PRÁCTICAS DE HISTOLOGÍA HUMANA - UPV/EHU

[Pages:116]Pr?cticas de Histolog?a Humana

Enrique Hilario

DPTO. BIOLOG?A CELULAR E HISTOLOG?A Facultad de MEDICINA Y ODONTOLOG?A ISBN: 978-84-690-7712-2

Pr?cticas de Histolog?a Humana

PR?CTICAS DE HISTOLOG?A HUMANA

Enrique Hilario

Dpto. Biolog?a Celular e Histolog?a Facultad de Medicina y Odontolog?a Universidad del Pa?s Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea

Pr?cticas de Histolog?a Humana

?NDICE

Procesamiento de Muestras para Microscop?a ?ptica y Electr?nica de Transmisi?n....................... 1 M?todos de Estudio de las Muestras Histol?gicas............................................................................. 11 Tejido Epitelial de Revestimiento ....................................................................................................... 19 Tejido Epitelial Glandular ................................................................................................................... 23 Tejido Conectivo y Adiposo................................................................................................................ 27 Tejido Cartilaginoso............................................................................................................................ 31 Tejido ?seo ........................................................................................................................................ 35 Sangre y Hematopoyesis ................................................................................................................... 39 Tejido Muscular .................................................................................................................................. 43 Sistema Nervioso I ............................................................................................................................. 47 Sistema Nervioso II ............................................................................................................................ 51 Globo Ocular ...................................................................................................................................... 55 Sistema Endocrino I ........................................................................................................................... 59 Sistema Endocrino II .......................................................................................................................... 63 Aparato circulatorio ............................................................................................................................ 67 Sistema Inmunitario............................................................................................................................ 71 Aparato Respiratorio .......................................................................................................................... 75 Aparato Digestivo I ............................................................................................................................. 79 Aparato Digestivo II ............................................................................................................................ 83 Aparato Digestivo III ........................................................................................................................... 87 Aparato Urinario ................................................................................................................................. 91 Aparato Genital Masculino ................................................................................................................. 95 Aparato Genital Femenino I ............................................................................................................... 99 Aparato Genital Femenino II .............................................................................................................. 103 Sistema Tegumentario y Mama ......................................................................................................... 107 Direcciones de P?ginas Web ............................................................................................................. 111 ?ndice de Etiquetas............................................................................................................................. 112

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PREFACIO

Pr?cticas de Histolog?a Humana

La Histolog?a en su quehacer diario es una disciplina eminentemente pr?ctica. La docencia de la Histolog?a Humana se desarrolla b?sicamente a trav?s de clases magistrales, seminarios y clases pr?cticas. Para la realizaci?n de estas ?ltimas el alumno dispone de un microscopio ?ptico y diferentes preparaciones histol?gicas, as? como de fotograf?as de microscop?a electr?nica.

El programa pr?ctico de la asignatura se desglosa a lo largo de veinticinco temas, que comienzan con la Histolog?a General, donde se estudian los tejidos, para dar paso a la Histolog?a Especial. Los temas se ordenan de forma paralela al desarrollo del programa te?rico de la asignatura. De esta manera el alumno adquiere los conocimientos te?ricos y despu?s los aplica a la pr?ctica. Sin embargo, el desarrollo del curso acad?mico hace que esta sincronizaci?n tan solo sea posible durante las primeras pr?cticas, y llega un momento en el que las pr?cticas llegan a preceder al estudio te?rico.

Para ello, en la presente gu?a de "Pr?cticas de Histolog?a Humana" se hacen comentarios que si bien, pueden parecer algo "extra?os" a una persona con conocimiento de la disciplina, si es cierto que se revelan muy ?tiles al alumno, como nos ha ense?ado su utilizaci?n en el aula pr?ctica a lo largo de los a?os.

Esperar que esta publicaci?n sea de inter?s y utilidad para los alumnos; para quienes realmente se ha escrito.

Junio de 2007

Enrique Hilario

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Pr?ctica n? 1

Procesamiento de Muestras para Microscop?a ?ptica y

Electr?nica de Transmisi?n

1. Que es una preparaci?n histol?gica y como se obtiene

Se denomina preparaci?n a la secci?n o corte del esp?cimen biol?gico que se ha "preparado" para su estudio. Sin embargo, por analog?a, tambi?n se denomina as? al conjunto que forman la muestra y el soporte donde ?sta est? colocada.

La muestra histol?gica normalmente consiste en una secci?n de unas 5 m de grosor que se dispone alojada entre dos cristales rectangulares: uno de cierto grosor y consistencia (portaobjetos: "porta" coloquialmente) y otro muy fino (cubreobjetos: "cubre" coloquialmente). Entre ellos la muestra preparada (deshidratada y coloreada) est? lista para su observaci?n con el microscopio ?ptico. Esta es una preparaci?n de rutina, que el alumno utilizar? en todas su pr?cticas de Histolog?a.

2. Procesamiento de muestras para microscop?a ?ptica

Para poder observar la muestra a trav?s del microscopio ?ptico est? debe de ser "preparada" mediante un proceso que veremos a continuaci?n. Todos estos pasos se conocen como procesamiento de la muestra. Los cuatro primeros corresponden a la inclusi?n, el quinto a la secci?n, los n?meros 6-9 a la "deshidrataci?n y tinci?n" y el resto al "montaje" de la preparaci?n. Cualquier tratamiento de los tejidos que sea necesario para impregnarlos de un medio s?lido que facilite la realizaci?n de secciones finas para microscop?a se conoce con nombre gen?rico de inclusi?n (aunque realmente inclusi?n se refiere al tratamiento necesario para impregnar los tejidos de un medio s?lido que facilite la producci?n de secciones para microscop?a.

B?sicamente el protocolo es el siguiente:

1) fijaci?n: procura que la muestra est? lo m?s parecida al estado vivo. 2) deshidrataci?n: sustituye el agua de los tejidos por alcohol o acetona. 3) aclaramiento: es la sustituci?n del agente deshidratante por otro, denominado de

transici?n (normalmente se utiliza el Xilol) que a su vez es miscible en el medio de inclusi?n que proporcione a la muestra la necesaria dureza para poder ser seccionada. 4) inclusi?n de la muestra: se embebe en el medio que le proporcione dureza. Normalmente se utiliza la parafina, que es una cera y por lo tanto no miscible en agua. As?, esta sustancia ha sustituido al agua que inicialmente estaba en las c?lulas y tejidos. 5) secci?n de la muestra: se obtienen los cortes histol?gicos de unas 5 m de grosor, que se depositan sobre los portaobjetos, donde se dejan hasta que se adhieran al cristal. 6) eliminaci?n de la parafina existente en las secciones: mediante su inmersi?n en el l?quido de transici?n (xilol). 7) sustituci?n del xilol por alcohol del 100%. 8) sustituci?n del alcohol por agua: utilizando concentraciones decrecientes. 9) tinci?n. Los colorantes m?s utilizados en todo el mundo (hematoxilina y eosina) son acuosos, por lo que es necesario "deshacer" los pasos. 10) deshidrataci?n de las secciones ya te?idas (concentraciones crecientes de alcoholes).

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11) sustituci?n del alcohol por el xilol. 12) montaje. en este momento se a?ade sobre la secci?n histol?gica un l?quido viscoso para

que la cubra (es el medio de montaje) y, a continuaci?n se coloca encima el cubreobjetos. El medio de montaje no es soluble en agua y tiene como virtud el permitir que la luz lo atraviese sin producir distorsiones en la imagen). Adem?s, en medio de montaje se solidifica en unas 24 horas, lo que permite almacenar durante much?simos a?os las preparaciones histol?gicas. El portaobjetos ya est? listo para colocarlo en la platina del microscopio.

3. Procesamiento de muestras para microscop?a electr?nica de transmisi?n

Para poder observar una muestra a trav?s del microscopio electr?nico de transmisi?n debe procederse de su inclusi?n mediante una serie de pasos superponibles a los que acabamos de ver para la microscop?a ?ptica. De entrada existe una diferencia con el tama?o de la muestra, que debe ser muy peque?a (menos de 1 mm3). B?sicamente los pasos a seguir son los siguientes:

1) fijaci?n. 2) lavado de la muestra: con un tamp?n isosmolar fosfato o cacodilato (0.1M, pH 7,4) para

retirar el fijador. 3) postfijaci?n: normalmente con tetra?xido de osmio. 4) lavado de la muestra: con el tamp?n isosmolar para retirar el postfijador. 5) deshidrataci?n: con alcoholes (o acetonas) de concentraci?n creciente. 6) durante el proceso de deshidrataci?n es frecuente a?adir sales de metales pesados que

aumentan el contraste al observar la muestra al microscopio. 7) sustituci?n del agente deshidratante por otro, denominado de transici?n (normalmente se

utiliza el ?xido de propileno) que a su vez es miscible en el medio de inclusi?n que proporcione a la muestra la necesaria dureza para poder ser seccionada. 8) inclusi?n de la muestra: en el medio que de proporcione dureza (normalmente se utilizan resinas de tipo epoxi (araldita, epon, etc). Ahora, esta sustancia sustituye al agua que estaba en las c?lulas y los tejidos. 9) secci?n de la muestra. Primeramente se hacen secciones semifinas (1m) para seleccionar el ?rea de estudio y despu?s se obtienen los cortes ultrafinos de unos 60-80 nm de grosor, que se depositan sobre una rejilla de unos 3 mm, que hace el papel los portaobjetos, donde se dejan hasta que se sequen. 10) "tinci?n". Realmente no es una tinci?n, pues se utilizan metales pesados (citrato de plomo) que impregnan espec?ficamente los elementos de la muestra. 11) lavado de la muestra con un tamp?n isosmolar para retirar el excedente del citrato de plomo.

Las rejillas, con las muestras, se introducen en el microscopio electr?nico. Los metales pesados que se han depositado sobre la muestra impiden que por esos puntos pasen m?s o menos electrones.

4. Obtenci?n de las muestras

En Medicina las muestras provienen de pacientes a los que se les extrae una porci?n de tejido que se denomina biopsia. Tambi?n proviene de material obtenido mediante el tratamiento quir?rgico (piezas quir?rgicas) y como no, procedente de personas fallecidas por alg?n tipo de enfermedad y en los que la familia autoriza la realizaci?n de la autopsia (autopsia cl?nica). Muchos de los estudios se

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llevan a cabo utilizando extensiones sobre portaobjetos de exudados, material aspirado o frotis, y que gen?ricamente se conocen con el nombre de citolog?as y/o de extensiones. La obtenci?n del material debe realizarse con sumo cuidado, procurando no deformar ni estropear el tejido: se utilizar? material adecuado y bien afilado.

La procedencia de las muestras determina en gran medida la "calidad" del material. Es muy importante que entre la obtenci?n de la muestra y su fijaci?n transcurra el menor tiempo posible para poder tener el mayor grado de parecido al estado "in vivo". A continuaci?n nos referiremos a los m?todos de estudio m?s utilizados en la pr?ctica diaria.

5. Etapas del procesamiento de las muestras. 5.1.-Fijaci?n.

Se denomina fijaci?n a los procedimientos utilizados para suspender las actividades celulares que eviten la descomposici?n postmorten (autolisis).

Los objetivos b?sicos de la fijaci?n son:

1) prevenir los fen?menos de autolisis y ataque bacteriano. 2) lograr que los tejidos o c?lulas sean lo m?s parecido posible al estado vivo y que,

idealmente, las peque?as mol?culas no se pierdan. 3) evitar que se produzcan cambios en el aspecto o volumen del material durante los

procesos subsecuentes. 4) permitir la claridad de tinci?n de las estructuras.

Aunque los efectos conservantes de algunas sustancias, tales como el mercurio y sus sales, ya se conoc?an desde la ?poca de Hip?crates, no ha sido hasta mediado el siglo diecinueve cuando se comenz? de forma sistem?tica su investigaci?n. Gracias al desarrollo industrial y al incremento de nuestros conocimientos de qu?mico-f?sica se ha producido un importante avance en el conocimiento de nuevas sustancias y de su mecanismo de acci?n. Las t?cnicas de fijaci?n podemos dividirlas en f?sicas y qu?micas.

5.1.1-T?cnicas f?sicas

Son muy accesibles y nos permiten evitar los posibles artefactos que pudiera provocar la adici?n de distintas sustancias al esp?cimen a estudiar. No obstante, no conservan la morfolog?a fina adecuadamente. Son de gran utilidad en los trabajos de rutina para citolog?a y en los estudios de histoqu?mica y citoqu?mica.

Dentro de este grupo destacaremos:

1) la desecaci?n. Consiste en dejar al aire el esp?cimen a estudiar, logr?ndose la evaporizaci?n del agua. No tiene pr?cticamente utilidad en el estudio de tejidos, puesto que antes de que la pieza se haya desecado totalmente ya han comenzado los procesos de autolisis. Es muy ?til en citolog?a, puesto que aunque las c?lulas pierden detalles de 3

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su estructura fina, esta desventaja es contrarrestada por su facilidad y bajo costo. 2) la congelaci?n. Esta t?cnica se basa en el sometimiento del esp?cimen a estudiar a

temperaturas inferiores a cero grados. Se utiliza como m?todo de rutina en las biopsias intraoperatorias debido a su rapidez. Para estudios histoqu?micos, donde es necesario conservar la actividad enzim?tica, la congelaci?n se suele realizar en nitr?geno l?quido a unos 179?C bajo cero. El mayor inconveniente es la menor calidad en la estructura y en los detalles celulares, as? como el riesgo de que se formen cristales de hielo que originen artefactos en el esp?cimen. Despu?s de la congelaci?n las muestras se seccionan directamente (sin otro paso intermedio) y se ti?en (ver m?s abajo).

5.1.2.-T?cnicas qu?micas

Se basan en la utilizaci?n de sustancias qu?micas capaces de reaccionar con los componentes celulares y evitar su degradaci?n. A pesar de existir numerosos fijadores, los m?s utilizados ejercen su efecto reaccionando con las prote?nas: coagulan o precipitan las prote?nas. Lo m?s habitual es sumergir las muestras en el l?quido fijador (fijaci?n por inmersi?n), pero en determinadas ocasiones (en investigaci?n normalmente) las soluciones del fijador pueden introducirse por el sistema vascular del animal de experimentaci?n (fijaci?n por perfusi?n), lo que garantiza una mejor fijaci?n. Existen numerosos compuestos que en mayor o menor medida cumplen este requisito y que de forma esquem?tica podemos resumir en unos pocos grupos. de sustancias:

1) aldeh?dos (formaldeh?do, glutaraldeh?do, acrole?na, etc.). Establecen puentes entre mol?culas proteicas en un tiempo relativamente corto. Son ampliamente utilizados: de hecho el formaldehido es el fijador por excelencia en microscop?a ?ptica, y el glutaraldehido lo es en microscop?a electr?nica. Sin embargo, la preservaci?n de la estructura morfol?gica no es completa y, adem?s, impiden o dificultan numerosas reacciones citoqu?micas.

2) agentes oxidantes (tetra?xido de osmio, permanganato pot?sico, dicromato pot?sico, etc.). Este grupo de fijadores reacciona con prote?nas y con l?pidos, no conoci?ndose con exactitud su mecanismo de acci?n. El tetra?xido de osmio se utiliza de rutina como postfijador despu?s del glutaraldehido en microscop?a electr?nica convencional (de transmisi?n y de barrido).

3) agentes desnaturalizantes de prote?nas (alcohol et?lico, alcohol met?lico, ?cido ac?tico, etc.). Conservan de modo aceptable las prote?nas, pero arrastran los l?pidos durante la fijaci?n. Su uso es bastante restringido. No obstante, su utilizaci?n es habitual en el proceso de deshidrataci?n subsiguiente a la fijaci?n.

4) agentes de mecanismo desconocido (?cido p?crico, cloruro de mercurio). Tienen una utilidad muy restringida.

5) mezclas fijadoras Los m?s populares son el l?quido de Bouin (soluci?n acuosa saturada de ?cido p?crico + formol al 25% y ?cido ac?tico glacuial al 5%) para microscop?a ?ptica y la soluci?n de Karnovsky (formaldehido al 2% y glutaraldehido al 1-2%) para microscop?a electr?nica.

5.2.-Deshidrataci?n.

La deshidrataci?n pretende sustituir toda el agua existen el los tejidos por alcoholes. Se procura hacerlo de la forma m?s delicada posible, para evitar artefactos en la muestra, por lo que se utilizan concentraciones crecientes de alcoholes.

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