISA) s?o aqueles que s?o baseados na medi??o de uma rea??o enzim?tica associada com complexos imunes. Em um teste em particular, a enzima deve esta ligada ao ant?geno ou ao anticorpo.

1. RIA/ELISA Competitivo para Detec??o de Ac O m?todo e o princ?pio do RIA e ELISA para a medi??o de ant?geno ? mostrado na Figura 16. Pelo uso de quantidades conhecidas de um ant?geno padr?o n?o marcado pode-se gerar uma curva padr?o, relacionando a radioatividade da enzima ligada versus quantidade do ant?geno. A partir desta curva padr?o pode-se determinar a quantidade de um ant?geno em uma amostra desconhecida.

O ponto crucial do teste ? a separa??o dos complexos imunes do restante dos componentes. Isso pode ser conseguido em muitas maneiras diferentes que servem como base para o nome atribuido ao ensaio:

a. Precipita??o por sulfato de am?nia Sulfato de am?nia (concentra??o final 33 - 50%) ir? precipitar imunoglobulinas mas n?o muitos ant?genos. Esta tamb?m ? chamada t?cnica de Farr.

b. Anticorpo anti-imunoglobulina A adi??o de um segundo anticorpo dirigido contra o primeiro anticorpo pode resultar na precipita??o de complexos imunes e consequentemente na separa??o dos complexos e ant?genos livres.

c. Imobiliza??o do Anticorpo O anticorpo pode ser imobilizado na superf?cie de uma p?rola de pl?stico ou cobrindo a superf?cie de uma placa de pl?stico e assim os complexos imunes podem facilmente ser separados dos outros componentes pela simples lavagem das p?rolas ou da placa (Figura 17). Este ? o m?todo mais comumente usado hoje em dia e ? referido como RIA ou ELISA de fase S?lida. No laborat?rio cl?nico, RIA e ELISA competitivo s?o comumente usados para quantificar prote?nas s?ricas, horm?nios e metab?litos de drogas.

TUTORIAL

EM INGL?S TESTE ELISA

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